Summary
En procedure for levering af en kemisk ablativ opløsning til rottepattedyrets kanaltræ til billedstyret forebyggende behandling af brystkræft er beskrevet. Mammary epitelceller kan målrettes med minimal sikkerhedsvævsskade gennem kannulation direkte ind i brystvorteåbningen og intraduktal infusion af en 70% ethanolbaseret ablativ opløsning.
Abstract
Der er stadig et begrænset antal primære interventioner til forebyggelse af brystkræft. For kvinder med høj risiko for at udvikle brystkræft er den mest effektive intervention profylaktisk mastektomi. Dette er en drastisk kirurgisk procedure, hvor brystepitelcellerne, der kan give anledning til brystkræft, fjernes fuldstændigt sammen med det omgivende væv. Målet med denne protokol er at demonstrere gennemførligheden af en minimalt invasiv intraduktal procedure, der kan blive en ny primær intervention til forebyggelse af brystkræft. Denne lokale procedure vil fortrinsvis ablate brystepitelceller, før de kan blive ondartede. Intraduktale metoder til at levere løsninger direkte til disse epitelceller i gnavermodeller af brystkræft er blevet udviklet på Michigan State University og andre steder. Rottebrystkirtlen består af et enkelt duktalt træ, der har en enklere og mere lineær arkitektur sammenlignet med det menneskelige bryst. Imidlertid tilbyder kemisk inducerede rottemodeller af brystkræft værdifulde værktøjer til proof-of-concept-undersøgelser af nye forebyggende interventioner og skalerbarhed fra musemodeller til mennesker. Her beskrives en procedure for intraduktal levering af en ethanolbaseret ablativ opløsning indeholdende tantaloxidnanopartikler som røntgenkontrastmiddel og ethylcellulose som geleringsmiddel i rottepattedyrets kanaltræ. Levering af vandige reagenser (f.eks. cytotoksiske forbindelser, siRNA'er, AdCre) ved intraduktal injektion er tidligere beskrevet i muse- og rottemodeller. Denne protokolbeskrivelse understreger metodologiske ændringer og trin, der unikt vedrører levering af en ablativ løsning, formuleringsovervejelse for at minimere lokale og systemiske bivirkninger af den ablative opløsning og røntgenbilleddannelse til in vivo-vurdering af duktal træfyldning. Fluoroskopi og mikro-CT-teknikker gør det muligt at bestemme succesen med levering af ablativ opløsning og omfanget af duktal træfyldning takket være kompatibilitet med det tantalholdige kontrastmiddel.
Introduction
For kvinder i USA1 er brystkræft (BC) fortsat den mest diagnosticerede kræfttype og forårsager flere dødsfald end nogen anden kræfttype undtagen lungekræft. Fremskrivninger for 2022 anslår, at 51.400 kvinder vil blive diagnosticeret med karcinom in situ, og 287.850 kvinder vil blive diagnosticeret med invasivt karcinom, og at 43.600 kvinder vil dø af BC1. På trods af forekomsten og dødeligheden forbundet med BC er der få muligheder for primær forebyggelse og translationel forskning om nye interventioner, da primær forebyggelse ikke prioriteres af føderale agenturer2. Profylaktisk mastektomi er den mest effektive intervention til primær forebyggelse. Denne procedure anbefales dog kun til højrisikopersoner, fordi det er en større operation med livsændrende konsekvenser3. Denne operation indebærer fuldstændig fjernelse af brystepitelcellerne, hvorfra carcinogenese udvikler sig såvel som det normale omgivende væv. Enkeltpersoner afskrækkes ofte fra at bruge denne procedure som deres første mulighed for primær intervention på grund af den negative virkning af fysisk, psykologisk og social stress. Af disse grunde vælger selv nogle højrisikopersoner ikke at gennemgå denne procedure og vælger i stedet opmærksomme ventende eller lignende overvågningsstrategier3. I tidligere publikationer var levering af 70% ethanol (EtOH) direkte ind i det duktale træ af musemodeller effektiv til kemisk ablating af brystepitelceller med begrænset skade på tilstødende normalt væv og til at forhindre brysttumordannelse4. EtOH anvendes i flere kliniske anvendelser som enten et ablativt middel til lokal behandling af nogle kræftformer eller skleroserende middel til lokal behandling af arteriovenøs hævelse og misdannelser 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . EtOH's lave toksicitet og sikkerhedsprofil er veletableret, da der i nogle procedurer kan administreres op til 50 ml 95 % EtOH pr. session 5,10.
