Summary
髄鞘形成を視覚化することは、神経系を研究する多くの研究者にとって重要な目標です。CARSは、ミエリンなどの特殊な構造を照らす脳などの組織内の脂質をネイティブにイメージングできる免疫蛍光法に対応した技術です。
Abstract
コヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)は、分子の特徴的な振動のコヒーレント信号を生成するために化学者や物理学者によって古典的に採用されている技術です。ただし、これらの振動特性は、脳などの解剖学的組織内の分子にも特徴的であり、神経科学アプリケーションにますます有用で適用可能になっています。たとえば、CARSは、これらの分子内の化学結合を特異的に励起することによって脂質を測定でき、神経伝達に関与するミエリンなど、組織のさまざまな側面を定量化できます。さらに、ミエリンの定量に通常使用される他の技術と比較して、CARSは免疫蛍光技術と互換性があるように設定することもでき、ナトリウムチャネルやシナプス伝達の他の成分などの他のマーカーとの共標識を可能にします。髄鞘形成の変化は、多発性硬化症などの脱髄疾患、または脆弱X症候群や自閉症スペクトラム障害などの他の神経学的状態において本質的に重要なメカニズムであり、新たな研究分野です。結論として、CARSは革新的な方法で神経科学の差し迫った質問に答え、多くの異なる神経学的状態に関連する根本的なメカニズムの証拠を提供することができます。
Introduction
活動電位は脳内の情報の基本単位であり、軸索を介した活動電位の伝播は情報処理の1つの柱を形成します1,2,3。ニューロンは、典型的には、複数の他のニューロンから求心性入力を受け取り、所与の狭い時間窓内でこれらの入力を統合する4,5。したがって、軸索における潜在的な伝播のメカニズムは、研究者からかなりの注目を集めています。
軸索を伝播する場合、活動電位は軸索に沿って繰り返し再生され、信頼性の高い伝播が保証されます6。顎脊椎動物(グナトストーム)のほとんどのニューロンでは、軸索は、グリア細胞の一種である近くの希突起膠細胞またはシュワン細胞によって産生される脂質が豊富な物質であるミエリンの鞘に囲まれています(7,8でレビュー)。このミエリン鞘は軸索を電気的に絶縁し、その静電容量を低減し、活動電位の伝播を効率的、迅速、そしてより低いエネルギー消費で可能にする。ミエリンは軸索を均一に覆うわけではありませんが、Ranvierの節と呼ばれる、それらの間に短いギャップがあるセグメントで軸索を覆います(9,10でレビュー)。軸索の電気的絶縁レベルを制御する髄鞘形成の厚さと、軸索に沿って活動電位が再生される頻度を制御するランビエの節の間隔の両方が、活動電位伝播の速度に影響を与えます(11でレビュー)。
髄鞘形成の厚さが軸索12,13,14の活動電位伝播速度に影響を与えることを示唆する文献が多数ある。さらに、軸索髄鞘形成の変化は、多数のCNS欠損をもたらし得る15、16、17、18、19、20、21。したがって、多くの研究努力の焦点が軸索髄鞘形成の測定と特性評価を含むことは驚くべきことではありません。ミエリンの厚さの測定は、電子顕微鏡で最も一般的に行われてきましたが、これは大量の組織調製を必要とし、免疫組織化学と組み合わせて使用するのが難しい技術です。ただし、コヒーレントアンチストークスラマン分光法(CARS)に基づく軸索髄鞘形成を測定するためのより高速で簡単な技術もあります。CARSレーザは、様々な周波数に同調することができ、脂質を励起するのに適した周波数に同調すると、追加の標識22を必要とせずにミエリンを画像化することができる。脂質画像化は、脂質をいくつかの蛍光チャネル23と共に画像化することができるように、標準的な免疫組織化学と組み合わせることができる。CARSによる髄鞘形成のイメージングは、電子顕微鏡法よりも有意に高速であり、EMよりも低いものの、同じタイプの軸索における髄鞘形成のわずかな違いを検出するのに十分な分解能を有する。
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Protocol
すべての実験は、適用されるすべての法律、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、コロラド大学アンシュッツ施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.動物
- ジャクソン研究所から入手したC57BL/6J(ストック#000664)マウス(Mus musculus )またはチャールズリバーから入手したモンゴルスナネズミ(Meriones unguiculatus)を使用してください。
2.ティッシュの準備
