Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות in vivo

Published: June 29, 2022 doi: 10.3791/64040
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Dermatology, UCSF, 2TRex Bio

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתיל עור אנושי בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2 קולטן שרשרת גמא (NSG). בדו"ח נכללים תיאור מפורט של הכנת עור אדם להשתלה, הכנת עכברים להשתלה, השתלת עור אדם בעובי מפוצל והליך התאוששות לאחר ההשתלה.

Abstract

מודל קסנוגרפט העור האנושי, שבו מושתל עור תורם אנושי בפונדקאי עכבר חסר חיסון, הוא אופציה חשובה למחקר תרגומי באימונולוגיה של העור. מורין ועור האדם נבדלים זה מזה באופן מהותי באנטומיה ובהרכב תאי מערכת החיסון. לכן, למודלים מסורתיים של עכברים יש מגבלות למחקר דרמטולוגי ולגילוי תרופות. עם זאת, קסנוטרנספלנטים מוצלחים הם מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים הכנה אופטימלית של אתר הדגימה והשתלת העכבר להישרדות השתל והמארח. הפרוטוקול הנוכחי מספק טכניקה אופטימלית להשתלת עור אנושי בעכברים ודן בשיקולים הכרחיים למטרות ניסוי במורד הזרם. דו"ח זה מתאר הכנה מתאימה של דגימת עור של תורם אנושי, הרכבה של מערך כירורגי, הכנת עכברים ואתרים כירורגיים, השתלת עור וניטור לאחר ניתוח. הקפדה על שיטות אלה מאפשרת שמירה על קסנוגרפטים במשך למעלה מ-6 שבועות לאחר הניתוח. הטכניקות המפורטות להלן מאפשרות יעילות השתלה מקסימלית בשל פיתוח בקרות הנדסיות, טכניקה סטרילית והתניה לפני ואחרי ניתוח. ביצועים מתאימים של מודל xenograft מביאים לדגימות השתלת עור אנושיות ארוכות טווח לאפיון ניסיוני של עור אנושי ובדיקות פרה-קליניות של תרכובות in vivo.

Introduction

מודלים של עכברים משמשים לעתים קרובות כדי להסיק מסקנות לגבי ביולוגיה ומחלות אנושיות, בין היתר בשל יכולת השחזור הניסיונית שלהם ויכולת המניפולציה הגנטית שלהם. עם זאת, הפיזיולוגיה של העכבר אינה משחזרת לחלוטין את מערכות האיברים האנושיים, במיוחד את העור, ולכן יש לה מגבלות לשימוש כמודל פרה-קליני בפיתוח תרופות1. הבדלים אנטומיים בין עור העכבר לעור האדם כוללים הבדלים בעובי האפיתל ובארכיטקטורה, מחסור בבלוטות זיעה מורין אקרין ושינויים במחזור השיער2. יתר על כן, הן הזרועות המולדות והן הזרועות הנרכשות של מערכת החיסון שונות בין שני המינים3. עור העכבר מכיל אוכלוסייה חיסונית ייחודית של תאי T אפידרמליים דנדריטיים (DETCs), יש לו שפע גבוה יותר של תאי γδ T עוריים, והוא משתנה בלוקליזציה של תת-קבוצה של תאי מערכת החיסון בהשוואה לרקמות אנושיות4. לכן, ממצאים ניסיוניים לגבי ביולוגיה ודלקת של עור האדם נהנים מאימות עם רקמות אנושיות. בעוד שמערכות תרבית חוץ גופית ואורגנואידית נמצאות בשימוש נרחב בכלים לחקר רקמות אנושיות, מערכות אלה מוגבלות על ידי שחזור חיסוני נעדר או לא שלם וחוסר חיבור לכלי הדם ההיקפיים5. מודל השתלת העור האנושי של קסנוגרפט נועד לאפשר מניפולציה טיפולית או ביולוגית של מסלולים חיסוניים ולא חיסוניים ברקמות אנושיות in vivo.

מודל קסנוגרפט העור האנושי שימש לחקר פיזיולוגיה ופרמקולוגיה של העור, ניתוח דחייה ותגובות של מערכת החיסון, ניתוח מנגנוני סרטן עור אנושיים והבנת מחלות עור וריפוי פצעים6. למרות שהוא ישים לתחומים רבים של מחקר עור, למודל xenograft יש תפוקה נמוכה יותר מאשר למחקרים במבחנה והוא חסר את הקלות של מניפולציה גנטית המשמשת במודלים של עכברים. נקודות הזמן במודל זה עשויות לנוע בין שבועות לחודשים, והשתלה מוצלחת דורשת מתקנים וציוד מתאימים לביצוע ניתוחים אלה. עם זאת, מודל xenograft מספק הקשר ביולוגי ופיזיולוגי לניסויים, בעוד שמערכות תרבית אורגנואידיות, כגון explants רקמות, דורשות לעתים קרובות שכפול של מספר עצום של חלקים נעים, כגון אותות אקסוגניים, במרווחי זמן ספציפיים7. לכן, מודל זה מנוצל בצורה הטובה ביותר כדי לאמת עוד יותר ממצאים שנצפו במבחנה ובתוך מודלים של עכברים, או לעבודה שאינה אפשרית ביולוגית אחרת. שימוש נכון במודל xenograft מספק הזדמנות ייחודית לחקור ולתפעל רקמות אנושיות שלמות in vivo.

אופטימיזציה של מודל השתלת העור xenograft הסתמכה על עשרות שנים של מחקר כדי לשמור על שלמות השתל לאורך זמן. קריטי לתהליך זה הוא שימוש בעכבר קולטן שרשרת הגמא (NSG) של סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2, אשר חסר תאי חיסון מסתגלים מסוג B ו-T, תאי NK מתפקדים, ויש לו ליקויים במקרופאגים ובתאים דנדריטיים8. האופי החיסוני של מארחי NSG אלה מאפשר השתלה של תאים המטופויאטיים אנושיים, סרטן שמקורו בחולה ועור 8,9,10. למרות הסביבה המארחת המדכאת את מערכת החיסון, דיכוי נוסף של תגובות חיסוניות נויטרופיליות של עכברים על-ידי מתן anti-GR1 נחוץ להצלחת השתל10. המחסומים העיקריים בהשתלת רקמה שלמה הם זיהום, דחייה וקושי לבסס מחדש את זרימת הדם לשתל, מה שמוביל לעיתים לאובדן שלמות העור והאפידרמיס11. טכניקות הכוללות מתן אנטי-FR1 ושימוש בעומק השתל המתאים משפרות את הישרדות השתל10. אופטימיזציה קפדנית מאפשרת לבצע השתלות עור של קסנוגרפט אנושי בעכברי NSG עם יעילות גבוהה ושיעורי הישרדות, הנעים בין 90%-100%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר ובוצע בהתאם לפרוטוקולי UCSF IACUC (AN191105-01H) ו-IRB (13-11307). דגימות עור, שהושלכו כחלק מהליכים כירורגיים אלקטיביים שגרתיים, כגון תיקון בקע, שימשו למחקר הנוכחי. דגימות העור אינן מזוהות ומאושרות כ-Not Human Subjects Research או, אם נדרש מידע מזהה קליני לניתוחים במורד הזרם, המטופלים סיפקו הסכמה בכתב תחת פרוטוקול IRB 13-11307. לא נעשה שימוש בקריטריונים אחרים של הכללה או הדרה. במחקר הועסקו עכברי NSG משני המינים, בני 8-10 שבועות. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. עיבוד דגימת עור אנושית של תורם

הערה: דגימת העור האנושית ששימשה להשתלה זו הייתה דגימה גדולה שנאספה מבטנו של חולה בריא. המדגם חייב להיות לפחות 15 ס"מ x 7.5 ס"מ. מגבלות גודל עשויות להשפיע על מספר העכברים שעבורם העור זמין ועל בחירת גודל השתל.