Fuldstændig fjernelse af brystepitelceller, hvorfra BC udvikler sig, er den mest afgørende komponent i både profylaktisk mastektomi og lokal levering af en ablativ opløsning. Derfor er bekræftelse af fuldstændig duktal træfyldning nødvendig for at garantere, at den ablative opløsning er kommet i direkte kontakt med alle brystepitelcellerne. Levering af en løsning inden for duktale træer og dens visualisering ved billedstyret fluoroskopi eller duktografi er mulig gennem kliniske procedurer, der allerede findes15,16,17. Det vil således være muligt let at implementere og evaluere denne procedure i kliniske forsøg. Et vigtigt skridt i etableringen af effektiviteten og den translationelle gennemførlighed af intraduktal (ID) ablation som en ny intervention til primær forebyggelse vil være at demonstrere gennemførligheden af denne røntgenvisualiseringsmetode i dyremodeller af stigende størrelse og kompleksitet af deres duktale træarkitektur 4,18,19. En protokol, der opskalerer denne ablative procedure fra mus20 til rottemodeller, er beskrevet her. Mens muse- og rottetræer har en lignende lineær struktur og forgreningsmønster, er rottekanaltræet proportionalt større og er omgivet af en meget tættere stroma. Vi har implementeret en metode i laboratoriet til med succes at injicere hver brystkirtel i en rotte over en række ugentlige sessioner med en ablativ opløsning indeholdende et kontrastmiddel. Sessionsafstand er nødvendig for at sikre, at dyrene har minimale bivirkninger af EtOH (figur 1 og figur 2). Proceduren indebærer injektion af den ablative opløsning direkte i brystvorteåbningen af en isofluranbedøvet rotte med en 33 G nål. Nogle vigtige forbedringer af proceduren omfatter brugen af udvidet antiinflammatorisk behandling, injektion af højere volumener pr. Ductal træ end foreslået21 og gastætte sprøjter til væske og gasser. Varigheden af behandlingen med 5 mg/kg carprofen (et NSAID) fra 48 timer før til 1 uge efter ID-injektioner kan sammenlignes med den antiinflammatoriske protokol, der anvendes til skleroserende behandling af venøs misdannelse i klinikken. Behandlingen udføres på patienter under systemisk anæstesi efterfulgt af 2 dages antiinflammatoriske lægemidler såsom NSAID'er. Den antiinflammatoriske behandling kan forlænges i et par dage for at reducere lokal inflammation og enhver potentiel smerte13. Som hos mus20 afbøder intraperitoneal injektion af en 5% saccharoseopløsning den kortsigtede virkning af alkoholforgiftning hos rotter. Rotter kan injiceres med op til 1 ml 70% EtOH (op til 4 kanaler; 0,2 g / dL EtOH-indhold i blod) i en enkelt session, når de administreres med denne saccharoseopløsning; dyr kommer sig fuldt ud inden for 4 timer efter ID-injektioner. Vi udfører sekventielle sessioner for at give tilstrækkelig restitutionstid, når vi injicerer mere end 4 kirtler og / eller højere EtOH-koncentrationer. Alkoholforgiftning hos kvinder vil være meget mindre sandsynlig som ID-injektion af alle duktale træer i begge bryster, forudsat at 16 hovedkanaler16,17 og 2 ml pr. Kanal22,23, med 70% EtOH ville resultere i mindre end 0,1 g / dL EtOH-indhold i blod og kan forårsage mild svækkelse.
