Summary
कैंसर इम्यूनोथेरेपी के युग में, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट गतिशीलता को स्पष्ट करने में रुचि काफी बढ़ गई है। यह प्रोटोकॉल अपने धुंधला और इमेजिंग चरणों के संबंध में एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग तकनीक का विवरण देता है, जो अत्यधिक मल्टीप्लेक्स स्थानिक विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
प्रतिरक्षा-आधारित उपचारों में प्रगति ने कैंसर के उपचार और अनुसंधान में क्रांति ला दी है। इसने ट्यूमर प्रतिरक्षा परिदृश्य के लक्षण वर्णन के लिए बढ़ती मांग को ट्रिगर किया है। यद्यपि मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ऊतक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, यह मार्करों की एक छोटी संख्या के विश्लेषण तक सीमित है। इसके विपरीत, प्रवाह साइटोमेट्री जैसी तकनीकें एक साथ कई मार्करों का मूल्यांकन कर सकती हैं, हालांकि ऊतक आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी खो जाती है। हाल के वर्षों में, फेनोटाइपिक और स्थानिक विश्लेषण को एकीकृत करने वाली बहुसंकेतित रणनीतियां ट्यूमर प्रतिरक्षा परिदृश्य के लक्षण वर्णन के लिए व्यापक दृष्टिकोण के रूप में उभरी हैं। यहां, हम धातु-लेबल एंटीबॉडी और माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संयोजन वाली एक अभिनव तकनीक पर चर्चा करते हैं जो परख विकास और अनुकूलन, ऊतक तैयारी और छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण में तकनीकी चरणों पर ध्यान केंद्रित करता है। धुंधला होने से पहले, एक धातु-लेबल एंटीबॉडी पैनल विकसित और अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह हाय-प्लेक्स छवि प्रणाली एक एकल ऊतक अनुभाग में 40 धातु-टैग एंटीबॉडी का समर्थन करती है। ध्यान दें, पैनल में शामिल मार्करों की संख्या के साथ सिग्नल हस्तक्षेप का खतरा बढ़ जाता है। पैनल डिजाइन के बाद, इस हस्तक्षेप को कम करने के लिए एंटीबॉडी को धातु आइसोटोप असाइनमेंट पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रारंभिक पैनल परीक्षण एंटीबॉडी के एक छोटे सबसेट और नियंत्रण ऊतकों में पूरे पैनल के बाद के परीक्षण का उपयोग करके किया जाता है। फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों को प्राप्त किया जाता है और सोने के लेपित स्लाइड पर घुड़सवार किया जाता है और आगे दाग दिया जाता है। धुंधला होने में 2 दिन लगते हैं और बारीकी से मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला जैसा दिखता है। एक बार नमूने दाग रहे हैं, वे छवि अधिग्रहण साधन में रखा जाता है। दृश्य के फ़ील्ड का चयन किया जाता है, और छवियों को अधिग्रहित, अपलोड और संग्रहीत किया जाता है। अंतिम चरण सिस्टम के छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके हस्तक्षेप को फ़िल्टर करने और हटाने के लिए छवि तैयारी है। इस प्लेटफ़ॉर्म का एक नुकसान विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर की कमी है। हालांकि, उत्पन्न छवियों को विभिन्न कम्प्यूटेशनल पैथोलॉजी सॉफ्टवेयर द्वारा समर्थित किया जाता है।
Introduction
क्लोनल ट्यूमर आबादी के आसपास के कई सेल प्रकारों का महत्व कार्सिनोजेनेसिस के वर्गीकरण में एक महत्वपूर्ण तत्व है। कैंसर उपचार शस्त्रागार के हिस्से के रूप में प्रतिरक्षा-आधारित चिकित्सा की स्थापना के बाद इस ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (टीएमई) संरचना और इंटरैक्शन को स्पष्ट करने में रुचि लगातार बढ़ी है। इसलिए, उपचार रणनीतियों को ट्यूमर-केंद्रित दृष्टिकोण से टीएमई-केंद्रित एक में स्थानांतरित कर दियागया है 1.
ट्यूमर निगरानी और कैंसर के विकास में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिकाओं को स्पष्ट करने के प्रयासों में हाल के वर्षों में हड़ताली रूप से वृद्धि हुई है 2,3. चिकित्सा अनुसंधान में, साइटोमेट्री-आधारित विधियों और सिंगलप्लेक्स और मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों सहित कई विधियां, टीएमई के कई तत्वों की अनूठी बातचीत को समझने के इस प्रयास के हिस्से के रूप में उत्पन्न हुईं।
फ्लो साइटोमेट्री (1960 के दशक में आविष्कार), प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग और मास साइटोमेट्री जैसे अग्रणी तरीके मुख्य रूप से टीएमई घटकों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने पर केंद्रित हैं4. भले ही साइटोमेट्री-आधारित मात्रात्मक तकनीक प्रतिरक्षा परिदृश्य फेनोटाइपिंग की अनुमति देती है, सेलुलर स्थानिक वितरण का निर्धारण असंभव है। इसके विपरीत, मानक सिंगलप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे तरीके ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करते हैं और शोधकर्ताओं को सेलुलर वितरण का विश्लेषण करने में सक्षम बनाते हैं, हालांकि एक एकल ऊतक अनुभाग में लक्ष्यों की कम संख्या इन विधियों की सीमा है 5,6। पिछले कई वर्षों में, मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस, बारकोडिंग फ्लोरेसेंस इमेजिंग और इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन के लिए मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियां एक ही ऊतक अनुभाग 7 का उपयोग करके एक साथ मार्कर धुंधला होने के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए व्यापक रणनीतियों के रूप में उभरीहैं।
