본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.
기존의 병리학은 신장 미세 구조에 대한 많은 정보를 제공했지만 3차원(3D) 정보가 부족하여 신장의 혈관, 근위 세뇨관, 수집 관, 사구체 및 교감 신경의 정확한 구조를 알기가 어려웠습니다. 광학 클리어링은 이 큰 장애물을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 전체 장기의 여러 세포는 조직 투명화와 3D 이미징 기술을 결합하여 단일 세포 분해능으로 분석할 수 있습니다. 그러나 전체 장기 이미징을위한 세포 표지 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 특히, 전체 장착 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 본 프로토콜은 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌 / 신체 이미징 칵테일 및 전산 분석) 조직 투명화 방법을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 마우스 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜은 포괄적 인 관점에서 당뇨병 성 신장 질환의 초기 단계에서 허혈 재관류 손상 및 사구체 비대 후 신장 교감 신경 탈신경을 시각화 할 수있게했습니다. 따라서이 기술은 거시적 관점을 제공함으로써 신장 연구에서 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.
신장은 다양한 세포 집단으로 구성됩니다. 기존의 병리학은 신장 미세 환경에 대한 많은 정보를 제공하지만 신장 질환 진행 중 세포 간 누화를 정확하게 이해하려면 3차원(3D) 영상이 필요합니다. 과거에는 전체 장기 3D 이미징1을 위해 수많은 연속 절단 및 이미지 재구성을 수행해야 했습니다. 그러나이 방법은 너무 많은 노력이 필요하고 재현성 측면에서 문제가있었습니다.
광학 클리어링은 이 장애물 2,3을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 조직 불투명도는 각 기관이 물, 단백질 및 지질을 포함한 다양한 물질로 구성되어 있기 때문에 주로 광산란 및 흡수로 인한 것입니다. 따라서 조직 청소의 기본 전략은 조직의 물과 지질을 단백질4와 동일한 광학적 특성을 갖는 굴절률(RI) 일치 시약으로 대체하는 것입니다. 투명한 시편을 관찰하기 위해서는, 라이트 시트 형광 현미경이 유용하다5. 라이트 시트는 측면에서 투명한 시편을 비추고 여기 신호는 수직 위치6에 위치한 대물 렌즈를 통해 획득됩니다. 이 현미경은 단일 스윕으로 단면 정보를 얻으며, 이는 컨포칼 또는 다광자 형광 현미경과 다릅니다. 따라서 낮은 수준의 광퇴색으로 z 스택 이미지를 빠르게 획득할 수 있습니다.
투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 영상 칵테일 및 전산 분석(CUBIC)은 광학 시트 형광 현미경 2,7,8로 전체 장기 이미징을 가능하게 하는 조직 투명화 방법 중 하나입니다. CUBIC 및 전체 장착 면역형광 염색은 마우스 신장 3D 구조 9,10,11을 시각화하기 위해 본 연구에서 최적화되었습니다. 이 전체 장착 염색 방법을 사용하여 허혈 재관류 손상 9,10 및 당뇨병 성 신장 질환 11의 초기 단계의 사구체 비대뿐만 아니라 혈관, 근위 세뇨관 및 전체 신장 9의 수집 덕트 후에 신장 교감 신경의 변화를 시각화합니다.
본 프로토콜은 교감 신경, 수집 관, 동맥, 근위 세뇨관 및 사구체 9,10,11과 같은 다양한 구조의 전체 신장 3D 이미징을 허용했습니다. 이 염색 방법은 거시적 관찰을 제공하고 허혈 재관류 손상 9,10 후 신장 교감 신경의 변화와 당뇨병 신장 질환 11의 초기 단계에서 사구체 비대를 시각?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구의 일부는 우에다 히로키 교수(도쿄대학), 스사키 에츠오 A. 교수(준텐도 대학), 다나카 테츠히로 교수(도호쿠 대학), 후카가와 마사후미 교수, 와다 타케히코 박사, 고마바 히로타카 박사(도카이 대학)와의 협력을 통해 수행되었습니다.
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |