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Biochemistry

विट्रो में कैल्शियम जमाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जैविक-आधारित विधि

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/64029
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

कार्डियोवैस्कुलर बीमारी दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है। संवहनी कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर रुग्णता और मृत्यु दर के बोझ में काफी योगदान देता है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा विट्रो में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिका-मध्यस्थता कैल्शियम वर्षा को निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है।

Abstract

संवहनी कैल्सीफिकेशन में अपक्षयी विकृति की एक श्रृंखला शामिल है, जिसमें सूजन, सेलुलर फेनोटाइप में परिवर्तन, कोशिका मृत्यु और कैल्सीफिकेशन अवरोधकों की अनुपस्थिति शामिल है, जो सहवर्ती रूप से पोत लोच और कार्य के नुकसान का कारण बनती है। संवहनी कैल्सीफिकेशन क्रोनिक किडनी रोग, मधुमेह मेलेटस और एथेरोस्क्लेरोसिस सहित कई विकृतियों में रुग्णता और मृत्यु दर में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है। संवहनी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए वर्तमान शोध मॉडल सीमित हैं और विवो में कैल्सीफिकेशन विकास के अंतिम चरणों में केवल व्यवहार्य हैं। संवहनी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो उपकरण अंत-बिंदु माप का उपयोग करते हैं, जैविक सामग्री पर मांग बढ़ाते हैं और अनुसंधान अध्ययनों के लिए परिवर्तनशीलता की शुरूआत का जोखिम उठाते हैं। हम एक नए फ्लोरोसेंटली लेबल जांच के आवेदन का प्रदर्शन करते हैं जो मानव संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं पर इन विट्रो कैल्सीफिकेशन विकास को बांधता है और इन विट्रो कैल्सीफिकेशन के वास्तविक समय के विकास को निर्धारित करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम अपने नए विकसित कैल्सीफिकेशन परख के आवेदन का वर्णन करते हैं, जो रोग मॉडलिंग में एक नया उपकरण है जिसमें संभावित ट्रांसलेशनल अनुप्रयोग हैं। हम इस परख को खनिज निक्षेपण अनुसंधान के व्यापक स्पेक्ट्रम में प्रासंगिक मानते हैं, जिसमें हड्डी, उपास्थि या दंत चिकित्सा अनुसंधान में अनुप्रयोग शामिल हैं।

Introduction

संवहनी कैल्सीफिकेशन (वीसी) कार्डियोवैस्कुलर रुग्णता और मृत्यु दर 1,2,3 के लिए एक स्वतंत्र जोखिम कारक है। लंबे समय से अस्थानिक खनिज जमाव की एक निष्क्रिय रासायनिक प्रक्रिया माना जाता है, अब यह एक परिवर्तनीय ऊतक उपचार प्रतिक्रिया दिखाई देता है जिसमें रोग 4,5 के चालक के रूप में सक्रिय संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एचवीएसएमसी) सहित विभिन्न कोशिकाओं का सक्रिय योगदान शामिल है। विवो में वीसी को एथेरोस्क्लेरोटिक बोझ 6,7,8 के आकलन के रूप में मल्टीस्लाइस सीटी स्कैन द्वारा मापा जा सकता है। वर्तमान में, एक प्रतिमान बदलाव चल रहा है, जिसमें वीसी गंभीरता कार्डियोवैस्कुलर बीमारी, टाइप 2 मधुमेह, क्रोनिक किडनी रोग और 9,10,11,12,13,14,15 की उम्र में जोखिम कारक के रूप में मान्यता प्राप्त हो रही है।

एचवीएसएमसी कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार हैं और वीसी के विकास में एक प्रमुख अभिनेता हैं। इन विट्रो एचवीएसएमसी-प्रेरित कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर बीमारी16,17 का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला रोग मॉडल है। हालांकि, इन विट्रो कैल्सीफिकेशन का पता लगाने के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल अंत-बिंदु माप का उपयोग करते हैं जो डेटा अधिग्रहण को सीमित कर सकते हैं, सेलुलर सामग्री के अधिक उपयोग की आवश्यकता होती है, और अनुसंधान को धीमा कर सकते हैं। इन विट्रो एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन का पता लगाने के लिए सामान्य तरीकों में ओ-क्रेसोल्थेलिन परख शामिल है, जो कुल प्रोटीन के खिलाफ घुलनशील कैल्शियम जमाव को मापता है और सेल लाइसिस18 की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एलिज़ारिन लाल धुंधला का उपयोग किया जाता है, जो निश्चित कोशिकाओं या ऊतक19 पर कैल्शियम जमा को सीधे बांधता है। ओ-क्रेसोलफथेलिन या एलिजारिन रेड के साथ समय के साथ एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए प्रति समय बिंदु प्रतिकृति के बैचों की आवश्यकता होती है, जिससे जैविक सामग्री की मांग बढ़ जाती है, और बदले में, परिवर्तनशीलता की संभावना बढ़ जाती है।