  1. יש לשמור על דגימת העור בטמפרטורות קרות (על קרח; 4°C) לפני ההכנה וההשתלה. שמור את הדגימה לחה בכוס איסוף דגימות סגורה עם הגזה ספוגה בתמיסת מלח אפופת פוספטים (PBS).
    הערה: לא מומלץ לאחסן את דגימת העור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יותר מיומיים. עם זאת, קיימים דיווחים שבהם דגימות העור מאוחסנות למשך זמן רב יותר12.
    אזהרה: טפלו בכל הרקמות האנושיות באמצעי זהירות ביולוגיים סטנדרטיים.
  2. היכונו לדרמטומט את דגימת העור האנושית במכסה רכיית תרבית בלחץ שלילי מעוקר על לוח דיסקציה מעוקר.
  3. מניחים את דגימת העור, בצד האפידרמיס כלפי מעלה, על לוח הנתיחה. נגבו את האפידרמיס עם כרית הכנה סטרילית לאלכוהול ולאחר מכן עם PBS.
  4. הצמידו את הקצה הקרוב יותר של העור למקומו בעזרת פין T בחיתוך 1.5 (ראו טבלת חומרים).
  5. דרמטום דגימת העור בעובי 400 מיקרומטר, תוך הפעלת לחץ יציב תוך כדי חיתוך קדימה בזווית של 30°-45°. בצע את כל ההוראות ואמצעי הבטיחות הספציפיים למכשיר (ראה טבלת חומרים).
    הערה: לפרטים על טכניקת הדרמטום, ראה דוחשפורסם בעבר 13.
  6. הכינו צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ על ידי הנחת גזה סטרילית ספוגה ב-PBS סטרילי בתחתית המנה. מניחים את העור, בצד האפידרמיס כלפי מעלה, על הגזה הרטובה.
  7. אטמו וכיסו את שולי הלוחות בסרט איטום שקוף למחצה (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שהדגימה אינה מזוהמת. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4° צלזיוס לפני ההשתלה.

2. התניה והכנה לפני הניתוח

  1. הכינו את המכשירים הסטריליים ותחנת ניתוח סטרילית להשתלה. השתמש במגבות נייר אוטומטיות כמשטחים סטריליים למיקום המכשיר והעכבר.
    הערה: עכברים עשויים להיות מושתלים לאחר הגמילה, אך עדיף להשתיל אותם בין הגילאים 8-10 שבועות. עכברים משני המינים עשויים להיות מושתלים.
  2. בצע את ההכנה הכירורגית, כגון הסרת שיער, באזור המופרד פיזית מתחנת הניתוח.
  3. הכינו את האנטי-GR1 (ראו טבלת חומרים) על ידי דילול ל-1 מ"ג/מ"ל במלח סטרילי. מינון כל עכבר עם 100 מיקרוגרם/100 μL של תמיסה נגד GR1 intraperitoneally לאחר אינדוקציה הרדמה.
  4. הרדמת העכברים, בזה אחר זה, באיזופלוראן או בחומרי הרדמה אחרים שאושרו על ידי מוסד.
    הערה: יש לתת איזופלוראן בריכוז של 3%-5% במהלך האינדוקציה. ברגע שהעכבר חסר תנועה, יש להוריד את ריכוז האיזופלוראן ל-1%-3% למשך הניתוח.
    1. עקוב אחר העכבר לעומק הרדמה מתאים על ידי התבוננות בקצב הנשימה, היעדר תגובת צביטה בבוהן וצבע ורוד מתאים של האוזניים והפה.
      אזהרה: השתמש במכונות הרדמה מתאימות ובשיטות חיטוי, והימנע מחשיפה לאדי איזופלורן.
  5. העבירו את העכבר למשטח חימום או למקור חום אחר (ראו טבלת חומרים).
  6. לתת את משחת העיניים על ידי טפיחה טיפה קטנה של משחה על העין עם אצבע כפפות.
  7. מתן משככי כאבים בופרנורפין (0.08 מ"ג/ק"ג) וקרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) באופן תת עורי על ידי צביטה בעור והזרקה בזווית מקבילה לגוף.
    הערה: הכינו את משכך הכאבים שלפני הטיפול בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים. עקוב אחר הנחיות מוסדיות לבחירה וניהול של משככי כאבים. השיטה של משכך כאבים המשמשת במחקר זה מתוארת בשלב 2.7 ובאיור משלים 1.
  8. מתן anti-GR1 (מוכן בשלב 2.4) intraperitonely על ידי הרמה קלה של העכבר על ידי הזנב, חשיפת הבטן, והזרקת בזווית של 30° באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל (12.7 מ"מ).
  9. השתמשו בקוצץ חשמלי בטוח לבעלי חיים (ראו טבלת חומרים) כדי לגלח את החלקים האמצעיים והעליונים של הצד הגבי של העכבר.
  10. נקו את כל השיער ומרחו כמות נדיבה של משחה להסרת שיער על העור המגולח למשך 30 שניות עד דקה.
  11. נגבו לחלוטין משחה להסרת שיער עם מגבת נייר ו-PBS.

3. הליך השתלה

  1. העבירו את העכבר למיקום כירורגי משני, הרחק מתחנת הסרת השיער.
  2. לעקר את האתר הכירורגי עם מקל ספוגית היוד בתנועה מעגלית, החל באמצע ולהתאמן לכיוון קצה האזור depilated.
  3. מניחים חתיכת ניילון נצמד סטרילי מעל העכבר וחותכים חלון בניילון מעט גדול יותר מגודל האזור המיועד להשתלה.
  4. חתכו חלק בצורת מלבן בגודל 10 מ"מ על 10 מ"מ של עור התורם כדי להשתיל אותו באזמל. עשו זאת על ידי החזקה איתנה של עור התורם במקומו עם החלק האחורי של המלקחיים וחיתוך לצד המלקחיים עם האזמל.
  5. באמצעות המספריים הכירורגיים, חותכים אזור מלבני של עור העכבר התואם את גודל פיסת העור התורמת, ויוצרים מיטת השתלה. השתמשו במלקחיים כדי למשוך את העור הרחק מהגוף, וחתכו את העור עם המספריים בזווית הרחק מהגוף כדי להימנע מחיתוך עמוק לתוך החזית.
  6. הניחו את פיסת העור של התורם, בצד האפידרמיס כלפי מעלה, על מיטת השתל המוכנה.
  7. באמצעות החלק האחורי של המלקחיים, לתמרן את העור, מחליק קדימה ואחורה עד שהעור התורם שוכב שטוח לחלוטין על מיטת השתל.
  8. יש להוסיף טיפות של דבק דבק כירורגי (ראו טבלת חומרים) במקום בו עור התורם פוגש את עור העכבר ולהחזיק את עור העכבר והתורם יחד עם מלקחיים למשך 1-2 שניות כך שהדבק יידבק לרקמות. יש לאטום לחלוטין את קצה השתל ולאפשר לדבק להתייבש במלואו.
  9. חבשו את העכברים (איור 1) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. חותכים חתיכת גזה פטרולאטום (ראו טבלת חומרים) גדולה מספיק כדי לכסות את אזור השתל לחלוטין.
    2. מכסים את השתל עם גזה פטרולאטום, ולחץ קלות את הגזה על העור באמצעות מלקחיים.
    3. חותכים רצועה של סרט שקוף לאורכו כך שהרוחב גדול מספיק כדי לכסות את הפצע של העכבר.
    4. לחץ בחוזקה על הלבשת הסרט השקוף, צד דבק למטה, מעל הגזה. גלגלו במהירות את העכבר כדי לעטוף את ההלבשה כולה סביב פלג הגוף העליון, כדי להבטיח שהיא תתאים היטב מבלי לפגוע בנשימה וכל הגפיים יהיו חופשיות לתנועה.
    5. הנח את העכבר בכלוב שחזור ונטר אותו עד שהוא ערני ומסתובב. ספק מקור חום בחלק מהכלוב למשך 15 דקות לפחות לאחר ההתאוששות.
      הערה: בעלי החיים צפויים להתאושש תוך 1-5 דקות לאחר הצבתם בכלוב ההתאוששות.
  10. לשכן את העכברים לאחר השתלה.
  11. מתן משכך כאבים לאחר הניתוח כנדרש על פי פרוטוקולים מוסדיים.
    הערה: בופרנורפין (0.08 מ"ג/ק"ג) ניתן באופן תת-עורי 4-6 שעות מאוחר יותר במהלך המחקר הנוכחי.