Røntgenbilleddannelse gør det muligt at bestemme, hvor vellykket intraduktal levering er i hver enkelt kirtel, og om hele duktaltræet er fyldt (figur 1, figur 2, figur 3). Real-time fluoroskopi billeddannelse som forberedelse til mikro-CT-scanning og / eller 3D-rekonstruktion af DICOM-fildata kan bruges til at vurdere omfanget af løsningslevering i duktaltræet og enhver lækage i stroma. Brug af fluoroskopi kan bidrage til at begrænse den samlede strålingsdosis, der pålægges dyret. Fluoroskopiteknikken nærmer sig tættere på den tilsigtede kliniske anvendelse til billedvejledning af denne ablative behandling. Sammenligning af FDA-godkendte jodholdige Isovue med tantaloxid (TaOx) nanopartikler er blevet udført for yderligere at forfine nytten af den ablative opløsning 4,19. Det har vist sig, at TaOx er et overlegent mikro-CT-kontrastmiddel end Isovue til visualisering af den indledende fyldning af det duktale træ i mus 4,19. Her demonstrerer vi, at TaOx er et egnet kontrastmiddel til at visualisere den indledende fyldning af rottetræet (figur 2 og figur 3). Både i translationel forskning og klinisk praksis er geleringsmidlet ethylcellulose (EC) blevet tilsat til EtOH-opløsningen for at minimere diffusion fra de tilsigtede målregioner 13,14,24,25,26,27,28,29. Undersøgelser har vist, at tilsætning af op til 1,5% EC til EtOH-holdige ablative opløsninger er kompatibel med TaOx-baseret billeddannelse (figur 3). Disse samt yderligere forbedringer af den ablative løsning kan hjælpe med klar oversættelse af denne billedstyrede procedure til klinikken.
Protocol
Alle de eksperimenter, der er beskrevet, blev udført under protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Michigan State University.
1. Udvidet antiinflammatorisk behandling
- Forbered sucralose gel kopper som oral dosering af carprofen. Giv rotter denne antiinflammatoriske behandling fra 2 dage før de får ID-injektion på 70% EtOH til 7 dage efter proceduren.
- Fortynd en arbejdsløsning af carprofen i steril PBS til injektion i koppen. Fra 50 mg/ml stamopløsning fremstilles en fortyndet 2 mg/ml opløsning farvet med 1% v/v sterilt blåt madfarvestof og injiceres 500 μL i hver kop. Tilsætning af farvestoffet hjælper med visualisering af fuldstændig blanding af lægemidlet i koppens sucralose.
- Følg producentens anbefaling for at forberede koppen til tilsætning af carprofen. Medmindre andet er angivet af sælgeren, opvarmes koppen i et vandbad ved 60 °C i 15 minutter og tørres af ved fjernelse for at reducere risikoen for kontaminering.
- Rengør låget på sucralosekoppen med 70% EtOH i området og indfør nålen på sprøjten, der indeholder carprofen-arbejdsløsningen. Dispenser det passende volumen (500 μL).
- Dæk punkteringen med et klistermærke. Ryst koppen energisk i 15 s, og placer derefter koppen i en hvirvel i yderligere 15 s. Vurder visuelt den homogene og komplette blanding inden opbevaring til senere brug. Se efter tilstedeværelsen af en mørkeblå farve.
BEMÆRK: Lad kopperne komme til stuetemperatur. Opbevar kopperne ved stuetemperatur, hvis det ønskes, men vær opmærksom på lægemiddeleffektivitetsvejledning fra producenten. Alternativt kan du opbevare kopperne ved 4 °C og bruge dem inden for en måned. Datering af klistermærket er en god praksis for at holde styr på injektionsdatoen uden risiko for, at en pen eller en skarp markør punkterer låget.
- Lige før brug skal du tørre ydersiden af koppen af med 70% EtOH. Fjern låget, inden du placerer koppen i dyreburet. Udskift kopper hver anden dag, eller når de er tomme. Kontroller niveauet af gel dagligt for at sikre tilstrækkelig dosering. En kop kan levere carprofen til op til to rotter i op til 2 dage; Rotter kan dog indtage hele koppen hurtigere.
2. Præoperativ forberedelse
BEMÆRK: Sørg for, at dyreforberedelsestrinnet går forud for ID-injektionsproceduren med 2-3 dage.
- Tænd for isofluranfordamperen (2% -3% isofluran, 1,5 l / min ilt) for at bedøve rotten. Flyt dyret til en næsekegle på en varmepude. Påfør øjensmøremiddel på rotten, og placer derefter dyret på ryggen. Overvåg omhyggeligt dyrets åndedræt for at sikre, at bedøvelsesplanet opretholdes ved 1% -3% isofluran.