यहां हम एक ऐसी तकनीक प्रस्तुत करते हैं जो धातु टैग किए गए एंटीबॉडी और माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री को जोड़ती है और सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन परिमाणीकरण, मार्कर सह-अभिव्यक्ति (फेनोटाइपिंग), और फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई), और ताजा जमे हुए (एफएफ) ऊतक नमूने 8,9 का उपयोग करके स्थानिक विश्लेषण को सक्षम बनाती है। एफएफपीई नमूने ऊतक संग्रह नमूनों के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सामग्री हैं और ताजा जमे हुए नमूनों की तुलना में मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के लिए अधिक आसानी से उपलब्ध संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं10. इसके अतिरिक्त, यह तकनीक महीनों बाद छवियों को पुनः प्राप्त करने की संभावना प्रदान करती है। यहां, हम एफएफपीई ऊतक नमूनों का उपयोग करके हमारे धुंधला और छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं।
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Protocol
टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुसार अनुसंधान उद्देश्यों के लिए ऊतक के नमूने प्राप्त किए गए थे, और नमूनों को आगे डी-पहचाना गया था।
1. एंटीबॉडी चयन
- सर्वोत्तम उपलब्ध एंटीबॉडी क्लोन चुनने के लिए अनुसंधान प्रश्नों को परिभाषित करें। अनुसंधान संसाधनों के रूप में मानव प्रोटीन एटलस, प्रकाशित अनुसंधान और एंटीबॉडी निर्माता वेबसाइटों का उपयोग करें।
नोट: पर्याप्त मानव ऊतक नियंत्रण और विभिन्न चरणों में दाग होने के लिए एक ही मानव ऊतक नियंत्रण का चयन यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मार्कर सही ढंग से, सही जगह पर और सही सेलुलर डिब्बे में दाग रहे हैं। सामान्य ऊतक और नियोप्लास्टिक ऊतकों सहित एक छोटे ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) को हमेशा धुंधला सत्यापन के लिए अनुशंसित किया जाता है। - पैनल को डिजाइन करने के लिए केवल वाहक मुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करें।
नोट: यदि वाणिज्यिक वाहक मुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है तो वाहक मुक्त एंटीबॉडी योगों का उपयोग आवश्यक है; शुद्धिकरण किट का उपयोग एंटीबॉडी को सही सूत्रीकरण में समायोजित करने के लिए किया जा सकता है। गोजातीय सीरम एल्बुमिन जैसे प्रोटीन योजक संयुग्मन क्षमता को कम करने के लिए जाने जाते हैं। - मार्कर की अभिव्यक्ति के उपकोशिकीय पैटर्न को निर्धारित करने के लिए मानक क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके प्रत्येक एंटीबॉडी का परीक्षण और शीर्षक; झिल्ली, साइटोप्लाज्मिक, या परमाणु धुंधला; और नियंत्रण ऊतकों में विशिष्ट कोशिकाओं में अभिव्यक्ति।
नोट: हालांकि, प्रत्येक एंटीबॉडी को पीएच 6 साइट्रेट और पीएच 9 एथिलीनडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) में परीक्षण किया जाना चाहिए, और क्या पैनल को पीएच 6 साइट्रेट या पीएच 9 ईडीटीए के साथ दाग दिया जाएगा, यह निर्धारित किया जाना चाहिए। अच्छे संकेत प्राप्त करने के लिए पीएच 9 ईडीटीए के उपयोग की सिफारिश की जाती है, खासकर जब इस पद्धति के साथ काम करते हैं। - सकारात्मक नियंत्रण में अभिव्यक्ति के पैटर्न के अनुसार इष्टतम धुंधला एकाग्रता चुनें।
- इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मार्कर बहुतायत, उपकोशिकीय स्थानीयकरण और अन्य लक्ष्यों के साथ सेलुलर सह-अभिव्यक्ति के अनुसार उपलब्ध धातु आइसोटोप में से एक को प्रत्येक एंटीबॉडी असाइन करें।
- संबंधित असाइन किए गए धातु के साथ एंटीबॉडी को दाग दें और पहले इस्तेमाल किए गए एक ही नियंत्रण ऊतक में अभिव्यक्ति के साथ तुलना करें।
नोट: एंटीबॉडी धातु संयुग्मन एंटीबॉडी तैयारी, कमी और बाद में संयुग्मन (पूरक फ़ाइल 1) के साथ शुरू होता है। प्रत्येक धातु-भारित बहुलक ट्यूब एक एंटीबॉडी के 100 μg लेबलिंग के लिए पर्याप्त है।
2. एंटीबॉडी पैनल डिजाइन
- एंटीबॉडी धुंधला के छोटे बैच बनाएं। एक कॉकटेल में पांच मार्करों का परीक्षण करें।
नोट: बैचों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके पहले से ही संयुग्मित और विश्लेषण किए गए एंटीबॉडी का परीक्षण चैनल हस्तक्षेप की प्रारंभिक पहचान की सुविधा प्रदान करता है और एंटीबॉडी को किसी अन्य धातु के साथ पुन: संयोजित करने का अवसर प्रदान करता है। यह पर्याप्त मार्कर सह-अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने का अवसर भी प्रदान करता है। - प्रत्येक छोटे बैच को चार अलग-अलग एंटीबॉडी सांद्रता (0.05 μg / एमएल, 0.2 μg / एमएल, 1 μg / एमएल, और 4.0 μg / एमएल) के साथ दाग दें।
नोट: विभिन्न टाइटर्स की तुलना करते हुए, एंटीबॉडी एकाग्रता की पहचान करें जिसके परिणामस्वरूप न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला (सर्वोत्तम सिग्नल-टू-शोर अनुपात) के साथ सही स्थान और उच्चतम अभिव्यक्ति होती है।
3. एफएफपीई ऊतक सेक्शनिंग
- सोने के लेपित स्लाइड (इस उद्देश्य के लिए विशिष्ट) का चयन करें और उन्हें माइक्रोटोम के करीब रखें। धारक में एक नया ब्लेड डालकर माइक्रोटोम तैयार करें। अनुभाग मोटाई को 4-5 μm पर सेट करें।
- सेक्शनिंग से पहले बर्फ पर एफएफपीई ब्लॉक रखें। आसुत जल या विआयनीकृत पानी (डीआईएच2ओ) को 40-45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके एक ऊतक फ्लोटेशन स्नान तैयार करें।
नोट: डीआईएच2ओ या आसुत जल का उपयोग संदूषण की संभावना को कम करता है। - सेक्शनिंग प्रारंभ करें. चिमटी का उपयोग करके पानी में ऊतक अनुभाग रखें और इसे चपटा होने दें। पानी से ऊतक वर्गों को हटाने के लिए स्लाइड का उपयोग करें।
- स्लाइड रैक में स्लाइड रखें और उन्हें रात भर कमरे के तापमान पर सूखने दें।
4. एफएफपीई एंटीबॉडी धुंधला
नोट: धुंधला प्रक्रिया दो अलग-अलग दिनों में होती है।