4. הליכים לאחר הניתוח

  1. הזריקו 100 μL (100 מיקרוגרם) של אנטי-GR1 תוך-צפקית לאחר 4 ימים, 7 ימים ו-11 ימים לאחר ההשתלה כדי למנוע דחיית שתלים (איור משלים 1).
  2. יש להחליף את התחבושות לפי הצורך ואם הן מוסרות על ידי עכברים.
  3. חבשו מחדש את כל העכברים ביום 7.
  4. הסירו את התחבושות ביום ה-14.
  5. עקוב אחר העכברים אחר סימנים של דחיית שתלים ודלקת מערכתית (ירידה במשקל, נשירת שיער, עייפות קיצונית).
  6. קוטפים את העכברים בין 3 ל-6 שבועות לאחר ההשתלה.
    1. הרדמת העכברים באמצעות מתן פחמן דו-חמצני (CO 2) המבוקר על ידי הרגולטור ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
      הערה: פעל בהתאם להנחיות המוסדיות להמתת חסד.
    2. נתחו את שתלי העור מהעכברים14. מניחים חלק מהשתל ב-10% פורמלין למשך 24 שעות לפני הטמעת פרפין וחיתוך להכתמת היסטולוגיה9.
    3. טחנו את שתלי העור במספריים ועיכלו באופן אנזימטי עם 250 יב"ל/מ"ל של קולגןאז IV ו-0.02 מ"ג/מ"ל של DNase במדיה של תרביות תאים למשך הלילה. הכתימו את התאים עבור סמנים משטחים ותוך-תאיים בעקבות ההליך שתואר קודםלכן 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קסנוגרפטים לעור האדם בוצעו על עכברי NSG בתוך מתקן בעלי חיים סופר-מחסום. ההצלחה הוגדרה על ידי הישרדות ממושכת של עכברים ועכברים ובריאות התנהגותית של עכברים לאחר ההשתלה. הישרדות לקויה במהלך השבוע שלאחר הניתוח נצפתה בתחילה כחסם הגדול ביותר להצלחת הניסוי, כאשר עד 50% מהעכברים נזקקו להמתת חסד. שיפור הטכניקה הסטרילית ותמיכה טובה יותר בטמפרטורות גוף העכבר במהלך הניתוח ומיד לאחריו הגדילו את ההישרדות הניתוחית באופן עקבי ליותר מ-80% ולעתים קרובות ל-90%-100% הישרדות. אמנם נוסתה תוספת של אנטיביוטיקה במי השתייה של העכברים, אך היא לא נחושה לשפר את התוצאות והופסקה כגורם פוטנציאלי לבלבול בתוצאות. עכברים מושתלים בהצלחה צריכים להיראות פעילים ובריאים בימים שלאחר ההשתלה. עכברים הסתובבו בכלוב שלהם, חקרו, בנו קינים ואכלו ושתו כרגיל. עכבר לא טוב עשוי להיראות עצלן, לא תגובתי, וייתכן שהוא לא אוכל או שותה מספיק כדי לשמור על משקלו. תוספת של עכברים רדומים עם הזנה רכה ולחות דרך הפה עשויה לסייע להתאוששות לאחר הניתוח.

קסנוגרפט המחלים כראוי יגלד תחילה ולאחר מכן יתאושש תוך כ-50 יום מהניתוח. שתלים עשויים להתכווץ עם הזמן, אך להישאר דבקים בקצוות שבהם העור התורם פוגש את עור העכבר (איור 2). בעוד ששתל השתל אמור להתפוגג, השתלים יישארו עבים ודלקתיים יותר מעור אנושי בריא (איור 2). התכווצות מוגזמת של שתלים יכולה להתרחש, הפחתת רקמה זמינה לניתוח נקודות קצה. שימוש בשתלים בגודל עקבי ומיקום שתלים מתאים צפויים למתן בעיות כאלה. כל השתלים לאורך חמישה ניסויים עצמאיים שרדו עד לזמן הקציר, עד 50 יום לאחר ההשתלה.