- 経心灌流の場合、対象となるげっ歯類種にペントバルビタール(体重120 mg / kg体重)を過剰摂取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.76 mM KH 2 PO 4、10 mM Na2HPO4)とそれに続く4%パラホルムアルデヒド(PFA)24)を過剰に投与します。
- 具体的には、ハサミを使って腹部と胸郭を開き、ケリー止血鉗子で胸郭を所定の位置に保持して心臓を露出させます。
- 灌流ポンプに接続された23GA針を左心室に挿入し、細かいハサミを使用して右心房をすばやく切断します。
- 灌流ポンプと心臓の針を通してPBSを10分間投与し、脳と体の血液を取り除きます。
- 灌流ポンプを4%PFAに10分間切り替え、手足と尾の剛性をチェックして灌流が成功したことを確認します。
- 灌流後、動物を斬首し、頭蓋骨から脳を取り除きます。PBSに移す前に、脳を4%PFAで一晩保管してください。脳幹を4%アガロース(PBS中)に埋め込み、厚さ200μmのビブラトームを使用して冠状にスライスします。
3.染色
- Nisslの染色フリー浮遊切片を、細胞体を可視化するために(1:100)、抗体培地(AB培地:0.1 Mリン酸緩衝液(PB:50 mM KH2PO4、150 mM Na2HPO4)、150 mM NaCl、3 mM Triton-X、1%ウシ血清アルブミン(BSA))で、標準的なラボ用シェーカー25で室温で30分間。
- アルミホイルやカバーを使用して、セクションを光から保護します。550nm以下の波長はCARSイメージングと互換性があります(図1)。
注:Triton-Xまたは他の試薬が脂質のCARSイメージングに影響を与えるとは予想していませんが、特定の抗体培地による追加のコントロールが必要になる場合があります。
- アルミホイルやカバーを使用して、セクションを光から保護します。550nm以下の波長はCARSイメージングと互換性があります(図1)。
- 一時停止ポイント:イメージングするまで、フリーフローティングセクション(光から保護されている間)をPBSに保存します。切片化したら、2週間以内に脳切片を画像化します。
図1:CARSイメージングは免疫蛍光イメージングと組み合わせることができます。 グラフは、CARSイメージングが660/640nmの赤色信号スペクトル26で発生することを示しています。この波長は、緑、青、またはUV範囲から十分に離れているため、CARSシグナルとこれらの範囲の免疫蛍光を組み合わせることができます。具体的には、このグラフは、この出版物の代表的な結果の収集中にCARSと組み合わされた青色蛍光色素でタグ付けされたNisslの励起と発光も示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. イメージング
注:CARSレーザーのセットアップには、80 MHzクロックを提供するファイバーレーザーと、CARS信号の収集に必要なストークスビームが1031 nmに固定された770〜990 nmの調整可能な範囲のOPO(光パラメトリック発振器)レーザーが含まれています。両方のビームに1つの開口部があります。
- サンプルを顕微鏡に持ち込む前に、CARSレーザーの電源を入れて少なくとも1時間ウォームアップし、CARSレーザーを合わせ、ケーラーをコンデンサー光学系と顕微鏡のダイアフラムを前方CARSイメージング用に合わせます。
注:この手順は、CARS顕微鏡が適切に機能するために重要です。- 2つのレーザービーム(ポンプとストークス)の空間アライメントについては、CARSレーザーGUIを介して2つの内部PSD(位置検出検出器)にアクセスします。
- CARSレーザーGUIの遅延機能を使用して時間的アライメントを実現し、波長が異なるために分散が異なる2つのレーザー(ポンプとストークス)のパルスをオーバーラップするのに役立ちます。したがって、ポンプビームとストークスビームの時間的および空間的なオーバーラップは、GUIを介したユーザー入力で行われます。
- 外部潜望鏡(セットアップの最後の2つのミラー)を調整して、空間的に重なった2つのレーザーを顕微鏡のスキャンヘッドミラーの中央に配置します。
- 最良の前方CARS非デススキャン検出を行うには、コンデンサーがケーラーであることを確認してください(つまり、コンデンサーが中央に配置され、ダイアフラムに焦点を合わせて均一な照明を実現します)
- 免疫蛍光共焦点イメージングとCARSイメージングには、蛍光イメージング用の可視レーザーを備えた共焦点顕微鏡を組み込んで、前方およびエピCARSノンデススキャン検出器(NDD)の両方を備えたCARSレーザーを装着します(図2)。
- カバーガラス(倒立顕微鏡用)、組織が乾燥しないようにPBS、および組織をカバーガラスの近くに保つためのガラス重りを備えた培養皿に切片を置きます。
- 台形体の内側核(MNTB)などの脳領域をイメージングするために、エピ方向のCARS信号の収集と順方向の0.55NAコンデンサーを介した60倍、1.2NAの赤外線補正水対物レンズを使用してzスタックまたは単一の画像を取得します。