BEMÆRK: En elektrisk barbermaskine kan bruges til at fjerne overskydende pels før depilering. Der skal udvises ekstrem forsigtighed for ikke at beskadige brystvorter med barbermaskinen. Af denne grund kan dette trin springes over. Rotter er mere følsomme over for hårfjerningscreme end mus, så fjernelsen af overskydende creme er meget vigtig. Undgå at injicere en ethanolholdig opløsning i et område, der allerede har en slid til stede fra depilering. Nogle cremer har tilsat forbindelser som aloe og lanolin, der kan hjælpe med at minimere sandsynligheden for slid. - Brug en applikator med bomuldsspids til at sprede over-the-counter hårfjerningscreme på brystvorten. Brug applikatoren til at gnide cremen ind i området i 10-30 s. Kontroller, om pelsen hurtigt er løsnet.
- Lad cremen sidde på rotten i det kortest mulige interval og fjern den helt for at undgå forbrænding af huden. Rotter er endnu mere følsomme over for denne procedure end mus.
- Efter 10-30 s påføring våd gasbind med varmt vand og brug det til at skylle cremen og den løsnede pels fra dyret. Udfør mindst tre skylninger af området med frisk fugtet gasbind og tør med tørt gasbind efter den sidste skylning. Bekræft god synlighed og adgang til det område af brystvorten, hvorfra pelsen fjernes. Gentag om nødvendigt hårfjerningsproceduren.
- Placer rotten i et rent bur på en varmepude og lad den komme sig. Kontroller rotten for at sikre, at den er helt genoprettet efter anæstesi, før den bringes tilbage til sit permanente bur.
- Anbring en carprofendoseret (1 mg/kop) sucralosegelkop i buret til antiinflammatorisk behandling. Kontroller gelforbruget dagligt og udskift med en frisk kop efter behov. Forlad ikke koppen i mere end 2 dage. Typisk skal kopper udskiftes efter 1 dag.
3. Intraduktal injektion
- TaO x-stamopløsningen fremstilles ved 333,3 mM som beskrevet19 ved hjælp af sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS). Varm opløsningen, hvis pulveret ikke opløses helt. Rør forsigtigt. Du må ikke hvirvle eller ryste kraftigt for at undgå dannelse af bobler.
- Bland tre dele 333,3 mM TaO x med syv dele 100% EtOH for en endelig 70% EtOH 100 mM/TaOx opløsning. Tilsæt eventuelt en passende mængde 0,5% -1,5% ethylcellulose (EC) som geleringsmiddel for at maksimere lokal retention af den ablative opløsning. Tilsæt 1% v/v blåt madfarvestof til den ablative opløsning til visuel undersøgelse af tilførslen i duktaltræet under infusion.
- Forbered et volumen, der passer til eksperimentelle behov. Kirtelpar 1 (cervikal) og 6 (inguinal) kan fyldes med op til 100 μL af opløsningen, mens alle andre par kan fyldes med op til 300 μL.
- Anæstetiser rotten som i trin 2.1 og flyt rotten til næsekeglen, når den er fuldt bedøvet. Påfør øjensmøremiddel på begge øjne, og læg derefter dyret på ryggen. Fastgør rotten under stereoskopet ved hjælp af tape nær brystvorterne, der vil blive injiceret, hvis det ønskes. Rottens vægt er generelt nok til at forhindre den i at bevæge sig væsentligt uden at tape.
- For at forberede brystvorterne til injektion skal du fjerne enhver død hud, der dækker brystvorteåbningen med fine spidse tang, hvis det er muligt. Rotter har ofte en prop, der stikker ud fra brystvorteåbningen, der kan forhindre vellykket kannulering af brystvorten, hvis den ikke fjernes.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at større injektionsmængder af ablative opløsninger, der anvendes til rotter, kan være mere tilbøjelige til at resultere i overfladiske hudsår nær injektionsstedet (-stederne). Af denne grund er injektion af hver anden brystvorte i en enkelt session mindre skadelig og irriterende for dyret end at injicere tilstødende brystvorter. Overvågning af rotterne for eventuelle hudafskrabninger i 7 dage efter injektion hjælper med at sikre, at dyret ikke kradser alvorligt og introducerer muligheden for infektion fra forurening med burgulvsaffald. Tredobbelt antibiotisk salve eller vasker med chlorhexidinopløsning kan anvendes til behandling af tegn på skadeinfektion, der måtte opstå (tabel 1). - Brug en 500 μL sprøjte med en 33 G nål til at aspirere 101-301 μL ablativ opløsning. Aspirer en ekstra 1 μL af opløsningen for mulig mindre lækage, når du fjerner den kanylede nål.
BEMÆRK: Dette er anbefalinger til mængder, der sigter mod fuldt ud at fylde det eller de duktale træer: op til 100 μL i livmoderhals- og lyskekirtler og op til 300 μL i de andre kirtler. Til andre applikationer kan det være hensigtsmæssigt at bruge mindre eller større mængder. - Brug en pincet til forsigtigt at holde brystvorten og kannulere nålen ind i brystvorteåbningen. Fortsæt forsigtigt med at indsætte nålen, indtil skrålen er helt inde i brystvorten. For at rumme nålen i brystvorten skal du føre brystvorten op mod nålen i stedet for at skubbe nålen ned i brystvorten. (Tabel 1). Pas på at følge stien til brystvorteåbningen.
BEMÆRK: Rottenipler er generelt meget lettere at manipulere og kannulere med succes end dem hos mus på grund af større størrelse. Den øgede mængde fedt, der omgiver brystvorteåbningen, gør det imidlertid også mere sandsynligt, at fedtpuden fejlagtigt injiceres, hvis nålen afviger fra hovedkanalen. - Når nålesvinget er helt indsat, tilføres opløsningen langsomt med en konstant hastighed på ca. 100 μL/min hos rotter. Abrupte ændringer i infusionshastigheden kan briste eller beskadige det duktale træ. Vent i 30 s efter infusionens afslutning, før du fjerner nålen fra det kannulerede træ med hjælp ved hjælp af tang; dette sikrer, at det injicerede volumen forbliver inden for duktaltræet (figur 2) og reducerer sandsynligheden for lækage.
- Rengør enhver spildt opløsning med fugtet gaze eller en EtOH-aftørring for at undgå fremmed kontrastopløsning i billederne.
- PBS indeholdende 5% saccharose (10 ml/kg) injiceres intraperitonealt for at afbøde virkningerne af alkoholforgiftning, hvis ethanol er indeholdt i ID-injektionsopløsningerne. Denne dosis kan gives i begyndelsen og ved afslutningen af proceduren.
4. Mikro-CT-billeddannelse
- Når alle de ønskede kirtler er blevet injiceret, skal du flytte dyret hurtigt til mikro-CT-systemet og fortsætte med at opretholde anæstesi ved hjælp af den inkorporerede isofluranfordamper.
- Ret dyrets rygsøjle og tape hvert bagben i en udvidet position, så dyrets benben vil være længere væk fra de nedre kirtler af interesse og ikke overlappe med interesseområdet i det scannede billede.
- Tape over maven for at minimere vejrtrækningsartefakter, hvis du scanner de nedre kirtler.
BEMÆRK: Dyr kan afbildes med forskellige scanningsparametre (f.eks. høj opløsning, langsgående scanninger), hvis der sørges for at bestemme en passende acceptabel livstidsdosis af stråling for rotter og sikre, at den kumulative dosis ikke overstiger dette niveau. Strålingseksponeringen kan reduceres yderligere ved at erhverve fluoroskopi stillbilleder og videoer uden at udføre scanninger (figur 2). - Udfør TaOx-billeddannelse af rottetræet med god opløsning og mulighed for gentagne standard (2 min) anskaffelsesscanninger ved hjælp af følgende scanningsparametre: 90 kVp/88 μA; synsfelt (FOV), 72 mm; antal skiver, 512; skive tykkelse, 72 μm; Voxel opløsning, 72 μm3. Scanninger i høj opløsning i længere perioder (4-14 min) kan også erhverves hos dyr, der ikke scannes i længderetningen ved hjælp af de samme parametre.
- Efter dataindsamling skal du forsigtigt tage rotten væk fra anæstesikeglen og placere den i et nyt rent bur på en varmepude. Kontroller rotten for at sikre, at den er kommet sig helt efter anæstesi, før den bringes tilbage til sit permanente bur. Den carprofenholdige sucralosekop anbringes og udskiftes korrekt som beskrevet i trin 2.5 for at sikre, at dyrene fortsat får antiinflammatorisk behandling de næste 7 dage.
- Behandl de scannede billeder til hurtige gengivelser i mikro-CT-softwaren for bedre at forstå eventuelle kontrastlækager, kun delvis udfyldning eller overfyldning (figur 2).
- Fortsæt til næste afsnit for at udføre formel billedbehandling til offentliggørelse eller detaljeret analyse af scanninger, hvis det ønskes (figur 3).
5. Billedanalyse
- Brug specialiserede softwarepakker til at producere gengivelser af det fyldte kanaltræ.
BEMÆRK: Det er bedst at segmentere brystfedtpuden for at få den bedste gengivelse af det injicerede duktale træ. Spline sporer fedtpuden mørke grænser gennem hele dyrets tykkelse for at opnå denne segmentering. - For at segmentere fedtpuden (i modsætning til mus er grænserne for dette rum ikke så let at skelne fra bughulen, lårmusklerne og huden på grund af lignende Hounsfield-enheder), inden for hvilke det duktale træ af interesse er indeholdt, er valg af "spline trace" -indstillingen fra manuelmenuen det første skridt i at skabe en gengivelse.
- Spline sporer fedtpudekonturen i hver tredje skive. Klik på indstillingen Propagate Objects fra den halvautomatiske menu. Dette vil formere og forbinde alle skiverne til et enkelt segmenteret objekt af interesse.
BEMÆRK: Ændring af tærsklen inden for det segmenterede område tillader kun visualisering af signalet inden for et bestemt interval af Hounsfield-enheder (HU); For andre kontrastmidler eller billeddannelsesparametre skal dette interval muligvis justeres. En softwarepakke eller kunstig intelligensanalyse kan bruges til at foretage andre målinger og billeder for at vise, hvor meget det duktale træ blev fyldt. - Indstil HU-værdier til et lavpunkt på 300 og et højdepunkt på 3.000 i den halvautomatiske menu under fanen tærskelvolumen. Dette gør det muligt at oprette en gengivelse, der kun viser kontrasten (TaOx) i det duktale træ.
- Indstil gengivelsen som primær ved hjælp af knappen "vis". Dette ændrer displayet til kun at vise 3D-gengivelsen af duktaltræet.
BEMÆRK: Udfør rekonstruktion af det duktale træ til yderligere analyse.
Representative Results
Hver af de 12 brystkirtler hos en kvindelig rotte indeholder et enkelt duktalt træ, der åbner ved brystvorteåbningen. På trods af forskellene i størrelse mellem musen og rotten er udviklingstidspunktet for brystkirtlerne og det tidspunkt, hvor disse dyr når voksenalderen, meget ens30,31. En kort beskrivelse af de vigtigste stadier af brystkirteludvikling hos rotter som repræsentativ for begge gnaverarter er givet. Terminale endeknopper (TEB'er) er de meget proliferative strukturer ved spidserne af det aflange duktale træ, der direkte duktal forgrening30,31. Toppen af spredning og tæthed af TEB'erne forekommer ved 3-4 ugers alder i den langstrakte fase af det duktale træ i pubertetsudvikling30. Ved 9-10 ugers alderen er der få TEB'er tilbage, da det duktale træ er vokset til at optage hele længden af fedtpuden30. Derefter er vækst og udvidelse af det duktale træ proportional med fedtpuden og dyret32. Terminale duktale lobulære enheder (TDLU'er) i det menneskelige bryst udfører en lignende rolle som TEB'erne hos gnavere. TDLU'er er den vigtigste kilde til initiering af carcinogenese og progression til BC33,34. Vi kan injicere op til 300 μL 70% EtOH-opløsning for at fylde hele det duktale træ i thorax- og mavebrystkirtlerne i den 9 uger gamle Sprague-Dawley-rotte (figur 1, figur 2, figur 