सावधानी: इस प्रोटोकॉल में नियोजित समाधान संभावित संक्षारक हैं और त्वचा और आंखों के लिए खतरों का प्रतिनिधित्व करते हैं। दस्ताने पहनना, एक प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षात्मक आंख और चेहरे के उपकरण की सलाह दी जाती है और हमारी संस्था की जैव सुरक्षा नीति का हिस्सा है।
- अभिकर्मक तैयारी (दिन 1)
- टीबीएस-टी के 1 एल बनाने के लिए 950 एमएल डीआईएच 2 ओ में ट्वीन (टीबीएस-टी) के साथ20एक्स ट्रिस-बफर खारा के 50 एमएल पतला करें।
- 1 एक्स गर्मी-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (एचआईईआर) समाधान बनाने के लिए 10 एक्स ट्रिस-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के 8 एमएल को डीआईएच 2 ओ के72एमएल में पतला करें।
- अवरुद्ध बफर बनाने के लिए 5% की अंतिम एकाग्रता के लिए 1x टीबीएस-टी में गधे सीरम को पतला करें। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एचआईईआर तैयारी: प्रीट्रीटमेंट (पीटी) मॉड्यूल
सावधानी: पीटी मॉड्यूल में उपयोग किए जाने वाले किसी भी अभिकर्मकों में डूबे हुए किसी भी अभिकर्मकों या भागों को संभालते समय रासायनिक सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें।- 1 एक्स पीबीएस के 1.4 एल बनाने के लिएडीआईएच 2ओ के 1,260 एमएल में 10 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 140 मिलीलीटर पतला करें। वैकल्पिक रूप से, सात पीबीएस गोलियों को डीआईएच2ओ के 1.4 एल में पतला करें।
- पीबीएस के 1.4 एल के साथ एक टैंक भरें और टैंक में 1x HIER समाधान के 100 मिलीलीटर के साथ तैयार स्लाइड चैंबर कंटेनर जगह।
- एक पीटी मॉड्यूल में टैंक को 75 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
- अतिरिक्त पैराफिन निकालना
- कम से कम 20 मिनट के लिए एक ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना स्लाइड।
नोट: कुछ ऊतकों या वर्गों को लंबे समय तक बेकिंग समय की आवश्यकता हो सकती है। मस्तिष्क के ऊतकों या टीएमए के लिए अनुशंसित बेकिंग समय 1 घंटे है। इसे 16 घंटे (रात भर) या प्रयोगशाला अनुभव के अनुसार बढ़ाया जा सकता है। - एक स्लाइड धारक में बेक्ड स्लाइड रखें और एक धूआं हुड के नीचे एक प्रकार के बरतन पर निम्नलिखित धोने के चरणों का प्रदर्शन करें। निम्नलिखित समाधान में स्लाइड्स को धोएं: 30 एस (धातु मुक्त) के लिए जाइलीन 2 एक्स, 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 100% अल्कोहल 2 एक्स, 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 95% अल्कोहल 2 एक्स, 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 80% अल्कोहल, 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 70% अल्कोहल, और 30 एस (धातु मुक्त) के लिए डीआईएच2ओ 2 एक्स।
- एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए तैयार होने तक स्लाइड्स को एक ताजा डीआईएच2ओ कंटेनर में रखें।
नोट: स्लाइड प्रक्रिया के अंत तक सूख नहीं जाना चाहिए।
- कम से कम 20 मिनट के लिए एक ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना स्लाइड।
- एंटीजन पुनर्प्राप्ति
- पीटी मॉड्यूल के अंदर 1x HIER बफर युक्त एक पहले से गरम स्लाइड कक्ष में स्लाइड रखें। कवर को टैंक पर रखें। ढक्कन बंद करें और कुंडी लगाएं।
- मुख्य मेनू खोलने के लिए पीटी मॉड्यूल पर मेनू बटन दबाएं और कस्टम प्रोग्राम बनाने के लिए सेटअप चक्र (समय और तापमान) बटन दबाएं।
- 40 मिनट के लिए 97 डिग्री सेल्सियस पर पीटी मॉड्यूल चलाएं। बाद में, पीटी मॉड्यूल स्वचालित रूप से 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाएगा।
- 65 डिग्री सेल्सियस तापमान तक पहुंचने के बाद पीटी मॉड्यूल से स्लाइड निकालें। स्लाइड को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए रखें।
नोट: पीटी मॉड्यूल तब तक नहीं खुलेगा जब तक कि तापमान 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा न हो जाए। इस प्रक्रिया के दौरान स्लाइड की सुनहरी सतह को न छुएं, और हमेशा दस्ताने का उपयोग करें।
- एंटीबॉडी अवरुद्ध
- एक शेकर को 70 आरपीएम पर सेट करें।
- 5 मिनट 2x के लिए उन्हें 1x टीबीएस-टी में डुबोकर स्लाइड धो लें।
- हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करके, स्लाइड किनारों से कम से कम 1 मिमी दूर ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक सीमा खींचें और इसे 15-30 एस के लिए सूखने दें।
नोट: धुंधला के साथ किसी भी ऊतक हस्तक्षेप से बचने के लिए ऊतक अनुभाग को छूने से कलम तरल पदार्थ को रोकने के लिए देखभाल करें। संभावित लीक से बचने के लिए बाधा खींचते समय पेन को बहुत कठिन न दबाएं। इष्टतम धुंधला और छवि अधिग्रहण परिणामों के लिए, ऊतक वर्गों को सोने के लेपित स्लाइड्स के बीच में 15 मिमी x 30 मिमी से बड़ा फ्रेम में रखा जाता है ताकि ऊतक को छूने के बिना बाधा को आकर्षित करने के लिए पर्याप्त स्थान मिल सके या स्लाइड के बाहरी किनारे पर रखे गाइड डॉट्स। - किसी भी पेन अवशेष को हटाने के लिए, स्लाइड्स को टीबीएस-टी में डुबोएं।
- कमरे के तापमान पर एक नमी कक्ष में, 20 मिनट के लिए अवरुद्ध बफर के 100-200 μL के साथ ऊतक अनुभाग सेते हैं। एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार है जब तक अवरुद्ध बफर में ऊतक सेते छोड़ दें।
- एंटीबॉडी पैनल की तैयारी
नोट: एंटीबॉडी पैनल कॉकटेल की अंतिम मात्रा अनुमानित ऊतक अनुभाग सतह क्षेत्र के अनुसार भिन्न होती है। 20 मिमी x 20 मिमी के क्षेत्र को कवर करने के लिए, कॉकटेल के 100-200 μL तैयार करें।
धातु आइसोटोप-संयुग्मित एंटीबॉडी का एंटीबॉडी पैनल कॉकटेल तैयार करने के लिए निम्नलिखित कार्य करें:- कॉकटेल की अंतिम मात्रा की पुष्टि करें जो अवरुद्ध बफर वॉल्यूम में जोड़े गए एंटीबॉडी कॉकटेल वॉल्यूम के बराबर है।