इस पेपर में, हम एक नई परख के आवेदन के लिए विधि का विस्तार करते हैं जो इन विट्रो वीसी प्रगति को निर्धारित करने के साथ-साथ एक विलक्षण अंत-चरण कैल्सीफिकेशन परख के रूप में कार्य करने के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग जांच के साथ एचवीएसएमसी का उपयोग करता है। हमने पहले प्रदर्शित किया था कि यह परख सीधे ओ-क्रेसोलफ्थेलिन और एलिज़रिन रेड विधियों के साथ तुलनीय है और इसका उपयोग अलग-अलग संस्कृति स्थितियों के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकताहै। वास्तविक समय माप के अलावा, इस परख का उपयोग नैदानिक वीसी विकास20 के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में सीरम या प्लाज्मा नमूनों की प्रवृत्ति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह कार्डियोवैस्कुलर विज्ञान और रोग मॉडलिंग की जैविक रणनीतियों के आवेदन में सहायता करेगा। परख का एक और अनुप्रयोग सीरम या प्लाज्मा जैसे रक्त घटकों से वीसी गंभीरता या प्रगति का आकलन करने के लिए एक ट्रांसलेशनल बायोहाइब्रिड सिस्टम के रूप में हो सकता है।

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Protocol

1. सेल सीडिंग, रखरखाव और कैल्सीफिकेशन प्रेरण

  1. प्राथमिक कोशिकाओं की खेती के लिए, एक लामिनार एयरफ्लो कैबिनेट, दस्ताने और बाँझ उपकरण का उपयोग करें। किसी भी काम को करने से पहले और बाद में हाथों और कार्यक्षेत्र को कीटाणुरहित करें। सभी प्राथमिक कोशिकाओं और संस्कृति मीडिया को एक संभावित बायोहाजार्ड के रूप में मानें, जब तक कि अन्यथा साबित न हो। अधिमानतः निपटान से पहले अधिशेष कोशिकाओं और मीडिया को ऑटोक्लेव करें। रासायनिक रूप से निष्क्रिय और आटोक्लेव न करें क्योंकि यह विषाक्त धुएं को मुक्त करेगा।
  2. बिना लेपित सेल कल्चर प्लेटों पर संस्कृति एचवीएसएमसी।
  3. नियमित रूप से एचवीएसएमसी को विकास माध्यम में बनाए रखें जिसमें एम 199 माध्यम शामिल है, जो 10% -20% एफबीएस और 1% पेन / स्ट्रेप के साथ पूरक है और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करता है।
  4. कोशिकाओं को 70% -90% कंफ्लुएंसी पर विभाजित करें।
    1. विभाजित करने के लिए, एचवीएसएमसी 2 एक्स को पीबीएस के साथ धो लें। ट्रिप्सिन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की टुकड़ी की जांच करें।
    2. सीरम युक्त माध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को रोकें। कोशिकाओं को 4 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और रखरखाव माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें। एचवीएसएमसी 1: 2 विभाजन योजना का पालन करते हैं।
  5. कैल्सीफिकेशन प्रयोग शुरू करने के लिए, कोशिकाओं को विभाजन के निर्देशों का पालन करते हुए तैयार करें (चरण 1.4.1)। पुन: निलंबन पर, कोशिकाओं और बीज को 10-15 x 103 कोशिकाओं / सेमी 2 घनत्व पर 48-वेल प्लेट मेंगिनें। बाहरी कुओं के उपयोग से बचने वाली कोशिकाओं को बीज दें, जैसा कि पूरक चित्र 1 में अनुशंसित है।
  6. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करते समय24 घंटे (रात भर) तक पालन और पुनर्प्राप्त करने दें।
  7. धीरे से पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 2x धोएं, दूसरे धोने के बाद शेष सभी पीबीएस को सावधानीपूर्वकसुखाएं ।
  8. धीरे से कैल्सीफिकेशन माध्यम जोड़ें और आगे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। कैल्सीफिकेशन माध्यम में कैल्सीफिकेशन उत्तेजना, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले फेटुइन-ए (उदाहरण के लिए, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन [आरएफपी]) (1 μg / mL) और HOECHST 33342 (0.1 μg / mL) परमाणु दाग या इसी तरह के लाइव फ्लोरोसेंट परमाणु दाग शामिल होने चाहिए। DAPI का उपयोग न करें, क्योंकि यह गैर-पारगम्य है।
  9. कैल्सीफिकेशन होने तक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ दैनिक जांच करें।
    नोट: एचवीएमएससी के सेल संस्कृति और रखरखाव पर नोट्स के लिए, कृपया पूरक फ़ाइल 1 देखें।

2. इमेजिंग के माध्यम से कैल्सीफिकेशन का पता लगाना

नोट: निम्न प्रोटोकॉल तैयारी, इमेजिंग और डेटा विश्लेषण में उठाए जाने वाले सामान्य कदम प्रदान करता है। स्वचालित इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म और संबंधित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक चरण के लिए निर्देशों का समर्थन करने वाले स्क्रीनशॉट (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) पूरक फ़ाइल 2 और पूरक फ़ाइल 3 में प्रदान किए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए अन्य इमेजिंग उपकरणों और छवि प्रसंस्करण उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, सार्थक डेटा अधिग्रहण के लिए प्रत्येक कुएं में एक ही स्थान पर बार-बार इमेजिंग महत्वपूर्ण है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक इमेजिंग चरण पर कैल्सीफिकेशन और पुन: उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल बनाना आवश्यक है। पहली बार विधि को लागू करते समय, इमेजिंग से पहले तैयार करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।