- CARSレーザーGUIを使用して、約600mWのポンプ/プローブと300mWのストークスでCARS画像を撮影します。これらのレーザー出力値は、システムによって内部的に測定されます。サンプル位置での両レーザーの出力は25mW未満で、組織サンプルに対して安全です。
- ポンプとストークスビームを空間的および時間的に重ね合わせます。OPO を 797.2 nm に調整します。これにより、650nmのCARS波長が得られます。エネルギー準位が高いため、結果として基底状態に戻るのは、励起に対する反ストークス(青シフト)です。
- バンドパスフィルター(640-680 nm)を使用して、エピまたはフォワードノンデススキャン検出器でCARSシグナルをキャプチャし、免疫蛍光標識(この場合は蛍光標識されたNissl)を順次検出します。
注:NisslニューロンソーママーカーはCARS 640-680 nmバンドパスフィルターに捕捉されないため、以下に示す画像で蛍光とCARSイメージングを組み合わせることができます。 - CARSと蛍光はPMTを共有しません。 これらの設定を使用して、脳領域の髄鞘形成を選択的に画像化するための最適な脂質シグナルを取得します。
注意: レーザービームからユーザーを保護します
- 画像を.oibファイルとして保存し、画像解析プログラムにインポートしてさらに定量化することができます(図3)。
図2:CARSレーザー(赤い矢印)と非デススキャン(NDD)エピおよび前方検出をレーザースキャン共焦点に組み込んだCARS機器図。 フォワードNDDでは、515 nm(オレンジ色の矢印)のC-H結合(濃い赤の矢印)とSHG(第2高調波ジェネラシオイン)のCARSを取得します。エピNDDでは、C-H結合(暗赤色矢印)と2PE(2光子放出)自家蛍光(水色矢印)のCARSを取得します。順次、蛍光共焦点画像を取得することができます(可視レーザーの場合は緑色の矢印、共焦点検出の場合は青色の矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CARSは、脳組織(脳幹)のミエリン(マゼンタ)を照らすと同時に、Nissl(シアン)または蛍光マーカーをイメージングすることができます。2つのパネルは、モンゴルスナネズミ(単一の画像M. unguiculatus、図3A、C、E)とマウス(zスタック最大投影M.musculus、図2B、D、F)の脳からの代表的な結果を示しており、この手法が種を超えて使用できることを示しています。図3A、Bはシアンでニッスルを示し、C、DはマゼンタでCARS信号を示し、E、Fはスナネズミまたはマウスの各パネルでニッスル信号とCARS信号をそれぞれ組み合わせます。両方の画像セットは、脳幹の台形体(MNTB)の内側核のセクションを示しています。MNTBのニューロンは、巨大シナプスの一種であるHeldのyで終わる重度有髄軸索27からの入力を受け取ります。スケールバーは20μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
他の技術に対するCARS顕微鏡の最大の利点の1つは、蛍光イメージングとの互換性です23。 図1 は、免疫蛍光マーカーでタグ付けされたNisslと比較したCARSスペクトルを示しており、スペクトルの重複はほとんどまたはまったくありません。 図2 は、共焦点顕微鏡と組み合わせたCARS用のレーザーセットアップを示しています。 図3 は、細胞体(シアン)とミエリンシグナル(マゼンタ)の両方を示すCARSイメージングを使用して得られる可能性のある、スナネズミとマウスからの単一のスタックとzスタックの最大投影の2つの代表的な画像を示しています。
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Discussion
ますます多くの文献が脳機能におけるミエリンの役割を強調しています13,16,21,28。さらに、髄鞘形成の厚さと髄鞘形成パターンは、多発性硬化症(29でレビュー)、老化(30でレビュー)、自閉症20,31などのいくつかの神経学的状態で変化する可能性があることがわかっています。したがって、ますます多くの研究者が、脳組織および動物モデル全体、いくつかの病状、およびますます多くの実験状況で髄鞘形成を評価する必要があることは驚くべきことではありません。脳組織の髄鞘形成を画像化する従来の方法には、抗体標識とそれに続く光学顕微鏡法、および電子顕微鏡法(EM)が含まれます。どちらの技術も時間がかかり、組織組成のエラーや変化の可能性に関連する多段階の組織調製プロトコルが必要です。ミエリンをはるかに高速にイメージングできるため、同様の結果をはるかに迅速に得ることができ、追加の蛍光光学顕微鏡と組み合わせることができる代替方法を実証しました。重要なことに、この技術は、追加のマーカーやラベルを必要とせずに脳組織内の脂質を画像化するために使用できます。この技術は、無傷の軸索に沿ったミエリンの画像化を可能にするだけでなく、例えば多発性硬化症33において起こることが示されているプラークまたは液滴32などのミエリン分解産物の画像化を可能にする。
CARSレーザーが調整された周波数は、脂質を優先して画像を大幅に偏らせるのに適しており、ミエリンは脳内で群を抜いて最も一般的な脂質が豊富な物質であるため、髄鞘形成の全体的な高品質の画像をもたらしました。この技術の原理は、様々な周波数に同調することができるCARSレーザを、CH2結合を励起するのに適した周波数である792.2nm に同調させることである。これらは脂質に豊富に含まれており、末端に1つの末端カルボン酸基を持つ炭素-炭素結合によって結合されたCH2 基の長鎖が含まれています。この周波数で脂質を励起すると、標準的な共焦点顕微鏡検出技術で画像化できるシグナルが得られました。結果として得られる画像の品質は、人間の観察者または自動化されたアルゴリズムのいずれかによって行うことができる定量的分析をサポートする34。しかしながら、CH2 結合はミエリンに排他的ではないので、この方法はミエリンを排他的に標識するわけではなく、したがってCARSは抗体よりも特異的ではない。その結果、画像はミエリンに関連しないいくつかのラベルを示しています。重要なことに、このバックグラウンドラベルは、測定の品質や定量分析の能力を損なうことはありません。
CARSイメージングの分解能は回折が制限されており、2つの光子顕微鏡(~250 nm)に類似しているため、EMの分解能よりも低くなります。したがって、例えば特定の病状において起こる髄鞘形成の厚さの非常に小さな差を評価することを目指す研究者は、この制限を認識する必要がある。少量のサンプルにEMコントロールを追加すると、分解能が研究目的に十分であることを確認できます。
ミエリンのイメージングにおけるCARSの主な利点の1つは、速度と容易さに加えて、ラベルフリーの脂質イメージングと蛍光共焦点顕微鏡を組み合わせることができることです。CARSに使用される顕微鏡に応じて、ミエリンイメージングを抗体標識、Nissl染色、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス株などと組み合わせることができるように、2つまたは3つの追加チャネルをイメージングできます。より長い波長の蛍光色素を使用した場合の潜在的な制限は、主に、CARSシグナルが緑色および/または赤色の蛍光色素の発光を捕捉できる640〜680 nmのバンドパスフィルターを介して観察されるためです。ただし、CARS励起に使用されるピコ秒レーザーのピークパルスエネルギーは、2光子励起に使用される標準のフェムト秒レーザーよりも~10倍少なく、~100少ない蛍光に変換されます。さらに、CARS励起に使用される797.2 nmパルスピコ秒レーザーは、可視蛍光色素の2光子断面吸収のピークからスペクトル的に遠いです。したがって、CARSピコ秒レーザーは、可視蛍光色素の2光子励起に非常に非効率的であり、CARS検出に交差する蛍光シグナルはごくわずかです。ただし、これは、蛍光マーカーを含むサンプルと比較して、蛍光標識を持たない陰性対照サンプルを画像化することによってテストする必要があります。
結論として、CARSイメージングは、脳組織中のミエリンをイメージングするのに適した技術です。分解能は標準的な光学顕微鏡に匹敵するため、EMよりも劣りますが、速度と使いやすさにより、この技術は既存の方法に代わる魅力的な手法となっています。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
NIH R01 DC 17924、R01 DC 18401 (Klug)、NIH 1R15HD105231-01、T32DC012280、FRAXA (McCullagh) でサポートされています。CARSイメージングは、NIH P30 NS048154およびNIH P30 DK116073によって部分的にサポートされているコロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのニューロテクノロジーセンターの高度な光学顕微鏡コア部分で実行されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors - 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma - Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
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