- परियोजना के लिए एक पैनल स्प्रेडशीट में सभी एंटीबॉडी, कमजोर पड़ने और / या एंटीबॉडी सांद्रता के लिए विनिर्देशों की पुष्टि करें।
- 5 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर सभी एंटीबॉडी युक्त ट्यूबों को नीचे स्पिन करें। अवरुद्ध बफर करने के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी जोड़ें और बहुत अच्छी तरह से मिश्रण। इसे पाइप करते समय एंटीबॉडी ट्यूब के नीचे परेशान न करें।
- अवरुद्ध बफर के 100 μL के साथ एक 0.1 μm केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस को प्रीवेट करके एंटीबॉडी पैनल को फ़िल्टर करें। 2 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर फिल्टर स्पिन और एक विंदुक के साथ अवरुद्ध बफर प्रवाह के माध्यम से हटा दें।
- एंटीबॉडी पैनल को एक स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर फिल्टर स्पिन करें। स्पिन कॉलम को त्यागें और फ़िल्टर किए गए एंटीबॉडी पैनल के रूप में फ्लो-थ्रू का उपयोग करें।
नोट: धातु विनिमय को रोकने के लिए कॉकटेल बनाने के तुरंत बाद धुंधला प्रदर्शन करें। यदि विस्तारित समय के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल के भंडारण की आवश्यकता होती है, तो इसे लियोफिलाइजेशन के अधीन किया जा सकता है।
- एंटीबॉडी धुंधला होना
- ध्यान से अपनी तरफ प्रत्येक स्लाइड टिपिंग और धीरे एक कार्य वाइपर के खिलाफ किनारों दोहन करके स्लाइड से अवरुद्ध बफर निकालें।
- एक नमी कक्ष में स्लाइड रखें और ऊतक के लिए एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण के 100-200 μL जोड़ें (ऊतक के साथ संपर्क और हवा के बुलबुले के निर्माण से बचें)।
- धुंधला बैच के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड जोड़ें।
- रात भर (14-16 घंटे) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेते हैं।
- अभिकर्मक तैयारी (दिन 2)
- 1 एक्स पीबीएस बनाने के लिए 900 एमएल डीआईएच2ओ में 10 एक्स लो-बेरियम पीबीएस, पीएच 7.4 के 100 एमएल पतला करें।
- कम-बेरियम पीबीएस (कम-बेरियम पीबीएस के 340 एमएल + 70% ग्लूटाराल्डिहाइड के 10 एमएल) में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड के कामकाजी स्टॉक समाधान के 350 एमएल तैयार करें।
नोट: एक हुड के तहत कमजोर पड़ने प्रदर्शन। ग्लूटाराल्डिहाइड एक बहुत चिपचिपा तरल है। एक 1 एमएल विंदुक का प्रयोग करें और ग्लूटाराल्डिहाइड ट्यूब के लिए कम बेरियम पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें हर बार जब तक यह ट्यूब से बाहर डालने के लिए पर्याप्त तरल हो जाता है। - 1 एक्स ट्रिस बनाने के लिए डीआईएच20 के 900 एमएल में 10 एक्स ट्रिस, पीएच 8.5 को पतला करें।
- निर्धारण और निर्जलीकरण
- अपनी तरफ स्लाइड टिपिंग और धीरे से एक कार्य वाइपर के खिलाफ किनारे दोहन करके प्रत्येक स्लाइड से एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण निकालें।
- निम्नलिखित बफ़र्स में हल्के से मध्यम आंदोलन के साथ स्लाइड धो लें: 1 एक्स टीबीएस-टी, प्रत्येक 5 मिनट (धातु मुक्त) के लिए 3x बार; 5 मिनट के लिए 2% ग्लूटाराल्डिहाइड फ़िल्टर किया गया; फ़िल्टर्ड 1 एक्स ट्रिस, पीएच 8.5, 3 एक्स 30 एस के लिए; 30 एस के लिए फ़िल्टर्ड डीआईएच2ओ 2 एक्स; 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 70% शराब; 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 80% शराब; 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 95% शराब; और 30 एस (धातु मुक्त) के लिए 100% शराब।
- अतिरिक्त शराब को हटाने के लिए एक कार्य वाइपर के खिलाफ प्रत्येक स्लाइड के किनारे को धीरे-धीरे टैप करें और कमरे के तापमान (~ 5-10 मिनट) पर अवशिष्ट अल्कोहल को वाष्पित करने की अनुमति दें।
- छवि अधिग्रहण से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए एक डिसिकेटर में सूखी स्लाइड या दीर्घकालिक भंडारण के लिए वैक्यूम चैंबर में स्लाइड रखें।
5. छवि अधिग्रहण
- स्लाइड सेटअप
नोट: साधन का उपयोग करके स्कैन करने से पहले, स्लाइड्स को नीचे वर्णित चरणों का पालन करते हुए वेब-आधारित छवि प्रबंधन एप्लिकेशन का उपयोग करके परिभाषित और सेट किया जाना चाहिए।- वेब-आधारित छवि प्रबंधन अनुप्रयोग में स्लाइड पृष्ठ पर, परिग्रहण नई स्लाइड क्लिक करें और इच्छित विवरण (नाम, स्लाइड पहचान, स्थान और वर्णन) दर्ज करें.
- अनुभाग जोड़ें क्लिक करके स्कैनिंग अनुभाग बनाएँ. प्रत्येक अनुभाग (प्रोजेक्ट का नाम, स्लाइड नाम, ब्लॉक और स्थिति) के लिए जानकारी भरें। बनाई गई नई स्लाइड्स/अनुभागों को सहेजने के लिए सबमिट करें क्लिक करें.
- संसाधन टैब के तहत, पैनल पृष्ठ खोलें और उपयोग किए जाने वाले पैनल का चयन करें। नए फलकों के लिए, नया फलक बनाएँ क्लिक करें.
- पैनल का चयन करने के बाद, अनुभागों पर क्लिक करें। चरण 2 में बनाए गए अनुभाग जोड़ें। अनुभाग असाइनमेंट संपादित करें क्लिक करके. सबमिट पर क्लिक करके सहेजें।
- इंस्ट्रूमेंट सेटअप
नोट: यह उपकरण ( सामग्री की तालिका देखें) एक विशिष्ट नियंत्रण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके संचालित किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।- नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में लॉग इन करें। यदि उपकरण स्लीप मोड में है, तो वेक अप पर क्लिक करें।
नोट: ऑपरेशन से कम से कम 1 घंटे पहले, उपकरण को गर्म करने की सिफारिश की जाती है, जो बीम फोकस स्थिरीकरण में मदद करता है। - स्लाइड लोड करने के लिए, एक्सचेंज नमूना पर क्लिक करें और फिर दरवाजा खोलने के लिए जारी रखें क्लिक करें। नमूना सामना करना पड़ रहा है और दाईं ओर लेबल के साथ लोडिंग स्लॉट में स्लाइड रखो। दरवाजा बंद करने के लिए जारी रखें क्लिक करें.