  1. प्रोटोकॉल सेटअप
    1. सॉफ़्टवेयर खोलें, और उसके बाद प्रोटोकॉल का चयन करें और नया बनाएँ।
    2. प्रक्रिया का चयन करें और तापमान सेट करें क्लिक करें. पॉप-अप विंडो में, तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और ढाल को 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और ओके पर क्लिक करें। ड्रॉपडाउन मेनू से पसंद के प्लेट प्रकार का चयन करें। छवि क्लिक करके इमेजिंग चरण जोड़ें। उल्टे इमेजर का चयन करें, और ठीक क्लिक करें।
    3. तीन इमेजिंग चैनल जोड़ें और उन्हें DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm), और Brightfield पर सेट करें। मोंटेज बॉक्स पर टिक करें और छवियों की वांछित संख्या और स्थान सेट करें। 48-वेल प्लेट के लिए 2 x 2 एक आम विकल्प है। प्रत्येक कुएं के बेहतर कवरेज का प्रतिनिधित्व करने के लिए ओवरलैप को बदलें। चयन करें कि किन कुओं को चित्रित किया जाना है। एक नई विंडो खुलेगी जहां रुचि के कुओं का चयन किया जा सकता है।
    4. फ़ोकस मोड सेट करने के लिए फ़ोकस विकल्प क्लिक करें. एक नई विंडो खुलेगी। प्रत्येक चैनल को अलग-अलग सेट करें। आमतौर पर, कुओं को "DAPI" चैनल पर ऑटोफोकस किया जाता है। अन्य सभी चैनलों को पहले चैनल से निश्चित फोकल ऊंचाई पर सेट करें और ओके पर क्लिक करके सेट करें। विंडो बंद करें।
    5. डेटा रिडक्शन क्लिक करके डेटा रिडक्शन चरणों को पूर्व-सेटिंग प्रारंभ करें और छवि प्रीप्रोसेसिंग का चयन करें. इस चरण को स्थापित करने से प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि कम हो जाती है। OK का चयन करके डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स स्वीकार करें. छवियों का एक नया सेट "टीएसएफ" उपसर्ग के साथ बनाया जाएगा। मूल छवियों को संरक्षित किया जाएगा।
    6. सेलुलर विश्लेषण का चयन करके कक्षों की गणना करने के लिए एक कदम सेट करें। चैनल ड्रॉपडाउन मेनू से TSF DAPI छवियों का चयन करें। इमेजिंग किए जाने के बाद आगे के विवरण सेट करें। इस कदम को डेटा कटौती भी माना जा सकता है; हमेशा मूल छवियों को रखना सुनिश्चित करें।
    7. सांख्यिकी का चयन करके आरएफपी (कैल्सीफिकेशन) संकेत का विश्लेषण तैयार करें। पॉप-अप विंडो में, चरण लेबल करें और इनपुट चैनल के रूप में टीएसएफ आरएफपी का चयन करें। ऊपरी मान और निम्न मान बॉक्स को टिक करें. निम्न सूची में कुल क्षेत्र के लिए बॉक्स को टिक करें। रंग प्रभाव स्तंभ में कोई नहीं चुनें. पॉप-अप विंडो में, कस्टम क्लिक करें और पृष्ठभूमि बॉक्स में टिक करें. यह आसान मूल्यांकन के लिए परिणामों को कम-उच्च से रंग देगा। ठीक दबाएँ.
    8. एक उचित रीडआउट के लिए, प्रति सेल आरएफपी सिग्नल को सामान्य करें। ऐसा करने में, प्रति सेल कुल क्षेत्र विभाजित होता है। इस चरण को सेट करने के लिए, बाईं ओर अनुपात दबाएँ। पॉप-अप विंडो में, डेटा इनपुट 1 आरएफपी परिमाणीकरण के लिए चुनें: ड्रॉप-डाउन मेनू से कुल क्षेत्र। इसके अलावा डेटा इनपुट 2 के रूप में सेल काउंट का चयन करें।