ניתוח רקמות עשוי לכלול אימונוהיסטוכימיה וניתוחים חד-תאיים לאחר עיכול אנזימטי. חלק מהעור עובד על ידי עיכול לילה ב-250 יב"ל/מ"ל של קולגן מסוג IV ו-0.02 מ"ג/מ"ל של DNase במדיה של תרביות תאים (ראו טבלת חומרים), והוכתם עבור סמנים על פני השטח והתוך-תאיים כפי שתואר קודםלכן 14. ניתוח באמצעות ציטומטריה של זרימה גילה נוכחות מתמשכת של תאי חיסון אנושיים ברוב השתלים, אך הספירות השתנו בין קסנוגרפטים (איור 3A). איור 3B מראה תוצאות מייצגות של שתל מוצלח (משמאל) וכזה שלא הצליח לשמור על תאי מערכת החיסון האנושית (מימין). ניתוח של מקטעים המטוקסילין ומוכתמים באאוזין (H&E) שנלקחו ממרכז השתל גילה עור שלם ולא נטול חיוניות המורכב מדרמיס ואפידרמיס אנושיים במשך 35 ו-50 נקודות זמן ביום (איור 4).

Figure 1
איור 1: שיטה לחבישת עכברים לאחר ניתוח. העכבר עטוף היטב בגזה פטרולאטום והלבשת סרט שקוף תחת הרדמה. (A) גזה פטרולאטום ממוקמת מעל אזור מעט גדול יותר מהפצע הניתוחי. (B) מכינים את חבישת הסרט השקופה: רצועה ארוכה נחתכת מעט רחבה יותר מגזה הפטרולאטום. הגב המכסה את הצד הדבק של ההלבשה השקופה של הסרט מוסר חלקית. (C) הצד הדביק של הסרט נלחץ בחוזקה כנגד גב העכבר, ומשאיר סנטימטר של רווח בקצה הקדמי של הסרט. (D) העכבר מופנה על גבו. החלק הקדמי התלוי של הסרט נלחץ על העכבר, והגב מוסר. (E) העכבר עטוף היטב בסרט, והתמיכה הנותרת מוסרת כאשר העכבר עטוף. (F) העכבר עטוף בהצלחה בתחבושת, וזרועותיו ורגליו אינן מרוסנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות מבעלי חיים מושתלים מיום 10 עד 21 לאחר ההשתלה. (A-C) שלושה עכברים שונים עם השתלות אופטימליות ביום 10. (ד-ה) שני עכברים שונים עם השתלות ביום 21. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כימריזם של תאי מערכת החיסון בעור מושתל. נתוני ציטומטריה של זרימה של התאוששות תאי מערכת החיסון האנושית מקסנוגרפטים. הנתונים מגודרים על אירועי סינגלט, חי, עכבר CD45+ אנושי CD45-. (A) מספר התאים (Live Human CD45+ Events) התאושש משני ניסויים עצמאיים. (B) חלקות מייצגות של כתמי תאי חיסון אנושיים ועכבר CD45+ בשתל מוצלח (משמאל) בהשוואה להשתלה עם תחזוקה לא מוצלחת של תא החיסון האנושי (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: היסטולוגיה של עור אנושי מושתל ביום 35 וביום 50. עור מושתל נקטף מעכברים ביום 35 (A) או 50 (B), נשמר ב-10% פורמלין, ומשובץ בפרפין ומוכתם עבור המטוקסילין ואוזין (H&E). (A) האפידרמיס מראה היפרפלזיה מתונה (אקנתוזיס), היפר-גרנולוזיס קלה ואורתוקרטוזיס קומפקטי. בדרמיס הפפילרי יש מדי פעם נימים מורחבים וצפופים. מלנוציטים ופיגמנט מלנין נמצאים בשכבה הבסיסית של האפידרמיס. הדרמיס הוא תאי בינוני ומורכב מפיברובלסטים אובליים שמנמנים עם ציטופלסמה סינסיטיאלית חיוורת ולימפוציטים מפוזרים. (B) האפידרמיס מורכב מאפיתל קשקשי מרובד, אורתוקרטוזיס באריגת סל בשכבת התירס, והוא בעובי תקין. מלנוציטים ופיגמנט מלנין נמצאים בשכבה הבסיסית של האפידרמיס. הדרמיס מראה פיברובלסטים סגלגלים ותצהיר מטריצה חוץ-תאית משופרת מעט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: ציר הזמן של הפרוטוקול שאומץ עבור מחקר xenograft. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל השתלת העור של xenograft של העכבר הוא טכניקה מרכזית לניתוח מכניסטי של תגובות חיסוניות של עור אנושי בסביבה in vivo 14. השתלות מוצלחות של קסנוגרפט עור מסתמכות על הכנה מתאימה של עכברים ודגימות עור ועכברים והיצמדות לשיטות ניתוח מכרסמים אספטיים15. קירור מהיר ואחסון נכון של דגימות עור בטמפרטורות קרות במדיה (כגון מי מלח סטריליים) חשובים כדי להבטיח את המשך בריאות הרקמות לפני ההשתלה12. איסוף דגימות בעובי מפוצל, באמצעות מכשיר כגון דרמטומה, מאפשר עקביות בעומק הדגימה בין עכברים ומגביר את אספקת החומרים המזינים מהמארח כדי לשפר את הישרדות השתל10. ניתן להבחין באובדן שלמות השתל עם רפיון האפידרמיס, במיוחד בשתלים בעובי מלא עם אספקת דם משובשת16. הישרדות העכברים לאורך הניתוח ולאחריו נעזרת בטכניקה סטרילית, אספקת חום במהלך הניתוח ולאחריו, וטכניקות הממזערות את זמן הניתוח, כגון שימוש בדבק כירורגי15. מתן אנטי-GR1 לאחר ההשתלה מאפשר דיכוי של התגובות החיסוניות הנותרות של העכבר בפונדקאי חסר החיסון כדי לקדם את הישרדות השתל10. שיטות אלה מגדילות את הסיכוי להישרדות עכברים ושתלים במהלך מודל השתלת קסנוגרפט ומשפרות את מספרי הניסויים ואת יכולת השחזור מניסוי אחד למשנהו.