नोट:: यदि स्लाइड ठीक से लोड नहीं है, तो स्लाइड समायोजित करने के लिए एक चेतावनी ध्वनि और सूचना दिखाई देगी। - प्रोजेक्ट का चयन करें, और उसके बाद लोड किए गए नमूने के लिए स्लाइड नाम का चयन करें।
- स्लाइड ऑप्टिकल छवि फलक पर मनोरम छवि कल्पना करें।
- नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में लॉग इन करें। यदि उपकरण स्लीप मोड में है, तो वेक अप पर क्लिक करें।
- फील्ड ऑफ व्यू (एफओवी) चयन और अधिग्रहण
- मोड मेनू पर क्लिक करें और एसईडी (माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर) का चयन करें। इमेजिंग मोड मेनू पर क्लिक करें और क्यूसी -300 μm उठाओ।
- एफओवी स्थान को नियंत्रित करने के लिए जॉग स्टेज पर क्लिक करें और फिर नेविगेट करने और एफओवी की स्थिति का चयन करने के लिए तीर पर क्लिक करें।
- एफओवी जोड़ें क्लिक करें, फ़ील्ड आकार के रूप में 400 μm x 400 μm सेट करें, और इमेजिंग मोड और 1 एमएस निवास समय के रूप में ठीक का चयन करें। पुष्टि करेंक्लिक करें।
नोट: सेट निवास समय वांछित संकल्प पर निर्भर करेगा। रिज़ॉल्यूशन बढ़ने के साथ रहने का समय बढ़ता जाता है। अधिग्रहण का समय डिटेक्टर ब्रेक-इन अवधि और ऑपरेशन की लंबाई सहित कई कारकों के आधार पर भिन्न हो सकता है। एक एफओवी के लिए हमारा औसत अधिग्रहण समय लगभग 17 मिनट है। 8 घंटे तक के लिए उपकरण नॉनस्टॉप का उपयोग करें, जो लगभग 28 एफओवी की स्कैनिंग की अनुमति देता है। अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता लगातार कई घंटों के उपयोग के बाद कम हो जाती है। - एक एफओवी सूची बनाने के बाद, छवि फोकस पर आगे बढ़ें और बीम को एक ऊतक क्षेत्र में ले जाकर कलंक को समायोजित करें जिसे इमेज नहीं किया जाएगा। एक स्पष्ट केंद्रीय छवि प्राप्त होने तक मापदंडों को समायोजित करें।
नोट: छवि अधिग्रहण को अनुकूलित करने के लिए, स्लाइड पर ऊतक अनुभाग को केंद्रीकृत रखना आदर्श है। ध्यान केंद्रित करते समय, केवल केंद्रीय क्षेत्र की एक स्पष्ट छवि प्राप्त की जा सकती है। यदि ऊतक अनुभाग बहुत बड़ा है, तो किनारे फोकस से बाहर होंगे, और छवि धुंधली हो जाएगी। - स्टार्ट रन पर क्लिक करें। अधिग्रहित छवियों को स्वचालित रूप से अपलोड किया जाएगा और वेब-आधारित छवि प्रबंधन एप्लिकेशन में संग्रहीत किया जाएगा।
6. छवि की तैयारी
- छवि आइसोबेरिक सुधार
नोट: आइसोबेरिक सुधार का उद्देश्य समान या बहुत समान द्रव्यमान के आइसोटोप की उपस्थिति के परिणामस्वरूप चैनलों के बीच स्पिलओवर सिग्नल को हटाना है, जिनके द्रव्यमान में अंतर द्रव्यमान विश्लेषक का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है।- वेब-आधारित छवि प्रबंधन एप्लिकेशन में, एफओवी (टीआईएफएफ छवियों) को सहेजने के लिए हरे रंग के डाउनलोड आइकन पर क्लिक करें।
- वेब-आधारित छवि प्रबंधन एप्लिकेशन में लगभग टैब पर उपलब्ध छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का सबसे अद्यतन संस्करण डाउनलोड करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे फ़ाइल में सहेजें। .zip संग्रह फ़ाइल खोलें और स्थापना चरणों का पालन करें। इंस्टॉलेशन पूरा होने के बाद सॉफ़्टवेयर खोलें।
- छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर के इनपुट फलक पर फ़ाइल आइकन पर क्लिक करके सही की जाने वाली छवियों वाले फ़ोल्डर का चयन करें। एक एफओवी सूची लोड की जाएगी।
- डिफ़ॉल्ट सुधार लागू करने के लिए इनपुट फलक पर फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करें। प्रत्येक चैनल के लिए, स्क्रीन के दाईं ओर सुधार से पहले और बाद में प्राप्त छवियों की कल्पना करें।
- सही छवि को सहेजने के लिए आउटपुट फलक पर फ्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करें।
- छवि फ़िल्टरिंग: वोरोनोई टेसेलेशन
नोट: वोरोनोई टेसेलेशन आरेख वोरोनोई कोशिकाओं में बीज बिंदुओं वाले अंतरिक्ष के विभाजन का वर्णन करते हैं। इसका उद्देश्य सेल घनत्व का अनुमान लगाना और सेल सीमाओं को परिभाषित करना है। वोरोनोई टेसेलेशन गणना का उपयोग करके, एक मुखौटा उत्पन्न होता है और फ़िल्टरिंग के लिए मूल छवि पर लागू होता है।- फ़िल्टरिंग टैब पर क्लिक करें और फ़िल्टरिंग पैरामीटर मेनू पर वोरोनोई टेसेलेशन का चयन करें।
- इनपुट फलक पर, मासकरेक्टेड.tiff छवि का चयन करें। इनपुट फलक पर फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करें।
- फ़िल्टर की गई छवि को सहेजने के लिए आउटपुट फलक पर फ्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करें। दो परिणामी फ़ाइलों में प्रत्यय होंगे -फ़िल्टर्ड.tiff और -फ़िल्टर्ड.जेसन।
नोट: मासकरेक्टेड-फ़िल्टर्ड नामक छवि.tiff फिर तृतीय-पक्ष डिजिटल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम या ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम पर अपलोड की जा सकती है।
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Representative Results
टॉन्सिल और फेफड़े एडेनोकार्सिनोमा टीएमए ऊतक वर्गों (5 मिमी मोटी) प्राप्त किए गए थे और ऊतक आकार और स्लाइड के सुरक्षित मार्जिन के बारे में विनिर्देशों के बाद सोने की लेपित स्लाइड के बीच में रखा गया था। ऊतक के किनारे और ग्लास स्लाइड के पार्श्व और अवर सीमाओं के बीच क्रमशः 5 मिमी और 10 मिमी के नि: शुल्क ग्लास मार्जिन इष्टतम धुंधला होने के लिए आवश्यक हैं। स्लाइड के लिए अनुभाग के उचित पालन को आश्वस्त करने के लिए ऊतक वर्गों को धुंधला होने से पहले ओवन में रात भर बेक किया गया था। एंटीबॉडी पैनल 23 मार्करों से बना था। एक ही धुंधला बैच में, एक टॉन्सिल स्लाइड और कई ऊतकों युक्त एक टीएमए स्लाइड फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा नमूनों (चित्रा 1) में कम व्यक्त मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए शामिल थे। पैनलों में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लक्ष्यों के अनुसार सकारात्मक नियंत्रण चुनने की आवश्यकता है; उदाहरण के लिए, एसओएक्स 10 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, मेलेनोमा नमूनों की आवश्यकता होती है, और जीएएफपी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों की आवश्यकता होती है (चित्रा 2)।
