تلطيخ ثلاثي الأبعاد للكلى بالكامل مع CUBIC
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة إزالة الأنسجة وتلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل لتصوير الكلى ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن أن تقدم هذه التقنية وجهات نظر عيانية في أمراض الكلى ، مما يؤدي إلى اكتشافات بيولوجية جديدة.
Abstract
على الرغم من أن علم الأمراض التقليدي قدم العديد من المعلومات حول البنية المجهرية للكلى ، إلا أنه كان من الصعب معرفة التركيب الدقيق للأوعية الدموية ، والأنابيب القريبة ، وقنوات التجميع ، والكبيبات ، والأعصاب الودية في الكلى بسبب نقص المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). المقاصة البصرية هي استراتيجية جيدة للتغلب على هذه العقبة الكبيرة. يمكن تحليل خلايا متعددة في عضو كامل بدقة خلية واحدة من خلال الجمع بين إزالة الأنسجة وتقنية التصوير 3D. ومع ذلك ، لا تزال طرق وضع العلامات الخلوية لتصوير الأعضاء بأكملها متخلفة. على وجه الخصوص ، يمثل تلطيخ الأعضاء بالكامل تحديا بسبب صعوبة اختراق الأجسام المضادة. طور البروتوكول الحالي تلطيخ كلى فأر كامل التركيب للتصوير 3D باستخدام طريقة إزالة الأنسجة CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة دون عائق والتحليل الحسابي). وقد مكن البروتوكول من تصور إزالة التعصيب الكلوي الودي بعد إصابة نقص التروية وتضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري من وجهة نظر شاملة. وبالتالي ، يمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى اكتشافات جديدة في أبحاث الكلى من خلال توفير منظور عياني.
Introduction
تتكون الكلية من مجموعات خلايا مختلفة. على الرغم من أن علم الأمراض التقليدي يعطينا الكثير من المعلومات حول البيئة المكروية للكلى ، إلا أن هناك حاجة إلى التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) لفهم الحديث المتبادل بين الخلايا بدقة أثناء تطور مرض الكلى. في الماضي ، كان هناك حاجة إلى إجراء عدد كبير من التقسيم التسلسلي وإعادة بناء الصورة لتصوير 3D للجهاز بالكامل1. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تتطلب الكثير من الجهد ولديها مشاكل من حيث التكاثر.
المقاصة البصرية هي استراتيجية جيدة للتغلب على هذه العقبة 2,3. يرجع عتامة الأنسجة بشكل أساسي إلى تشتت الضوء وامتصاصه لأن كل عضو يتكون من مواد مختلفة ، بما في ذلك الماء والبروتين والدهون. وبالتالي ، فإن الاستراتيجية الأساسية لإزالة الأنسجة هي استبدال الماء والدهون في الأنسجة بكواشف مطابقة لمعامل الانكسار (RI) لها نفس الخصائص البصرية مثل البروتينات4. من أجل مراقبة عينة شفافة ، فإن الفحص المجهري الفلوري للورقة الضوئية مفيد5. تضيء صفائح الضوء العينة الشفافة من الجانب ، ويتم الحصول على إشارات الإثارة من خلال العدسة الموضوعية الموجودة في وضع رأسي6. يحصل هذا الفحص المجهري على معلومات المقطع العرضي في عملية مسح واحدة ، والتي تختلف عن الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر أو متعدد الفوتونات. وبالتالي ، يمكنه الحصول بسرعة على صور z-stack بمستوى منخفض من التبييض الضوئي.
تعد كوكتيلات التصوير الواضحة وغير المعوقة للدماغ / الجسم والتحليل الحسابي (CUBIC) إحدى طرق إزالة الأنسجة التي تتيح تصوير الأعضاء بالكامل بواسطة الفحص المجهري الفلوريللصفائح الضوئية 2،7،8. تم تحسين تلطيخ CUBIC و Cycl-mount المناعي بالكامل في الدراسة الحالية لتصور هياكل 3D لكلية الفأر9،10،11. باستخدام طريقة التلوين الكاملة هذه ، يتم تصور التغيير في الأعصاب الودية الكلوية بعد إصابة نقص التروية 9،10 وتضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري11 ، وكذلك الأوعية الدموية والأنابيب القريبة والقنوات المجمعة في الكلى الكاملة9.
Protocol
Representative Results
Discussion
سمح البروتوكول الحالي بتصوير 3D للكلى بالكامل لهياكل مختلفة مثل الأعصاب الودية ، وجمع القنوات ، والشرايين ، والأنابيب القريبة ، والكبيبات9،10،11. قدمت طريقة التلوين هذه ملاحظة عيانية وأدت إلى اكتشافات بيولوجية جديدة ، من خلال تصور التغيير …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تنفيذ جزء من هذا العمل من خلال التعاون مع البروفيسور هيروكي ر. أويدا (جامعة طوكيو) ، والبروفيسور إيتسو أ. سوساكي (جامعة جونتيندو) ، والبروفيسور تيتسوهيرو تاناكا (جامعة توهوكو) ، والبروفيسور ماسافومي فوكاغاوا ، والدكتور تاكيهيكو وادا ، والدكتور هيروتاكا كومابا (جامعة توكاي).
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