למרות שהוא שימושי ביותר, ישנן כמה מגבלות מרכזיות למודל השתלת העור של xenograft, כפי שהוכח. ראשית, השתל קיים בסביבה דלקתית, ככל הנראה משנית לאיסכמיה חולפת וחדירה של רקמה מושתלת אנושית עם תאים מיאלואידים מורין. לפיכך, הוא אינו משקף עור אנושי במצב יציב וייתכן שאינו משקף באופן מלא את כל מחלות העור הדלקתיותהאנושיות 10,14. חקר הפרעות דלקתיות אנושיות על ידי השתלת ביופסיות קליניות מעור נגע היא אסטרטגיה חלופית, אך מגבלות במספר הביופסיות הזמינות ושליטה לא עקבית בעומק ההשתלה הופכות אפשרות זו לפחות חיובית. בנוסף, השתלות קסנוגרפט אינן משקפות מחדש את הארכיטקטורה החיסונית ההיקפית האנושית. שחזור פריפריה של העכבר עם תאים אנושיים עשוי גם לשאת אזהרות, שכן המבנה הלימפה של עכבר NSG הוא אטרופי לפני השתלת תאים אנושיים; פעולה זו עשויה להוביל לבחירת תאים מועדפת בהגדרותמסוימות 10,17. בנוסף, השתלת העור והתאוששות תאי מערכת החיסון מדגימות העור עשויות להשתנות מעכבר לעכבר, גם בהיעדר טיפול. לפחות 10 שכפולים לכל תנאי מומלצים למודל זה כדי לבחון הבדלים עקביים בין הקבוצות. ייתכן שיהיה צורך להתאים את משך הזמן המתאים של הבדיקה לשאלה הניסיונית, שכן ריפוי השתל וחידוש כלי הדם מתרחשים במהלך השבועות הראשונים שלאחר ההשתלה, והשפעת ההתערבויות עשויה להיות תלויה בשלב ההשתלה.

