Summary

CUBIC 전체 신장 3차원 염색

Published: July 18, 2022
doi:

Summary

본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.

Abstract

기존의 병리학은 신장 미세 구조에 대한 많은 정보를 제공했지만 3차원(3D) 정보가 부족하여 신장의 혈관, 근위 세뇨관, 수집 관, 사구체 및 교감 신경의 정확한 구조를 알기가 어려웠습니다. 광학 클리어링은 이 큰 장애물을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 전체 장기의 여러 세포는 조직 투명화와 3D 이미징 기술을 결합하여 단일 세포 분해능으로 분석할 수 있습니다. 그러나 전체 장기 이미징을위한 세포 표지 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 특히, 전체 장착 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 본 프로토콜은 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌 / 신체 이미징 칵테일 및 전산 분석) 조직 투명화 방법을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 마우스 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜은 포괄적 인 관점에서 당뇨병 성 신장 질환의 초기 단계에서 허혈 재관류 손상 및 사구체 비대 후 신장 교감 신경 탈신경을 시각화 할 수있게했습니다. 따라서이 기술은 거시적 관점을 제공함으로써 신장 연구에서 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.

Introduction

신장은 다양한 세포 집단으로 구성됩니다. 기존의 병리학은 신장 미세 환경에 대한 많은 정보를 제공하지만 신장 질환 진행 중 세포 간 누화를 정확하게 이해하려면 3차원(3D) 영상이 필요합니다. 과거에는 전체 장기 3D 이미징1을 위해 수많은 연속 절단 및 이미지 재구성을 수행해야 했습니다. 그러나이 방법은 너무 많은 노력이 필요하고 재현성 측면에서 문제가있었습니다.

광학 클리어링은 이 장애물 2,3을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 조직 불투명도는 각 기관이 물, 단백질 및 지질을 포함한 다양한 물질로 구성되어 있기 때문에 주로 광산란 및 흡수로 인한 것입니다. 따라서 조직 청소의 기본 전략은 조직의 물과 지질을 단백질4와 동일한 광학적 특성을 갖는 굴절률(RI) 일치 시약으로 대체하는 것입니다. 투명한 시편을 관찰하기 위해서는, 라이트 시트 형광 현미경이 유용하다5. 라이트 시트는 측면에서 투명한 시편을 비추고 여기 신호는 수직 위치6에 위치한 대물 렌즈를 통해 획득됩니다. 이 현미경은 단일 스윕으로 단면 정보를 얻으며, 이는 컨포칼 또는 다광자 형광 현미경과 다릅니다. 따라서 낮은 수준의 광퇴색으로 z 스택 이미지를 빠르게 획득할 수 있습니다.

투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 영상 칵테일 및 전산 분석(CUBIC)은 광학 시트 형광 현미경 2,7,8로 전체 장기 이미징을 가능하게 하는 조직 투명화 방법 중 하나입니다. CUBIC 및 전체 장착 면역형광 염색은 마우스 신장 3D 구조 9,10,11을 시각화하기 위해 본 연구에서 최적화되었습니다. 이 전체 장착 염색 방법을 사용하여 허혈 재관류 손상 9,10 및 당뇨병 성 신장 질환 11의 초기 단계의 사구체 비대뿐만 아니라 혈관, 근위 세뇨관 및 전체 신장 9의 수집 덕트 후에 신장 교감 신경의 변화를 시각화합니다.

Protocol

모든 실험은 도쿄 대학 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6NJcl 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 1. 동물 준비 및 신장 고정 아래 단계에 따라 관류 고정을 수행하십시오.이소플루란(3%, 2.0L/min)을 흡…

Representative Results

이 염색 방법을 사용하여 전체 신장 (그림 4A, B 및 비디오 1)의 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체] 및 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체]을 시각화했습니다9. 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 / 재관류 손상 (IRI) 9,10 후에 시각화되었습니다 (그림 4C)….

Discussion

본 프로토콜은 교감 신경, 수집 관, 동맥, 근위 세뇨관 및 사구체 9,10,11과 같은 다양한 구조의 전체 신장 3D 이미징을 허용했습니다. 이 염색 방법은 거시적 관찰을 제공하고 허혈 재관류 손상 9,10 후 신장 교감 신경의 변화와 당뇨병 신장 질환 11의 초기 단계에서 사구체 비대를 시각?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구의 일부는 우에다 히로키 교수(도쿄대학), 스사키 에츠오 A. 교수(준텐도 대학), 다나카 테츠히로 교수(도호쿠 대학), 후카가와 마사후미 교수, 와다 타케히코 박사, 고마바 히로타카 박사(도카이 대학)와의 협력을 통해 수행되었습니다.

Materials

14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube Falcon 352059 Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine Tokyo Chemical Industry D1876 CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution Nacalai Tesque 16223-55 Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution Nacalai Tesque 09154-85 Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody Invitrogen A-21436 Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody Invitrogen A-31573 Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody Abcam ab199975 Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody Sigma-Aldrich P0372 Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody Abcam ab85626 Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody Abcam ab113 Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody Abcam ab5694 Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS Thermo Fisher Scientific 37528 Staining buffer
Butorphanol Tartrate Meiji 005526 Anesthetic
C57BL/6NJcl Nippon Bio-Supp.Center N/A Mouse strain
Imaris Bitplane N/A Imaging analysis software
Macro-zoom microscope OLYMPUS MVX10 The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride Kyoritsu-Seiyaku 008656 Anesthetic
Midazolam SANDOZ 27803229 Anesthetic
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 Immersion oil
N-buthyldiethanolamine Tokyo Chemical Industry B0725 CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide Tokyo Chemical Industry N0078 CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 Nacalai Tesque 12967-45 CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4 Shin-Etsu Chemical 50449832 Immersion oil
Sodium azide Wako 195-11092 Staining buffer

References

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Cite This Article
Hasegawa, S., Nangaku, M. Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC. J. Vis. Exp. (185), e63986, doi:10.3791/63986 (2022).

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