चित्रा 1: आइसोटोपिक शुद्धता और चैनल क्रॉस-टॉक। मैट्रिक्स जांच शुद्धता और ऑक्साइड (नीले बक्से, ≥0.5%; स्पष्ट बक्से, <0.5%) से प्राप्त प्रतिशत क्रॉस-टॉक दिखाता है। बड़े पैमाने पर टैग के लिए, जांच जो कम से कम 0.5% क्रॉस-टॉक में योगदान देती है, कोई चैनल (हरा), एक या दो चैनल (पीला), या दो से अधिक चैनल (नारंगी) दिखाए जाते हैं। कोई जांच (हरा), एक या दो जांच (पीला), या दो से अधिक जांच (नारंगी) से कम से कम 0.5% क्रॉस-टॉक प्राप्त करने वाले बड़े पैमाने पर चैनल भी दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विभिन्न ऊतकों में प्रतिनिधि धुंधला छवियों. (ए) फेफड़े एडेनोकार्सिनोमा। (बी) नॉनोप्लास्टिक किडनी। (ग) टॉन्सिल। सीडी 20 को पीले रंग में दिखाया गया है, केआई 67 को मैजेंटा में दिखाया गया है, सीडी 3 को सफेद रंग में दिखाया गया है, सीडी 11 सी को हरे रंग में दिखाया गया है, सीडी 68 को लाल रंग में दिखाया गया है, साइटोकेरेटिन को सियान में दिखाया गया है, और डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) को नीले रंग में दिखाया गया है। आवर्धन, 200x. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
यह धुंधला प्रक्रिया बारीकी से मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला जैसा दिखता है और लगातार दो दिनों में हुआ। धुंधला प्रोटोकॉल के पांच मुख्य चरण 1) अतिरिक्त पैराफिन हटाने, 2) एंटीजन पुनर्प्राप्ति, 3) एंटीबॉडी अवरुद्ध, 4) एंटीबॉडी धुंधला, और 5) निर्धारण और निर्जलीकरण (चित्रा 3) हैं। धुंधला प्रक्रिया में एक मौलिक कदम नमूनों के धातु संदूषण से बचने के लिए सावधानी बरतना है, जिसमें प्लास्टिकवेयर में संग्रहीत धातु मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करना और यांत्रिक क्षति को सीमित करने के लिए नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग शामिल है। धुंधला होने से तुरंत पहले एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने की सिफारिश की जाती है। इससे मेटल एक्सचेंज कम हो जाता है। एक बार धुंधला होने के बाद, हमने स्लाइड्स को संग्रहीत किया और अगले दिन उन्हें स्कैन किया। छवि अधिग्रहण से पहले, एक आवश्यक कदम एक वेब आधारित छवि प्रबंधन अनुप्रयोग (चित्रा 4) का उपयोग कर स्लाइड सेटअप है।
चित्र 3: छवि अधिग्रहण वर्कफ़्लो और संबद्ध स्लाइड. (A) छवि अधिग्रहण वर्कफ़्लो सारांश. 1) धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग वाले एक एफएफपीई ऊतक अनुभाग को प्राथमिक आयन बंदूक का उपयोग करके रास्टराइज किया जाता है, जो माध्यमिक आयनों को जारी करता है। 2) एक टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर अलग हो जाता है, और पिक्सेल स्तर पर उनके द्रव्यमान के आधार पर आयनों को मापता है। 3) माध्यमिक आयनों के पिक्सेल-आधारित परिमाणीकरण। वाई-अक्ष पता लगाए गए आयनों (चोटी) की संख्या से मेल खाती है, और एक्स-अक्ष प्रत्येक धातु के द्रव्यमान से मेल खाती है। 4) प्रत्येक द्रव्यमान स्पेक्ट्रम के शिखर के आधार पर, बहुआयामी छवियों का पुनर्निर्माण किया जाता है। (बी) इस प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली स्लाइड की योजनाबद्ध। इष्टतम धुंधला ऊतक के लिए, अनुभाग को स्लाइड के पार्श्व किनारे से कम से कम 5 मिमी और इसके अवर किनारे से 10 मिमी तैनात किया जाना चाहिए। ऊतक अनुभाग के चारों ओर हाइड्रोफोबिक बाधा खींचते समय, इसे स्लाइड के किनारे से कम से कम 1 मिमी आयत के अंदर रखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: वेब-आधारित छवि प्रबंधन अनुप्रयोग में स्लाइड सेटअप। स्लाइड स्कैनिंग से पहले, प्रत्येक स्लाइड सेट करना आवश्यक है। वांछित विवरण दर्ज करें जो स्लाइड पहचान में मदद कर सकता है। ब्लॉक और स्थिति की जानकारी शामिल करने के लिए अनुभाग जोड़ें (काला तीर) पर क्लिक करें। सहेजने के लिए सबमिट करें (लाल तीर) क्लिक करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
स्कैनिंग के दिन, नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अधिग्रहण उपकरण चालू करें। एक्सचेंज स्लाइड पर क्लिक करने से इंस्ट्रूमेंट का दरवाजा खुल गया, जिससे स्लाइड लोड हो गई। हमने स्लाइड को दाईं ओर लेबल के साथ लोडिंग स्लॉट पर रखा। एक बार में केवल एक स्लाइड स्कैन की जा सकती है। अगला चरण एफओवी का चयन कर रहा था और प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों के बाद फोकस और कलंक को समायोजित कर रहा था। हमने स्टार्ट रन पर क्लिक करके छवियों का अधिग्रहण किया। अधिग्रहण का समय एफओवी आकार और वांछित रिज़ॉल्यूशन के आधार पर भिन्न होता है। एफओवी आकार 200 μm x 200 μm से 800 μm x 800 μm तक होता है, जो 128 पिक्सेल x 128 पिक्सेल से 2048 पिक्सेल x 2048 पिक्सेल की फ्रेम आकार सीमा से मेल खाता है। तीन मानक संकल्प उपलब्ध हैं: मोटे, ठीक और सुपरफाइन। सुपरफाइन रिज़ॉल्यूशन पर बड़े एफओवी को स्कैन करना समय लेने वाला है, जिसमें एक एफओवी के लिए अंतिम अधिग्रहण समय 25 एस से 4.7 घंटे (चित्रा 5) तक है।
चित्रा 5: नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि अधिग्रहण। अधिग्रहण सेटिंग्स वांछित के रूप में समायोजित किया जा सकता है। स्कैनिंग रिज़ॉल्यूशन को संशोधित करने के लिए, इमेजिंग मोड (काला तीर) द्वारा ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें। एफओवी आकार को संशोधित करने के लिए, एफओवी आकार (μm) फ़ील्ड (लाल तीर) में कोई संख्या दर्ज करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
स्कैनिंग पूरी होने के बाद, सभी एफओवी सहित एक छवि सेट स्वचालित रूप से वेब-आधारित छवि प्रबंधन एप्लिकेशन पर अपलोड किया गया था। छवियों के भंडारण के अलावा, यह एप्लिकेशन सभी चैनलों के विज़ुअलाइज़ेशन को एक साथ या अलग-अलग, छवि समायोजन और आगे की तैयारी के लिए छवियों को डाउनलोड करने में सक्षम बनाता है। मानक विज़ुअलाइज़्ड छवि एक टीआईएफएफ फ़ाइल (चित्रा 6) के रूप में सहेजी जाती है।
चित्रा 6: वेब-आधारित छवि प्रबंधन एप्लिकेशन का उपयोग करके छवि विज़ुअलाइज़ेशन। अधिग्रहित छवियों को ऑनलाइन प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके संग्रहीत और विज़ुअलाइज़ किया जाता है। विज़ुअलाइज़ेशन मापदंडों को समायोजित करना और प्रत्येक मार्कर का रंग बदलना संभव है। अन्य मार्करों की कल्पना करने के लिए छवि चैनल जोड़ें (सफेद तीर) पर क्लिक करें। आवर्धन, 200x. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