למרות חסרונות אלה, מודל השתלת העור של קסנוגרפט אנושי נותר אחד המבחנים הבודדים לחקר תגובות חיסוניות של עור אנושי באיבר השלם in vivo. בעוד שמודלים של עכברים מהונדסים עשויים לאפשר כריתת מסלולים מכניסטיים, הבדלים באנטומיה, בהרכב תאי מערכת החיסון ובמסלולים חיסוניים דומיננטיים מגבילים את התרגום למחלות אנושיות1. ניתן להשתמש בתרבית Ex vivo של תאים שמקורם בבני אדם, מודלים אורגנואידיים של העור ומחקרי התפשטות רקמות אנושיות, אך הם גם כפופים למגבלות, כולל שיבוש של רשתות תאי מערכת החיסון ויציאה של תאי חיסון מהרקמה השלמה18,19. לכן, המודלים להשתלת עור xenograft נשארים שיטה מרכזית לחקר מועמדים טיפוליים ותגובות עור אנושיות לדלקת בסביבה פרה-קלינית in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MDR היא המייסדת של TRex Bio ו-Sitryx. MDR ו-MML מקבלים מימון למחקר מ-Sitryx, Q32 ו-TRex Bio.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי הסכמי מחקר ממומנים של TRex Bio ומענקים מה-NIH (1R01AR075864-01A1). JMM נתמך על ידי האגודה לחקר הסרטן (מענק 26005). אנו מכירים בליבת הציטומטריה של זרימת פרנסוס הנתמכת בחלקה על ידי מענקים NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01, ו- S10 1S10OD018040-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin Fisher SF100-20 Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) Thermo Fischer 56-0451-82 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5 BioXcell BE0075 Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3) BD Biosciences 340939 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) eBioscience 47-9956-42 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches VWR  89140-800 For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 Biolegend 317438 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) Biolegend 301042 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) Biolegend 317328 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL Covetrus 059122 Analgesia
Carprofen 50 mg/mL Zoetis NADA # 141-199 Analgesia
Collagenase Type IV Worthington 4188 Skin digestion
D42 Dermatome blade Humeca 5.D42BL10 dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42 Humeca 4.D42 dermatome
Disposable Scalpel Bard-Parker 371610 skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 Cole-Parmer UX-10915-03 To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors medicon 02.04.10 sample preparation and mouse dissection
DNAse Sigma-Aldrich DN25-1G Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent eBioscience 00-5521-00 Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) eBioscience 48-4776-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers Kent CL8787-KIT hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin Fisher Scientific 6765040 H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin Fisher Scientific 6765015 H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) Tonbo Biosciences 35-0459-T100 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps  medicon 07.60.07 sample preparation and mouse dissection
Gauze Fisherbrand 22-362-178 Sample preparation
Heating lamp Morganville Scientific HL0100 Post-surgical care
Heating pads 4" x 10" Pristech 20415 Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes BD 329410 drug administration
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP)  NDC 66794-013-25 Anesthesia 
Isoflurane machine VetEquip 911103 Anesthesia
Nair for Men Nair ‎ 10022600588556 hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment Dechra  NDC 17478-235-35 eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 Mice
Paper towels Kleenex 100848 May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) BD Biosciences 557938 Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) BD Biosciences 561283 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) eBioscience 46-1529-42 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x eBioscience 00-8333-56 Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm Corning 430597 Sample storage
Plastic Wrap Fisherbrand 22-305-654 Site preparation
Providone-Iodine Swab stick PDI S41350 Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) Se Lab Group Inc NC9066511  For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups Fisher Scientific 22-150-266 sample storage
Sterile alcohol prep pad Fisherbrand 22-363-750 skin preparation
Sterile PBS Gibco 14190-144 Media for sample storage
Sterile saline Hospira NDC 0409-4888-02 For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”  3M 1626 transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”  Kendall 414600 wound dressing
Violet 510 Ghost Dye  Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Flow cytometry analysis: Viability dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  2. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
  3. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  4. Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
  5. Sun, H., Zhang, Y. -X., Li, Y. -M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
  6. Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  9. Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
  10. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  11. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
  12. Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
  13. Humeca, B. V. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021).
  14. Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
  15. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
  16. Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
  17. Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
  18. Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
  19. Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 184
מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J.… More

Moss, M. I., Pauli, M., Moreau, J. M., Cohen, J. N., Rosenblum, M. D., Lowe, M. M. Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (184), e64040, doi:10.3791/64040 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter