Summary
Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.
Abstract
La espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) es una técnica empleada clásicamente por químicos y físicos para producir una señal coherente de vibraciones de firma de moléculas. Sin embargo, estas firmas vibratorias también son características de las moléculas dentro del tejido anatómico como el cerebro, lo que lo hace cada vez más útil y aplicable para aplicaciones de neurociencia. Por ejemplo, CARS puede medir los lípidos mediante enlaces químicos específicamente excitantes dentro de estas moléculas, lo que permite la cuantificación de diferentes aspectos del tejido, como la mielina involucrada en la neurotransmisión. Además, en comparación con otras técnicas típicamente utilizadas para cuantificar la mielina, CARS también se puede configurar para ser compatible con técnicas inmunofluorescentes, lo que permite el etiquetado conjunto con otros marcadores como canales de sodio u otros componentes de la transmisión sináptica. Los cambios en la mielinización son un mecanismo inherentemente importante en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple u otras afecciones neurológicas como el síndrome X frágil o los trastornos del espectro autista es un área emergente de investigación. En conclusión, CARS se puede utilizar de manera innovadora para responder preguntas apremiantes en neurociencia y proporcionar evidencia de mecanismos subyacentes relacionados con muchas afecciones neurológicas diferentes.
Introduction
Los potenciales de acción son la unidad básica de información en el cerebro, y la propagación del potencial de acción a través de los axones forma un pilar del procesamiento de la información 1,2,3. Las neuronas típicamente reciben entradas aferentes de múltiples otras neuronas e integran estas entradas dentro de una ventana de tiempo estrecha dada 4,5. Por lo tanto, los mecanismos de propagación potencial de los mecanismos de acción en los axones han recibido una cantidad significativa de atención por parte de los investigadores.
Cuando se propaga a través de un axón, un potencial de acción se regenera repetidamente a lo largo del axón para garantizar una propagación confiable6. En la mayoría de las neuronas de los vertebrados con mandíbula (gnatóstomos) los axones están rodeados por una vaina de mielina, que es una sustancia rica en lípidos producida por oligodendrocitos cercanos o células de Schwann, que son tipos de células gliales (revisado en 7,8). Esta vaina de mielina aísla eléctricamente el axón, reduciendo su capacitancia y permitiendo la propagación del potencial de acción de manera eficiente, rápida y con menor consumo de energía. La mielina no cubre el axón de manera uniforme, pero envuelve el axón en segmentos que tienen espacios cortos entre ellos, llamados ganglios de Ranvier (revisado en 9,10). Tanto el espesor de mielinización, que controla el nivel de aislamiento eléctrico de un axón, como el espaciamiento de los nodos de Ranvier, que controlan la frecuencia con la que se regeneran los potenciales de acción a lo largo de un axón, influyen en la velocidad de propagación del potencial de acción (revisado en11).
Existe una gran cantidad de literatura que sugiere que el espesor de la mielinización afecta la velocidad de propagación del potencial de acción en los axones12,13,14. Además, las alteraciones en la mielinización axónica pueden dar lugar a una serie de déficits del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Por lo tanto, no es sorprendente que el enfoque de muchos esfuerzos de investigación implique la medición y caracterización de la mielinización axónica. Las mediciones del grosor de la mielina se han realizado más comúnmente con microscopía electrónica, una técnica que requiere una cantidad significativa de preparación de tejido y es difícil de usar en combinación con inmunohistoquímica. Sin embargo, también existe una técnica más rápida y sencilla para medir la mielinización axónica que se basa en la espectroscopia Raman Coherente Anti-Stokes (CARS). Un láser CARS puede ser sintonizado a varias frecuencias y cuando se sintoniza a frecuencias que son adecuadas para excitar lípidos, la mielina puede ser fotografiada sin necesidad de etiquetas adicionales22. La imagen lipídica puede combinarse con inmunohistoquímica estándar, de modo que los lípidos pueden ser fotografiados junto con varios canales fluorescentes23. La mielinización por imágenes con CARS es significativamente más rápida que la microscopía electrónica y tiene una resolución que es, aunque más baja que EM, suficiente para detectar incluso pequeñas diferencias en la mielinización en el mismo tipo de axones.
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Protocol
Todos los experimentos cumplieron con todas las leyes aplicables, las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Anschutz.
1. Animales
- Utilice ratones C57BL / 6J (stock #000664) (Mus musculus) obtenidos del Laboratorio Jackson o jerbos mongoles (Meriones unguiculatus) obtenidos originalmente de Charles River.
2. Preparación del tejido
- Para la perfusión transcárdica, sobredosis de especies de roedores de interés con pentobarbital (120 mg/kg de peso corporal) y transcárdicamente perfundirlas con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) seguido de paraformaldehído (PFA) al4%24.
- Específicamente, abra el abdomen y la caja torácica con tijeras y mantenga la caja torácica en su lugar con pinzas hemostáticas Kelly para exponer el corazón.
- Inserte una aguja de 23 GA conectada a una bomba de perfusión en el ventrículo izquierdo y corte rápidamente la aurícula derecha con tijeras finas.
- Administre PBS a través de la bomba de perfusión y la aguja en el corazón durante 10 minutos para limpiar el cerebro y el cuerpo de sangre.
- Cambie la bomba de perfusión al 4% de PFA durante 10 minutos y verifique la rigidez de las extremidades y la cola para confirmar el éxito de la perfusión.
- Después de la perfusión, decapitar a los animales y extraer su cerebro del cráneo. Mantenga los cerebros durante la noche en 4% de PFA antes de transferirlos a PBS. Incrustar los troncos cerebrales en agarosa al 4% (en PBS) y cortar coronalmente usando un vibratomo a 200 μm de espesor.
3. Tinción
- Secciones flotantes libres de manchas para Nissl, para visualizar cuerpos celulares (1:100), en medios de anticuerpos (medios AB: tampón fosfato 0.1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, albúmina sérica bovina al 1% (BSA)) durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio estándar25.
- Proteja las secciones de la luz con papel de aluminio y/o una cubierta. Las longitudes de onda de 550 nm o menos son compatibles con las imágenes CARS (Figura 1).
NOTA: Si bien no esperamos que Triton-X u otros reactivos tengan un impacto en las imágenes CARS de lípidos, es posible que se justifiquen controles adicionales con medios de anticuerpos específicos.
- Proteja las secciones de la luz con papel de aluminio y/o una cubierta. Las longitudes de onda de 550 nm o menos son compatibles con las imágenes CARS (Figura 1).
- PUNTO DE PAUSA: Almacene secciones flotantes libres (mientras está protegido de la luz) en PBS hasta que se obtengan imágenes. Una vez seccionado, tome una imagen de las secciones cerebrales dentro de 2 semanas.
Figura 1: Las imágenes CARS se pueden combinar con imágenes inmunofluorescentes. Los gráficos muestran que las imágenes CARS ocurren en el espectro de señal roja de 660/640 nm26. Esta longitud de onda está lo suficientemente alejada del rango verde, azul o UV, lo que permite la combinación de la señal CARS con inmunofluorescencia en estos rangos. Específicamente, el gráfico también indica la excitación y emisión para Nissl marcado con fluoróforo azul, que se combinó con CARS durante la recopilación de resultados representativos para esta publicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Imágenes
NOTA: La configuración láser CARS contiene un láser de fibra que proporciona el reloj de 80 MHz y un láser OPO (oscilador paramétrico óptico) con un rango sintonizable de 770-990 nm con el haz de Stokes fijado a 1031 nm, que son necesarios para recoger la señal CARS. Hay una apertura para ambos haces.
- Antes de llevar muestras al microscopio, encienda y caliente el láser CARS durante al menos 1 hora, alinee el láser CARS y Koehler la óptica del condensador y el diafragma del microscopio para obtener imágenes CARS hacia adelante.
NOTA: Este paso es crítico para el correcto funcionamiento de la microscopía CARS.- Para la alineación espacial de los dos rayos láser (bomba y stokes), acceda a los dos PSD internos (detectores sensibles a la posición) a través de la GUI láser CARS.
- Logre la alineación temporal utilizando la función de retardo en la GUI láser CARS, que puede ayudar a superponer los pulsos de los dos láseres (bomba y stokes) que tienen diferentes dispersiones debido a sus diferentes longitudes de onda. Por lo tanto, tanto la superposición temporal como espacial de la bomba y los haces de stokes se realizan con la entrada del usuario a través de la GUI.
- Ajuste el periscopio externo (los dos últimos espejos de la configuración) para centrar los dos láseres superpuestos espacialmente en los espejos de la cabeza de escaneo del microscopio.
- Para una mejor detección directa de CARS no desescaneados, asegúrese de que el condensador sea Koehler (lo que significa que el condensador está centrado y enfocado en el diafragma para lograr una iluminación uniforme)
- Para imágenes confocales de inmunofluorescencia e imágenes CARS, ajuste el láser CARS, con detectores no escaneados (NDD) CARS directos y epi, incorporando un microscopio confocal equipado con láseres visibles para imágenes de fluorescencia (Figura 2).
- Coloque las secciones en una placa de cultivo con cubreobjetos (para microscopía invertida), PBS para evitar que el tejido se seque y un peso de vidrio para mantener el tejido cerca del cubreobjetos.
- Tome pilas z o imágenes individuales con un objetivo de agua corregido por infrarrojos de 60X, 1.2 NA, que sirve para la recolección de la señal CARS en la dirección epi y a través de un condensador de 0.55 NA en la dirección hacia adelante para obtener imágenes de áreas cerebrales como el núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB).
- Tome las imágenes de CARS a aproximadamente 600 mW de bomba/sonda y 300 mW de Stokes, utilizando la GUI láser de CARS. Estos valores de potencia láser son medidos internamente por el sistema. Las potencias de ambos láseres en la ubicación de la muestra son inferiores a 25 mW y seguras para la muestra de tejido.
- Superponga la bomba y las vigas de Stokes espacial y temporalmente. Sintoniza el OPO a 797,2 nm. Esto produce una longitud de onda CARS de 650 nm. Debido al mayor nivel de energía, el retorno resultante al estado fundamental es anti-Stokes (azul desplazado) a la excitación.
- Capture la señal CARS en detectores epi o reenvíen detectores no escaneados utilizando filtros de paso de banda (640-680 nm) seguidos de la detección secuencial de la etiqueta de inmunofluorescencia (en este caso Nissl marcado con fluorescencia).
NOTA: El marcador soma neuronal de Nissl no está atrapado en el filtro de paso de banda CARS 640-680 nm, lo que permite la combinación de fluorescencia e imágenes CARS en las imágenes que se presentan a continuación. - El CARS y la fluorescencia no comparten PMT. Utilice estos ajustes para obtener una señal lipídica óptima para obtener imágenes selectivas de la mielinización en el área del cerebro.
PRECAUCIÓN: Proteger al usuario del rayo láser
- Guarde las imágenes como archivos .oib, que se pueden importar a un programa de análisis de imágenes para su posterior cuantificación (Figura 3).
Figura 2: Diagrama del instrumento CARS que muestra los láseres CARS (flechas rojas) y la detección epi y frontal no escaneada (NDD) incorporada en un confocal de escaneo láser. En NDD hacia adelante adquirimos CARS para enlaces C-H (flechas rojas oscuras) y SHG (segunda generatioína armónica) a 515 nm (flecha naranja). En epi NDD, adquirimos CARS para enlaces C-H (flechas rojas oscuras) y autofluorescencia 2PE (emisión de dos fotones) (flecha azul claro). Secuencialmente, se pueden adquirir imágenes confocales de fluorescencia (flechas verdes para láser visible, flechas azules para detección confocal). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CARS puede iluminar la mielina (magenta) en el tejido cerebral (tronco encefálico) al mismo tiempo que obtiene imágenes de Nissl (cian) o marcadores fluorescentes. Los dos paneles muestran resultados representativos de un cerebro de jerbo mongol (imagen única M. unguiculatus, Figura 3A, C, E) y ratón (proyección máxima de la pila z M. musculus, Figura 2B, D, F), lo que indica que esta técnica se puede usar en todas las especies. La figura 3A, B muestra Nissl en cian, C, D muestra la señal CARS en magenta, E, F combina las señales Nissl y CARS con cada panel para jerbo o mouse, respectivamente. Ambos conjuntos de imágenes muestran una sección del núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB) en el tronco encefálico. Las neuronas en el MNTB reciben entradas de axones fuertemente mielinizados, que terminan en el cáliz de Held, un tipo de sinapsis gigante27. La barra de escala es de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Una de las mayores ventajas de la microscopía CARS sobre otras técnicas es la compatibilidad con imágenes fluorescentes23. La Figura 1 muestra los espectros CARS en comparación con Nissl marcados con marcador inmunofluorescente que muestra poca o ninguna superposición en los espectros. La Figura 2 ilustra la configuración láser para CARS en combinación con microscopía confocal. La Figura 3 muestra dos imágenes representativas, una como una sola pila y una proyección máxima de pila z de jerbo y ratón que podrían obtenerse utilizando imágenes CARS que muestran ambos cuerpos celulares (cian) y señal de mielina (magenta).
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Discussion
Un creciente cuerpo de literatura enfatiza el papel de la mielina en la función cerebral 13,16,21,28. Además, sabemos que el grosor de la mielinización y el patrón de mielinización pueden cambiar en varias afecciones neurológicas como la esclerosis múltiple (revisada en29), el envejecimiento (revisado en 30), el autismo20,31 y muchas otras. Por lo tanto, no es sorprendente que cada vez más investigadores necesiten evaluar la mielinización a través de tejidos cerebrales y modelos animales, en varias afecciones médicas y en un número creciente de situaciones experimentales. Los métodos tradicionales para obtener imágenes de la mielinización en el tejido cerebral incluyen el etiquetado de anticuerpos seguido de microscopía óptica y microscopía electrónica (EM). Ambas técnicas consumen mucho tiempo y requieren protocolos de preparación de tejidos de varios pasos, que están asociados con posibles errores y cambios en la composición del tejido. Demostramos un método alternativo que puede producir resultados similares mucho más rápido debido a la capacidad de obtener imágenes de la mielina mucho más rápido, y que se puede combinar con microscopía de luz de fluorescencia adicional. Es importante destacar que esta técnica se puede utilizar para obtener imágenes de lípidos en el tejido cerebral sin la necesidad de marcadores o etiquetas adicionales. Esta técnica no sólo permite la obtención de imágenes de la mielina a lo largo de axones intactos, sino que también permite la obtención de imágenes de productos de degradación de mielina como placas o gotitas líquidas32, que se ha demostrado que ocurren, por ejemplo, en la esclerosis múltiple33.
La frecuencia a la que se sintonizó el láser CARS fue adecuada para sesgar la imagen en gran medida a favor de los lípidos, lo que resultó en imágenes generales de alta calidad de la mielinización, ya que la mielina es, con mucho, la sustancia rica en lípidos más común en el cerebro. El principio de esta técnica es que un láser CARS, que se puede sintonizar a varias frecuencias, se sintoniza a 792.2 nm, que es una frecuencia adecuada para excitar enlaces CH2 . Estos son abundantes en lípidos, que contienen largas cadenas de grupos CH2 unidos por enlaces carbono-carbono con un grupo terminal de ácido carboxílico al final. Los lípidos excitantes con esta frecuencia dieron como resultado una señal que luego podría ser fotografiada con tecnología estándar de detección de microscopio confocal. La calidad de las imágenes resultantes apoya análisis cuantitativos que pueden ser realizados por un observador humano o algoritmos automatizados34. Sin embargo, este método no etiqueta exclusivamente la mielina ya que los enlaces CH2 no son exclusivos de la mielina, y por lo tanto CARS es menos específico de lo que sería un anticuerpo. Como resultado, las imágenes muestran alguna etiqueta, que no está asociada con la mielina. Es importante destacar que esta etiqueta de fondo no compromete la calidad de las mediciones o la capacidad de análisis cuantitativos.
La resolución de las imágenes CARS es limitada por difracción y similar a la microscopía de dos fotones (~ 250 nm) y, por lo tanto, más baja que la de EM. Por lo tanto, los investigadores que pretenden evaluar diferencias muy pequeñas en el grosor de la mielinización a medida que ocurre, por ejemplo, en ciertas afecciones médicas, deben ser conscientes de esta limitación. Los controles EM adicionales en una muestra pequeña pueden confirmar que la resolución es suficiente para su objetivo de investigación.
Una ventaja importante de CARS para obtener imágenes de mielina, además de la velocidad y la facilidad, es la capacidad de combinar la imagen de lípidos sin etiqueta con la microscopía confocal de fluorescencia. Dependiendo del microscopio que se utilice para CARS, se pueden obtener imágenes de dos o incluso tres canales adicionales, de modo que las imágenes de mielina se pueden combinar con el etiquetado de anticuerpos, tinción de Nissl, líneas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes o similares. Las limitaciones potenciales al usar fluoróforos de longitud de onda más larga se deben principalmente a que la señal CARS se observa a través de filtros de paso de banda de 640-680 nm que pueden atrapar la emisión de fluoróforos verdes y / o rojos. Sin embargo, el láser de picosegundos utilizado para la excitación CARS tiene una energía de pulso máxima de ~ 10 veces menor que el láser de femtosegundo estándar utilizado para la excitación de dos fotones, traducido en ~ 100 menos fluorescencia. Además, el láser de picosegundos de pulso de 797,2 nm utilizado para la excitación CARS está espectralmente lejos del pico de absorción de la sección transversal de dos fotones de los fluoróforos visibles. Por lo tanto, el láser de picosegundos CARS es muy ineficiente para la excitación de dos fotones de fluoróforos visibles, lo que hace que la señal fluorescente sea insignificante para cruzar a la detección CARS. Sin embargo, esto debe probarse mediante imágenes de una muestra de control negativo que no tenga etiquetas fluorescentes en comparación con una muestra con marcadores fluorescentes.
En conclusión, la imagen CARS es una técnica adecuada para obtener imágenes de la mielina en el tejido cerebral. Si bien la resolución es comparable a la microscopía óptica estándar y, por lo tanto, es inferior a la EM, la velocidad y la facilidad de uso hacen de esta técnica una alternativa atractiva a los métodos existentes.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Compatible con NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) y NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 y FRAXA (McCullagh). Las imágenes CARS se realizaron en la parte del Núcleo de Microscopía de Luz Avanzada del Centro de Neurotecnología del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado, con el apoyo en parte de NIH P30 NS048154 y NIH P30 DK116073.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors - 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma - Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
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