    9. अंत में, एक नया डेटा सेट नाम चुनें और ठीक और ठीक फिर से दबाएं। पहले वर्णित रंग प्रभाव का चयन करें. ऊपरी-बाएँ कोने में, फ़ाइल का चयन करें और फ़ाइल को प्रोटोकॉल (.prt फ़ाइल प्रकार) के रूप में सहेजें.
  2. पहले कैल्सीफिकेशन के बाद दैनिक
    1. हर बार बिंदु के लिए, इन चरणों को दोहराएं। स्टार्टअप सॉफ़्टवेयर में, अभी पढ़ें और मौजूदा प्रोटोकॉल दबाएँ ...। पिछले चरण में बनाए गए प्रोटोकॉल का चयन करें। कार्यक्रम प्रयोग को बचाने के लिए कहेगा। यह इस चरण में किया जा सकता है, लेकिन ऊपरी बाईं ओर सहेजें बटन पर क्लिक करके मैन्युअल रूप से किसी भी बाद के चरण में भी किया जा सकता है।
    2. एक पॉप-अप विंडो सिस्टम के गर्म होने का इंतजार करने के लिए कहेगी। सीओ2 गैस नियंत्रक चालू करें और इसे 5% पर सेट करें।
    3. एक बार सिस्टम निर्धारित तापमान तक पहुंचने के बाद, एक प्लेट डालने और पढ़ने के लिए एक संकेत दिखाई देगा। रद्द करें दबाएँ. ऐसा इसलिए है, क्योंकि प्रत्येक समय बिंदु के लिए, प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के जोखिम को व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया जाना चाहिए।
    4. प्लेट को इनक्यूबेटर से इमेजर तक एक सुरक्षित बॉक्स में ले जाएं जो टूटने और फैलने का विरोध करता है और दुर्घटना के मामले में जीवित कोशिकाओं के परिवहन के लिए स्थानीय जैव सुरक्षा नियमों के अनुरूप है। प्लेट को प्लेट रीडर में रखें।
    5. रद्द करने के बाद, प्रक्रिया पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में, प्री-सेट इमेजिंग चरण का चयन करें। पहले DAPI चैनल पर फ़ोकस और एक्सपोज़र समायोजित करें। सभी चैनलों पर ऑटो एक्सपोजर बॉक्स को खोल दें। फिर, DAPI चैनल के बगल में माइक्रोस्कोप आइकन क्लिक करें। एक नई विंडो खुलेगी।
    6. ध्यान केंद्रित करने के लिए कुएं का चयन करें। इस चरण के लिए मध्यम से उच्च कैल्सीफिकेशन वाले कुएं का उपयोग करें। यदि कोई सिग्नल पहले से ही दिखाई दे रहा है, तो पहले ऑटोफोकस और फिर ऑटोएक्सपोज़र पर क्लिक करें। यदि नहीं, तो पहले एक्सपोजर बढ़ाएं और ऑटोफोकस और ऑटोएक्सपोजर को दोहराएं। यदि वांछित हो, तो एक्सपोज़र ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करके एक्सपोज़र को मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है। कई कुओं पर सेटिंग्स की जांच करें। एक बार संतुष्ट होने के बाद, सेटिंग्स को सहेजें।
    7. सभी चैनलों के लिए एक ही तरीके से एक्सपोजर समायोजित करें।
      चेतावनी: अन्य चैनलों पर ध्यान केंद्रित न करें; केवल एक्सपोजर समायोजित करें। फोकस प्लेन सभी चैनलों के लिए समान होना चाहिए।
    8. कार्यविधि विंडो बंद करें। शीर्ष कार्य पट्टी में हरे रंग के रीड नाउ बटन का चयन करें। सॉफ़्टवेयर द्वारा बताए गए प्रयोग को सहेजें.
      नोट: सॉफ्टवेयर अब स्वचालित रूप से चयनित सेटिंग्स में सभी चयनित कुओं को पढ़ लेगा।