धातु हस्तक्षेप उन्हें कम करने के लिए रणनीतियों के उपयोग के बावजूद धातु-लेबलिंग विधियों में निहित हैं। एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित धातु आइसोटोप से अतिरिक्त पृष्ठभूमि संकेतों को हटाने और विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करने के लिए, हमने संबंधित छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया ( सामग्री की तालिका देखें)। छवि तैयार करने की प्रक्रिया में दो चरण होते हैं: 1) आइसोबेरिक सुधार, जो चैनलों के बीच संकेतों को हटा देता है, और 2) फ़िल्टरिंग, जो छवि पर समुच्चय के कारण संकेतों को हटा देता है।
आइसोबेरिक सुधार शुरू करने के लिए, सहेजी गई टीआईएफएफ छवि वाली फ़ाइल को इनपुट फलक के फ़ाइल आइकन पर क्लिक करके चुना गया था। सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से फ़ाइल में सभी संग्रहीत टीआईएफएफ छवियों को लोड करता है, जिससे बैच विश्लेषण की अनुमति मिलती है। अगला, हमने इनपुट फलक के फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करके छवि को सही किया। प्रत्यय के साथ दो परिणामी फ़ाइलें -मासकरेक्टेड स्वचालित रूप से उत्पन्न हुईं: एक टीआईएफएफ प्रारूप में संग्रहीत और दूसरा जेएसओएन प्रारूप में संग्रहीत। डिफ़ॉल्ट रूप से, परिणामी अभिलेखागार उसी फ़ाइल में सहेजे गए थे जिसमें से प्रारंभिक छवि लोड की गई थी (चित्रा 7)।
चित्रा 7: छवि तैयारी: सुधार कदम। छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में तैयारी के लिए एक छवि लोड करने के लिए, इनपुट फलक (काला तीर) में फ़ाइल आइकन पर क्लिक करें और छवि का चयन करें। डिफ़ॉल्ट सुधार प्रक्रिया लागू करने के लिए, इनपुट फलक (लाल तीर) में फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करें। अद्यतन, सही छवि को सहेजने के लिए, आउटपुट फलक पर फ़्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
छवि तैयार करने का दूसरा चरण फ़िल्टरिंग है, जिसे सॉफ़्टवेयर में ऊपरी टैब पर चुना जा सकता है। हमने इनपुट फलक पर सही छवि का चयन किया। इस चरण में, फ़िल्टरिंग पैरामीटर के रूप में स्वचालित वोरोनोई टेसेलेशन का उपयोग किया गया था। इनपुट पैनल पर फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करने से स्वचालित रूप से चयनित फ़िल्टर सभी चैनलों पर लागू होता है। दोनों छवि तैयारी चरणों (सुधार और फ़िल्टरिंग) में, प्रसंस्करण से पहले और बाद में प्रत्येक चैनल की छवियां और सिग्नल अंतर स्क्रीन के दाईं ओर प्रदर्शित होते हैं।
आइसोबेरिक सुधार चरण के समान, दो नए अभिलेखागार, एक टीआईएफएफ में और एक जेएसओएन प्रारूप में, उत्पन्न किए गए थे। इस चरण में, फ़ाइल नाम के बाद प्रत्यय -फ़िल्टर किया गया था। इसलिए, प्राप्त अंतिम छवि को मासकरेक्टेड-फ़िल्टर्ड.tiff नाम दिया गया था। इन चरणों को पूरा करके, हमने पसंदीदा डिजिटल पैथोलॉजी सॉफ्टवेयर (चित्रा 8 और चित्रा 9) का उपयोग करके विश्लेषण के लिए छवि तैयार की। इस तकनीक का उपयोग करके, हम एंटीबॉडी पैनल में सभी 23 मार्करों का विश्लेषण करने में सक्षम थे, जिसमें एक एकल ऊतक अनुभाग में उपकोशिकीय स्तर पर चैनलों के बीच न्यूनतम हस्तक्षेप था।
चित्रा 8: छवि तैयारी: फ़िल्टरिंग चरण। छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में ऊपरी टैब (काला तीर) में फ़िल्टरिंग का चयन करें। फ़िल्टरिंग पैरामीटर्स के तहत, इच्छित विधि (हरा तीर) का चयन करें। इनपुट फलक पर, बड़े पैमाने पर सुधारित छवि का चयन करें। छवि पर चयनित प्रक्रिया लागू करने के लिए, इनपुट फलक (लाल तीर) पर फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करें। अद्यतन फ़िल्टर की गई छवि को सहेजने के लिए, आउटपुट फलक पर फ़्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 9: छवि तैयार करने से पहले और बाद में धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। (ए) इस तकनीक का उपयोग करके दाग वाले टॉन्सिल ऊतक अनुभाग की छवि और फ़िल्टरिंग और सुधार से पहले तीसरे पक्ष के डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके कल्पना की गई। (बी) फ़िल्टरिंग और सुधार चरणों के बाद समान शर्तों के तहत एक ही अनुभाग की छवि। सीडी 20 को पीले रंग में दिखाया गया है, केआई 67 को मैजेंटा में दिखाया गया है, सीडी 3 को सफेद रंग में दिखाया गया है, सीडी 11 सी को हरे रंग में दिखाया गया है, साइटोकेरेटिन को सियान में दिखाया गया है, और डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) को नीले रंग में दिखाया गया है। आवर्धन, 200x. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: एंटीबॉडी पैनल सूची। प्रत्येक एंटीबॉडी को सूचीबद्ध के रूप में एक अलग द्रव्यमान के साथ एक विशिष्ट धातु आइसोटोप के लिए संयुग्मित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एक टीएमई के कई घटकों के बीच जटिल, जटिल बातचीत का व्यापक स्पष्टीकरण कैंसर अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण उद्देश्य बना हुआ है। निर्माताओं ने इस प्रयास के हिस्से के रूप में कई मल्टीप्लेक्स परख पेश किए हैं, खासकर पिछले 5 वर्षों में। मल्टीप्लेक्स स्थानिक विश्लेषण एक बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण है जो ट्यूमर के नमूनों में संरचनात्मक आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हुए कई लक्ष्यों के एक साथ वर्गीकरण की सुविधा प्रदान करता है। स्थानिक विश्लेषण तकनीकों को प्रतिदीप्ति इमेजिंग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे कियहां वर्णित तकनीक 11,12,13।
धुंधला होने से पहले, धुंधला प्रोटोकॉल के बाद एक नियमित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल का उपयोग करके एंटीबॉडी अनुकूलन एंटीबॉडी धुंधला प्रजनन क्षमता को मानकीकृत करने के लिए आवश्यक है। एक बहुत प्रसिद्ध तथ्य यह है कि विभिन्न नियमित एंटीबॉडी क्लोन में विभिन्न परिस्थितियों में इष्टतम अभिव्यक्ति हो सकती है। हालांकि, धातु टैग के साथ एंटीबॉडी को संयुग्मित करने के लिए, वाहक मुक्त एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, जैसा कि पैनल में एकीकृत सभी एंटीबॉडी के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए एक ही पीएच को परिभाषित कर रहा है, जो इस पद्धति का एक दोष है। इस चरण को पूरा करने में विफलता के परिणामस्वरूप निम्न-गुणवत्ता वाली छवियां हो सकती हैं जिनका सफलतापूर्वक विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोगों में से सर्वोत्तम अच्छी तरह से मान्य, विश्वसनीय एंटीबॉडी का चयन करने के लिए चिकित्सा साहित्य और एंटीबॉडी निर्माताओं की वेबसाइटों की जांच के लिए समय समर्पित करना अनिवार्य है। एंटीबॉडी और पैनलों को मान्य करते समय, छोटे पैनलों का निर्माण उपयोगी होता है। यह संभावित चैनल हस्तक्षेपों की पहचान करने और मार्करों की सही अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने में मदद करता है।
इस तकनीक की विशिष्ट विशेषताओं में से एक एकल ऊतक अनुभाग पर 40 धातु-लेबल वाले एंटीबॉडी का अध्ययन करने की क्षमता है। अत्यधिक फायदेमंद होने के बावजूद, धातु-लेबल वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक चुनौतीपूर्ण धातु हस्तक्षेपों के अधीन हैं, जैसे कि आइसोबेरिक हस्तक्षेप। आइसोबेरिक हस्तक्षेप धातु-लेबलिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों की विशेषता है और समान या बहुत समान द्रव्यमान के आइसोटोप के अस्तित्व का परिणाम है जिसका द्रव्यमान में अंतर द्रव्यमान विश्लेषक का पता लगाने की क्षमता से छोटा है। ये हस्तक्षेप आइसोटोपिक संदूषण या पॉलीएटोमिक प्रजातियों के कारण हो सकते हैं। समस्थानिक संदूषण एक तत्व की शुद्धता को संदर्भित करता है। प्रकृति में, अधिकांश तत्व आइसोटोप के मिश्रण में मौजूद होते हैं। संवर्धन के अधीन होने पर भी, 100% शुद्धता प्राप्त नहीं की जा सकती है। इसके परिणामस्वरूप एक ही द्रव्यमान वाले एक से अधिक तत्व होते हैं और चैनलों के बीच क्रॉस-टॉक पैदा करते हैं। 40 उपलब्ध धातु समस्थानिकों की औसत शुद्धता 98% है। पॉलीएटोमिक प्रजातियों के कारण हस्तक्षेप मुक्त धातु बंधन से नकारात्मक रूप से चार्ज की गई प्रजातियों जैसे हाइड्राइड, कार्बाइड, नाइट्राइड, ऑक्साइड, हाइड्रॉक्साइड और साइनाइड से उत्पन्न होते हैं, जो धातु टैग के अंतिम द्रव्यमान में +1 से +26 तक जोड़ते हैं। संभावित शोर स्रोतों को कम करने के लिए रणनीतियों का विकास अच्छा धुंधला और इमेजिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। पैनल निर्माण में पहला आवश्यक कदम सावधान धातु आइसोटोप-एंटीबॉडी असाइनमेंट है। मार्कर जो आम तौर पर ऊतक वर्गों में व्यापक होते हैं, जैसे कि साइटोकेरेटिन और सीडी 45, पॉलीएटोमिक हस्तक्षेप के प्रभाव को कम करने के लिए उच्च द्रव्यमान ( 160जीडी से अधिक) के साथ धातु आइसोटोप के लिए संयुग्मित किया जाना चाहिए, और अल्प मार्करों को 140सीई से 160जीडी तक के द्रव्यमान वाले आइसोटोप में संयुग्मित किया जाना चाहिए। हालांकि, धातु और मार्करों के सावधानीपूर्वक प्लेसमेंट के साथ, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आगे की छवि प्रसंस्करण के साथ अवशिष्ट हस्तक्षेप के प्रभाव को कम किया जा सकता है।
पूरक प्रक्रियाओं को ऊतक काटने और धुंधला होने में नमूनों के धातु संदूषण को कम करने के लिए भी नियोजित किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है, पानी के स्नान में आसुत जल याडीआईएच 2ओ का उपयोग इस संदूषण को रोकता है। इसी तरह, धुंधला होने में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक धातु मुक्त होने चाहिए। एक उपयोगी टिप कांच के कंटेनरों में अभिकर्मकों को संग्रहीत करने से बचना है, क्योंकि कांच के बने पदार्थ धातु संदूषण की सुविधा प्रदान करते हैं। इष्टतम समग्र परिणाम प्राप्त करने के लिए, धुंधला चरण में, हम स्लाइड्स के ऊतक वर्गों के अच्छे पालन को सुरक्षित करने के लिए रात भर बेकिंग स्लाइड की सलाह देते हैं।
अन्य मल्टीप्लेक्स विधियों के विपरीत, यह विधि एफएफपीई नमूनों14 का उपयोग करती है। संयुक्त फॉर्मलिन निर्धारण और पैराफिन एम्बेडिंग नमूना संरक्षण और तैयारी का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला रूप बना हुआ है। संग्रहीत ब्लॉकों का उपयोग पूर्वव्यापी अनुसंधान सहित ताजा जमे हुए नमूनों के उपयोग की तुलना में अधिक व्यापक अध्ययन के प्रदर्शन की अनुमति देता है, और इसकी लागत कम है। यह विधि पूरे स्लाइड इमेजिंग और स्लाइड रीस्कैनिंग के लिए भी अनुमति देती है। यह स्लाइड के केवल कुछ हिस्सों का चयन करने की तुलना में विश्लेषण के व्यापक क्षेत्र को कैप्चर करता है और कई आवर्धन पर स्कैनिंग को सक्षम बनाता है।
इस तकनीक में साधन की कीमत और निर्माताओं से सीधे सोने की लेपित स्लाइड जैसी सामग्री खरीदने की आवश्यकता से संबंधित सीमाएं हैं। अनकोटेड स्लाइड्स का उपयोग करने का प्रयास, सोने के अलावा किसी अन्य सामग्री के साथ लेपित स्लाइड, या निर्माताओं के अलावा अन्य कंपनियों से प्राप्त स्लाइड के परिणामस्वरूप कोई सिग्नल अधिग्रहण और व्यापक सिग्नल हस्तक्षेप नहीं हो सकता है और अंततः, साधन को नुकसान पहुंचा सकता है।
इस पद्धति का एक और महत्वपूर्ण दोष विश्लेषण के लिए विशिष्ट सॉफ़्टवेयर की अनुपस्थिति है। यह विधि टीआईएफएफ प्रारूप में छवियां उत्पन्न करती है, जिसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और इसे आसानी से तृतीय-पक्ष डिजिटल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर अपलोड किया जा सकता है। कम्प्यूटेशनल पैथोलॉजी सॉफ्टवेयर टूल व्यापक विश्लेषण को सक्षम करते हैं, जिसमें ऊतक कंपार्टमेंटलाइजेशन, सेल विभाजन, किसी भी सेलुलर डिब्बे में मार्कर परिमाणीकरण और निकटतम पड़ोसी और निकटता विश्लेषण शामिल हैं। उपयोग के लिए एक तृतीय-पक्ष डिजिटल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्राप्त करना, पहले से ही महंगी तकनीक15,16 की लागत को बढ़ाता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
लेखक इस लेख को संपादित करने के लिए संपादन सेवाओं, एमडी एंडरसन में रिसर्च मेडिकल लाइब्रेरी और एमडी एंडरसन में ट्रांसलेशनल मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी विभाग में मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला से डॉन नॉरवुड को स्वीकार करते हैं। इस प्रकाशन के परिणामस्वरूप टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर कैंसर इम्यून मॉनिटरिंग एंड एनालिसिस सेंटर (सीआईएएमएसी) को नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (एनसीआई) सहकारी समझौते (यू 24 सीए 224285) के माध्यम से प्रदान किए गए कैंसर इम्यून मॉनिटरिंग एंड एनालिसिस सेंटर-कैंसर इम्यूनोलॉजिकल डेटा कॉमन्स नेटवर्क (सीआईएएमएसी-सीआईडीसी) के लिए वैज्ञानिक और वित्तीय सहायता द्वारा सुविधाजनक अनुसंधान का हिस्सा था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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