Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l’imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.
Abstract
Sebbene la patologia convenzionale fornisse numerose informazioni sulla microstruttura renale, era difficile conoscere la struttura precisa dei vasi sanguigni, dei tubuli prossimali, dei dotti collettivi, dei glomeruli e dei nervi simpatici nel rene a causa della mancanza di informazioni tridimensionali (3D). La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo grande ostacolo. Più cellule in un intero organo possono essere analizzate alla risoluzione di una singola cellula combinando la pulizia dei tessuti e la tecnica di imaging 3D. Tuttavia, i metodi di etichettatura cellulare per l’imaging dell’intero organo rimangono sottosviluppati. In particolare, la colorazione dell’intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Il presente protocollo ha sviluppato una colorazione renale di topo a montaggio intero per l’imaging 3D con il metodo di pulizia dei tessuti CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Il protocollo ha permesso di visualizzare la denervazione simpatica renale dopo danno da ischemia-riperfusione e glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica da un punto di vista completo. Pertanto, questa tecnica può portare a nuove scoperte nella ricerca sui reni fornendo una prospettiva macroscopica.
Introduction
Il rene è composto da varie popolazioni cellulari. Sebbene la patologia convenzionale ci fornisca molte informazioni sul microambiente renale, è necessaria l’imaging tridimensionale (3D) per comprendere con precisione la diafonia intercellulare durante la progressione della malattia renale. In passato, era necessario eseguire un numero enorme di sezionamenti seriali e ricostruzione delle immagini per l’imaging 3D dell’intero organo1. Tuttavia, questo metodo richiedeva troppo sforzo e presentava problemi in termini di riproducibilità.
La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo ostacolo 2,3. L’opacità tissutale è dovuta principalmente alla diffusione e all’assorbimento della luce perché ogni organo è costituito da varie sostanze, tra cui acqua, proteine e lipidi. Pertanto, la strategia di base della pulizia dei tessuti consiste nel sostituire l’acqua e i lipidi nei tessuti con reagenti corrispondenti all’indice di rifrazione (RI) che hanno le stesse proprietà ottiche delle proteine4. Per osservare un campione trasparente, è utile una microscopia fluorescente a foglio di luce5. I fogli luminosi illuminano il campione trasparente dal lato e i segnali di eccitazione vengono acquisiti attraverso la lente dell’obiettivo situata in posizione verticale6. Questa microscopia ottiene informazioni di sezione trasversale in un singolo sweep, che è diverso dalla microscopia fluorescente confocale o multifotone. Pertanto, può acquisire rapidamente immagini z-stack con un basso livello di photobleaching.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) è uno dei metodi di pulizia dei tessuti che consente l’imaging dell’intero organo mediante microscopia fluorescente a foglio luminoso 2,7,8. La colorazione immunofluorescente CUBIC e a montaggio intero è ottimizzata nel presente studio per visualizzare le strutture 3D del rene di topo 9,10,11. Utilizzando questo metodo di colorazione a montaggio intero, l’alterazione dei nervi simpatici renali viene visualizzata dopo il danno da ischemia-riperfusione 9,10 e la glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica 11, così come i vasi sanguigni, i tubuli prossimali e i dotti collettori in un rene intero9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo ha permesso l’imaging 3D dell’intero rene di varie strutture come nervi simpatici, dotti collettivi, arterie, tubuli prossimali e glomeruli 9,10,11. Questo metodo di colorazione ha offerto un’osservazione macroscopica e ha portato a nuove scoperte biologiche, visualizzando l’alterazione dei nervi simpatici renali dopo danno da ischemia-riperfusione 9,10 e glomerulomegalia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parte di questo lavoro è stato condotto attraverso la collaborazione con il Prof. Hiroki R. Ueda (Università di Tokyo), il Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), il Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), il Prof. Masafumi Fukagawa, il Dr. Takehiko Wada e il Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
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