3. डेटा विश्लेषण

नोट: स्वचालित इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म और संबंधित छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करने के तरीके पर विस्तृत स्क्रीनशॉट के लिए (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें), कृपया पूरक फ़ाइल 4 देखें। वैकल्पिक इमेजिंग उपकरणों या विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय, छवियों को निर्यात और बैच संसाधित किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि तुलनात्मक डेटा सेट में सभी छवियों के लिए एक्सपोज़र, फ्लोरेसेंस थ्रेशोल्ड या तीव्रता समान रूप से समायोजित की जाती है।

  1. जबकि सिस्टम प्लेट पढ़ता है, सभी छवियां स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि में संसाधित होती हैं। प्रदर्शित करने के लिए TSF DAPI छवियों का चयन करके सेल गणना के लिए सेटिंग्स समायोजित करें। डबल-क्लिक करके पसंद के कुएं का चयन करें। एक नई विंडो पॉप अप होगी। चित्रों में से किसी एक का चयन करें.
  2. विश्लेषण टैब का चयन करें। पॉप-अप विंडो में, सेलुलर विश्लेषण का चयन करें: सेल काउंट। ठीक क्लिक करें. आरएफपी और ब्राइटफील्ड चैनलों का चयन करें। हाइलाइट ऑब्जेक्ट्स बॉक्स में टिक करें।
  3. मेनू खोलने के लिए विकल्प क्लिक करें. सभी नाभिकों को शामिल करने के लिए आकार और तीव्रता सीमा को समायोजित करें लेकिन मलबे को बाहर रखें। ठीक क्लिक करें. सेटिंग्स को अन्य सभी छवियों में स्थानांतरित करने के लिए निचले बाईं ओर परिवर्तन लागू करें पर क्लिक करें ।
  4. पहले की तरह ही, सिग्नल-टू-शोर अनुपात को सर्वोत्तम रूप से समायोजित करने के लिए कैल्सीफिकेशन की मध्यम से उच्च मात्रा के साथ एक कुएं और छवि का चयन करें; कार्य मेनू में विश्लेषण टैब क्लिक करें।
    1. इस बार छवि सांख्यिकी का चयन करें। DAPI और Brightfield चैनल का चयन करें। मेनू खोलने के लिए विकल्प क्लिक करें. बॉक्स थ्रेशोल्ड आउटलायर्स पर टिक करें। दहलीज के ऊपरी और निचले मान समायोजित करें। केवल संकेत की गणना करें यदि यह पृष्ठभूमि से ऊपर है और यदि मलबे / कलाकृतियां हैं तो बाहर करें।
    2. पृष्ठभूमि के ऊपर सिग्नल के लिए एक गैर-व्यक्तिपरक दहलीज मान सेट करने के लिए, कार्य पट्टी से लाइन टूल का चयन करें। एक खिड़की पॉप अप होगी। सिग्नल के पैच के माध्यम से एक रेखा खींचें, लेकिन पृष्ठभूमि के एक क्षेत्र को भी शामिल करना सुनिश्चित करें।
      नोट: पॉप-अप विंडो में एक ग्राफ दिखाई देगा, जो पृष्ठभूमि रेखा के ऊपर सिग्नल का प्रतिनिधित्व करने वाला एक शिखर दिखाएगा। 25% शिखर ऊंचाई मान अनुशंसित सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। सही सीमा के चयन को सुनिश्चित करने के लिए कई सिग्नल पैच को मापने की भी सिफारिश की जाती है। सिग्नल के पैच का चयन करते समय, बहुत अधिक सिग्नल ताकत वाले क्षेत्रों का चयन करने से एक सीमा हो सकती है जो मध्यम और या निचले संकेतों की उपेक्षा करती है। इसलिए, पृष्ठभूमि के ऊपर मध्यम से निम्न सिग्नल के पैच का चयन करने की सिफारिश की जाती है। बहुत अधिक, बहुत कम और सटीक थ्रेसहोल्ड के उदाहरण पूरक फ़ाइल 4 में दिखाए गए हैं।
    3. संतुष्ट होने के बाद, सेटिंग्स को अन्य सभी कुओं में स्थानांतरित करने के लिए ठीक और परिवर्तन लागू करें पर क्लिक करें । जांचें कि क्या अन्य कुओं में दहलीज का सही चयन किया गया है।
  5. एक बार सेल गिनती और आरएफपी थ्रेसहोल्ड सेट हो जाने के बाद, डेटा निर्यात करें। रुचि की प्लेट का चयन करें। ड्रॉप-डाउन मेनू में, निर्यात के लिए कई पैरामीटर चुने जा सकते हैं। प्रासंगिकता सेल गिनती, आरएफपी क्षेत्र और "क्षेत्र / सेल" हो सकती है जो समूहों के बीच तुलना के लिए उपयोग की जाने वाली मीट्रिक है। डेटा को सीधे स्प्रेडशीट में निर्यात करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू के बगल में एक्सेल बटन पर क्लिक करें।
    नोट: ड्रॉपडाउन मेनू में, सेल गिनती के लिए गणना किए गए मान, आरएफपी सिग्नल का कुल क्षेत्र (कैल्सीफिकेशन के क्षेत्र को दर्शाते हुए), साथ ही प्रति सेल आरएफपी सिग्नल के कुल क्षेत्र के सामान्यीकृत अनुपात को अब व्यक्तिगत रूप से चुना जा सकता है और स्प्रेडशीट में निर्यात किया जा सकता है। परिणामों को प्रति सेल आरएफपी सिग्नल के कुल क्षेत्रफल के अनुपात के रूप में प्रदर्शित करें और विज़ुअलाइज़ करें (उदाहरण के लिए, बार ग्राफ़)। एक ही समय बिंदु पर विभिन्न समूहों की तुलना करने के लिए दो समूहों या एक अप्रकाशित एनोवा की तुलना करने के लिए एक अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट को लागू करें। अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक ही समूह की तुलना करने के लिए युग्मित सांख्यिकीय विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है।

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Representative Results

परिणाम में होचएसटी-दाग वाले नाभिक, आरएफपी-लेबल कैल्सीफिकेशन और ब्राइटफील्ड छवियों की मूल छवियां शामिल हैं। कैल्सीफिकेशन के विभिन्न चरणों का पता लगाया जा सकता है जो निम्न (चित्रा 2) से लेकर उच्च (चित्रा 3) तक होते हैं और उनका विश्लेषण किया जा सकता है। कैल्सीफिकेशन को आमतौर पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 डी और चित्रा 3 बी, तीर कैल्सीफिकेशन का संकेत देते हैं) का उपयोग करके काले धब्बे के रूप में देखा जा सकता है, जो प्राथमिक मूल्यांकन के लिए उपयोगी होते हैं और यह निर्धारित करने के लिए कि इमेजिंग कब शुरू करनी है। बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए, संसाधित आरएफपी छवियों का विश्लेषण कैल्सीफिकेशन को मापने के लिए किया जाना चाहिए (चित्रा 2 एफ और चित्रा 3 डी, तीर कैल्सीफिकेशन का संकेत देते हैं)। अंत में, डेटा को एक बार ग्राफ के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है, जो प्रतिनिधि छवियों (चित्रा 4 ए, बी, सी) के साथ एक समय बिंदु पर दो या अधिक स्थितियों की तुलना करता है। डेटा को सेल गिनती के लिए सामान्यीकृत प्रदर्शित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, प्रति सेल कैल्सीफिकेशन क्षेत्र के रूप में)। डेटा को समय-श्रृंखला डेटा के रूप में भी प्रदर्शित किया जा सकता है जो विभिन्न समय बिंदुओं (चित्रा 4 डी) पर एक ही स्थिति दिखाता है।

Figure 1
चित्र 1: अर्ध-स्वचालित कैल्सीफिकेशन का पता लगाने और विश्लेषण के चरणों का सारांश देते हुए दृश्य सार. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रारंभिक चरण कैल्सीफिकेशन का उदाहरण। (A) ओवरले छवि को (B) अलग DAPI (नाभिक), (C) RFP (कैल्सीफिकेशन), और (D) ब्राइटफील्ड छवियों के रूप में प्रदर्शित और विश्लेषण किया जा सकता है। (ई) नाभिक को सॉफ्टवेयर द्वारा पहचाना जाता है और सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए पीले सर्कल के रूप में हाइलाइट किया जा सकता है। (एफ) आरएफपी सिग्नल के विश्लेषण के लिए, पृष्ठभूमि सिग्नल को कम करने के लिए छवियों को पूर्व-संसाधित किया जाता है और, (जी) बाद में, सिग्नल को मापने के लिए एक सीमा निर्धारित की जा सकती है। तीर (डी) ब्राइटफील्ड और (एफ एंड जी) रूपांतरित आरएफपी छवियों में कैल्सीफिकेशन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: बाद के चरण कैल्सीफिकेशन का उदाहरण। (A) ओवरले छवि को अलग (B) ब्राइटफील्ड, (C) RFP (कैल्सीफिकेशन), और (E) DAPI (नाभिक) छवियों के रूप में प्रदर्शित और विश्लेषण किया जा सकता है। (डी) आरएफपी सिग्नल के विश्लेषण के लिए, पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए छवियों को पूर्व-संसाधित किया जाता है। तीर (बी) ब्राइटफील्ड और (डी) रूपांतरित आरएफपी छवियों में कैल्सीफिकेशन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कैल्सीफिकेशन माध्यम के साथ संस्कृति में 14 दिनों के बाद एचवीएसएमसी के कम और उच्च कैल्सीफिकेशन के बीच प्रतिनिधि तुलना। आमतौर पर, डेटा को बार ग्राफ के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है और अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट को नियोजित करके विश्लेषण किया जा सकता है। (ए) कम कैल्सीफिकेशन और (बी) उच्च कैल्सीफिकेशन की प्रतिनिधि छवियां। लाल संकेत (आरएफपी) कैल्सीफिकेशन को दर्शाता है, और नीला सिग्नल (होचस्ट) नाभिक प्रदर्शित करता है। (सी) कैल्सीफिकेशन को प्रति सेल फेतुइन ए-आरएफपी पॉजिटिव सिग्नल (कुल क्षेत्र) के रूप में प्रस्तुत किया गया है। (डी) समय के साथ मापा गया कैल्सीफिकेशन परख का उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: एचवीएसएमसी के साथ कैल्सीफिकेशन प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले कुओं की एक श्रृंखला का उदाहरण। कुओं की बाहरी अंगूठी का उपयोग कैल्सीफिकेशन प्रयोग के लिए नहीं किया जाता है, लेकिन तरल से भरा होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: एचवीएमएससी के सेल संस्कृति और रखरखाव पर नोट्स। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: स्वचालित इमेजिंग प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम इन विट्रो कैल्सीफिकेशन निर्धारण के लिए एक अर्ध-स्वचालित विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि के लिए, एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन के तीन महत्वपूर्ण चरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, एचवीएसएमसी कैल्सीफिकेशन विकास के लिए सेलुलर घनत्व महत्वपूर्ण है। एचवीएसएमसी के कम घनत्व के परिणामस्वरूप सेल-टू-सेल संपर्क की कमी और कैल्सीफाइंग स्थितियों के तहत प्रेरित तनाव के कारण धीमी या कोई कैल्सीफिकेशन और सेल मृत्युहोगी। उच्च सेलुलर घनत्व के परिणामस्वरूप अति-संयोजन होता है, जिसके बाद कोशिकाएंसंवेदनशील हो जाती हैं और कैल्सीफिकेशन विकास बंद हो जाता है। वेल प्लेट में लगभग 70% कंफ्लुएंसी को बीज देना महत्वपूर्ण है जिसका उपयोग बाद में कैल्सीफिकेशन विकास के लिए किया जाएगा, जो एचवीएसएमसी की प्रोलिफेरेटिव क्षमता और सेलुलर कनेक्शन सुनिश्चित करेगा।

दूसरे, कैल्सीफिकेशन प्रेरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल संस्कृति मीडिया को अनुकूलन की आवश्यकता होती है। संवहनी कैल्सीफिकेशन अनुसंधान के भीतर, एचवीएसएमसी23,24 को कैल्सीफाई करने के लिए विभिन्न स्थितियों और मीडिया रचनाओं की सूचना दी गई है। हमारा मानना है कि विधि सभी प्रकार के इन विट्रो-मध्यस्थता कैल्सीफिकेशन का पता लगाने के लिए उपयुक्त है, और इसका उपयोग कैल्शियम, फॉस्फेट, या कैल्शियम-फॉस्फेट उत्तेजित जमा का पता लगाने के लिए किया गया है। कैल्सीफिकेशन प्रेरण के लिए मोड के बावजूद, कैल्सीफाइंग मीडिया का अनुकूलन निर्णायक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हमने 2.5% एफबीएस के साथ 4.5 एमएम सीए2 + की कुल कैल्शियम एकाग्रता के साथ एम 199 का उपयोग करके कैल्सीफिकेशन प्रेरण को अनुकूलित किया।

अंत में, कैल्सीफिकेशन के दौरान प्लेटों में स्थानीय अंतर देखा गया है। नमूना पूर्वाग्रह को रोकने के लिए तकनीकी प्रतिकृति के यादृच्छिक लोडिंग को लागू करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, बाहरी कुएं की लेन की लोडिंग से बचा जाना चाहिए क्योंकि ये कुएं हमेशा 48-वेल सेटिंग में अधिक तेजी से गणना करते हैं। यह संभावित रूप से इंट्राप्लेट आर्द्रता के डिसरेग्यूलेशन के कारण होता है, जिसमें सबसे बाहरी कुओं का उपयोग नहीं करना और इन कुओं को बड़ी मात्रा में तरल पदार्थ के साथ लोड करने से इसके लिए नियंत्रण में मदद मिलती है।

जबकि कैल्सीफिकेशन परख को किसी विशेष सेटअप के साथ प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कई अनुकूलन चरणों की आवश्यकता हो सकती है, एक बार ऊपर आने और चलाने के बाद यह सीधा हो जाता है। कैल्सीफिकेशन परख को आगे अनुकूलन की आवश्यकता के बिना स्थापित परिस्थितियों में एक साथ और बार-बार चलाया जा सकता है। एचवीएसएमसी-मध्यस्थता कैल्सीफिकेशन चुनौतीपूर्ण हो सकता है और परख की मजबूती हासिल करने से पहले प्रयोग की आवश्यकता होती है। एक शोधकर्ता को नियमित इमेजिंग शुरू करने से पहले इष्टतम समय निर्धारित करने में सक्षम होना चाहिए, जिसमें 1 सप्ताह तक का समय लग सकता है। प्रयोग की शुरुआत से एक निश्चित इमेजिंग शेड्यूल स्थापित किया जा सकता है, हालांकि यह अंतर रीड-आउट के बिना कई छवियों का उत्पादन कर सकता है, छवियों के लिए अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में डेटा स्टोरेज का उपयोग कर सकता है, और विश्लेषण में समय लेने वाला हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया कैल्सीफिकेशन परख का विश्लेषण करने का एक तरीका है। अन्य उद्देश्यों के लिए, प्रक्रिया को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। संदर्भित स्वचालित इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके हमारा विश्लेषण प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करता है, हालांकि विश्लेषण किसी भी लाइव सेल और तापमान- और सीओ2-नियंत्रित इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, संबंधित वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेज उच्च सामग्री सेलुलर स्क्रीनिंग और विश्लेषण के लिए अनुकूलित हैं, आदर्श रूप से समय के साथ कैल्सीफिकेशन प्रवृत्ति को मापने के लिए अनुकूल हैं। अन्य सॉफ्टवेयर समाधान, जैसे फ्रीवेयर इमेजजे, छवि विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं और कैल्सीफिकेशन विकास को भी निर्धारित कर सकते हैं।

ऑटोफोकसिंग के मुद्दों के कारण लेट-स्टेज कैल्सीफिकेशन प्लेटों की इमेजिंग मुश्किल हो सकती है, अगर संस्कृति को तैरते मलबे का सामना करना पड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप तेज छवियों और प्रतिकृतियों की संख्या कम हो जाती है। छवि विश्लेषण को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए, और विश्लेषण को बेहतर बनाने और सरल बनाने के लिए इस प्रोटोकॉल में नियोजित सॉफ़्टवेयर में कुछ समाधान विकसित किए गए हैं।

सेलुलर विषमता विट्रो में कैल्सीफिकेशन की मात्रा का परिमाणीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इस मंच में, हम कैल्सीफिकेशन के विकास के लिए बायोसेंसर के रूप में एचवीएसएमसी का उपयोग करते हैं। प्राथमिक एचवीएसएमसी विभिन्न अंतर्निहित संवहनी विकृति वाले विभिन्न दाताओं से प्राप्त होते हैं; इसलिए, यह परख अभी भी वीएसएमसी बैचों की विविधता के कारण उच्च परिवर्तनशीलता के अधीन है। एक संभावित समाधान अमर सेल लाइनों का उपयोग या प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एचवीएसएमसी का उपयोग है।

एक और सीमा यह है कि परिमाणीकरण विधि अभी भी व्यक्तिपरकता के प्रति संवेदनशील है। कैल्सीफिकेशन परख में व्यक्तिपरकता अंतिम-बिंदु परख के कारण उत्पन्न होती है, जो केवल हाल ही में उपलब्ध थी। शोधकर्ताओं को यह तय करना होगा कि प्रयोग को कब रोकना है और कैल्सीफिकेशन को मापना है, जिससे परख की व्यक्तिपरकता बढ़ जाती है। हमारा मानना है कि इस पांडुलिपि में पेश की गई विधि बेहतर है क्योंकि हम समय के साथ मापते हैं और एक निश्चित अवधि में कैल्सीफिकेशन विकास की तुलना कर सकते हैं। इससे जुड़ा हुआ, रोशनी सेटिंग को समय के साथ सिग्नल में कमी के कारण हर समय बिंदु के लिए अलग से समायोजित करने की आवश्यकता होती है। इसके कारण, एक तस्वीर में दर्शाए गए संकेत की मात्रा अभी भी किसी व्यक्ति की राय से प्रभावित होती है। यह महत्वपूर्ण है कि रोशनी उच्चतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ की जाती है ताकि पोस्ट-इमेज विश्लेषण यथासंभव निष्पक्ष रूप से किया जा सके।

यद्यपि हम इस परख की व्यक्तिपरकता को एक सीमा के रूप में देखते हैं, हम मानते हैं कि यह अन्य इन विट्रो कैल्सीफिकेशन विधियों से बेहतर है। मौजूदा तरीकों के विपरीत, हमारे अर्ध-स्वचालित कैल्सीफिकेशन परख का लाभ यह है कि छवियों का गुमनाम रूप से विश्लेषण किया जा सकता है, जिससे एक स्वतंत्र अंधा राय प्रदान की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, छवियों को बाद के चरण में डेटा सेट में समान परिभाषित सेटिंग्स के साथ विश्लेषण किया जा सकता है, जिससे व्यक्तिपरकता कम हो जाती है।

कैल्सीफिकेशन निर्धारण के वर्तमान तरीके अंत-बिंदु माप पर निर्भर करते हैं या संवहनी घटक 25,26,27 की कमी है। क्लिनिक के भीतर, कंप्यूटेड टोमोग्राफी, इंट्रावास्कुलर अल्ट्रासाउंड और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग जैसे उपकरण महंगे हैं और रोगियों के लिए बोझ हैं। बायोमार्कर अनुसंधान ने इसके उपयोग को साबित कर दिया है लेकिन रोगियों के कैल्सीफिकेशन बोझ को प्रतिबिंबित नहीं करता है। हमारा मानना है कि यह अर्ध-स्वचालित परख न केवल एक एकल बायोमार्कर का उपयोग करती है, बल्कि परिसंचारी घटकों का एक संग्रह है, जो रोगी की हृदय स्थिति को दर्शाती है। इसका उपयोग बायोसेंसर के रूप में कैल्सीफिकेशन प्रतिक्रिया को मापने के लिए किया जा सकता है। वर्णित विधि के संभावित आगे के अनुप्रयोगों में संवहनी कैल्सीफिकेशन के व्यक्तिगत विकास के लिए सरोगेट मार्कर के रूप में इन विट्रो कैल्सीफिकेशन विकास के लिए रोगियों की सीरम स्क्रीनिंग शामिल है। मंच ने चयापचय और गैर-चयापचय दोनों बीमारियों के अलावा डायलिसिस और विटामिन के उपचार के प्रति अपनी संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है जो खराब कार्डियोवैस्कुलर स्थिति और रोग का निदानकरने वाले रोगियों से जुड़े हैं। चूंकि परख का सिद्धांत कैल्शियम क्रिस्टल का पता लगाने पर आधारित है, इसलिए हम अनुमान लगाते हैं कि यह अन्य शोध क्षेत्रों में भी प्रासंगिक हो सकता है जहां खनिज प्रासंगिकता का हो सकता है, जैसे कि पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस, ऑस्टियोपोरोसिस, हड्डी पुनर्योजी चिकित्सा, या दंत अनुसंधान।

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Disclosures

लियोन स्चुर्गर्स को बेयर, बोहरिंगर इंगेलहेम, नैटोफार्मा और आईडीएस से संस्थागत अनुदान मिला है। लियोन स्चुरर्स जमावट प्रोफ़ाइल में शेयरों के मालिक हैं। विली जाह्नेन-डेचेंट कैल्सीकॉन एजी के सह-संस्थापक और शेयरधारक हैं।

Acknowledgments

इस शोध को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रमों द्वारा मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते के तहत वित्त पोषित किया गया था, जो 722609 और 764474, एनडब्ल्यूओ ज़ोनएमडब्ल्यू (एमकेएमडी 40-42600-98-13007) है। इस शोध को BioSPX द्वारा समर्थित किया गया था। डब्ल्यूजे-डी को ड्यूश फोर्सचुंग्सगेमिनशाफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) टीआरआर 219-प्रोजेक्ट आईडी 322900939 और प्रोजेक्ट आईडी 403041552 से धन प्राप्त हुआ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous Thermo Fisher Scientific 349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates Corning 3516
Cytation 3 System BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum Merck F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546 Prepared in-house
Gen5 Software v3.10 BioTek
Gibco Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride Thermo Fisher Scientific H3570
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25300062

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References

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जैव रसायन अंक 184
<em>विट्रो में</em> कैल्शियम जमाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जैविक-आधारित विधि
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Jaminon, A. M. G., Rapp, N.,… More

Jaminon, A. M. G., Rapp, N., Akbulut, A. C., Dzhanaev, R., Reutelingsperger, C. P., Jahnen-Dechent, W., Schurgers, L. J. A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro. J. Vis. Exp. (184), e64029, doi:10.3791/64029 (2022).

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