3). I modsætning til mus 20 er brystvorterne i livmoderhals- og lyskekirtlerne hos Sprague-Dawley-rotterne typisk egnede til injektion i mere end 80% af dyrene, og der kræves op til 100 μL70% EtOH-opløsning for at fylde hele duktaltræet (figur 2). Vi injicerer rutinemæssigt op til 10 brystkirtler med den undersøgte ablative opløsning. Et typisk eksperimentelt design består af to uafhængige ugentlige ID-injektionssessioner, hvor fem vekslende kirtler infunderes med den ablative opløsning indeholdende røntgenkontrastmiddel og / eller EC som geleringsmiddel (figur 2). For TaOx-indeholdende (50-200 mM) ablativ opløsning udføres fluoroskopi og/eller mikro-CT-scanning efter afslutningen af hver session for at bestemme og registrere den individuelle succes med at tilføre hvert duktalt træ delvis eller fuld mængde infunderet opløsning (figur 2). Øjeblikkelig og langsgående billeddannelse efter injektion gør det muligt at vurdere, hvordan ændringer i formuleringen, især koncentrationen af EC geleringsmiddel, påvirker og begrænser udadgående diffusion af den ablative opløsning som funktion af det injicerede volumen (figur 3). Denne billeddannelsesanalyse giver information til at forstå de optimale parametre for at opnå maksimal ablation med minimal sikkerhedsvævsskade.
Figur 1: Skemaer over proceduren for intraduktal injektion og billedanalyse hos rotter. Den trinvise procedure for intraduktal injektion og billedanalyse fremhæves. Se videoen for flere detaljer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på brystvorte kannulation og levering resultat af den ablative opløsning i flere brystkirtler . (A) Typisk præsentation af brystvorteformer i Sprague-Dawley rottestammen. Brystvortens længde korrelerer med sandsynligheden for vellykket kannulation. Længere brystvorter er lettere at kannulere end korte brystvorter, mens alt for korte eller vestigiale brystvorter ikke kan kanyleres. Når de er kanyleret, kan både lange og korte brystvorter infunderes med løsningen og opnå lignende succesrater for levering. Blåt madfarvestof i den injicerede opløsning kan anvendes som in vivo-bevis for duktal træfyldning og leveringssucces (mest tydeligt, kuppeldannelse, til en mislykket fedtpudeinjektion). Real-time fluoroskopi (B) og 3D mikro-CT-gengivelser genereret efter billedoptagelse (C) giver in vivo bevis for leveringssucces og mere kvantitativ vurdering af løsningen, der når TEB'erne. (B) Hver abdominal brystkirtel i det første par (# 4, # 10) modtog ablativ opløsning med 1% EC (orange kontur) eller uden den (grøn kontur) (C) Vellykket levering (blå kontur) af den ablative opløsning i højre cervikale , andet par thorax (# 3, # 9) og første par abdominale (# 4, # 10) brystkirtler og mislykket injektion (stiplet hvid kontur) i venstre thorax kirtel. Skalabjælker svarer til 1 mm i billederne ved forskellig forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: 3D-rekonstruktion og vurdering af fyldning og diffusion af ablativ opløsning . 70% EtOH/100 mM TaOx nanopartikler med 1% EC (øverst) eller uden EC (nederst) blev intraduktalt injiceret i det andet abdominale brystkirtelpar (#4 og #10) og straks afbildet af mikro-CT. Hver Sprague-Dawley rotte modtog et stigende volumen af begge opløsninger. Individuelle duktale træer blev rekonstrueret ved hjælp af en billedanalysesoftwarepakke (spline trace + propagate object + threshold rendition). Med 1% EC kan løsningen ses nå terminalenderne. Efterhånden som den leverede mængde øges, er antallet af fyldte TEB'er mere tydeligt. Vægtstangen svarer til 10 mm i alle gengivelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Spørgsmål | Udseende | Opløsning | |||
| Kort brystvorte (fig. 2) | Brystvorten har lav profil – svær at få fat i | Det er nogle gange lettere at holde huden nær brystvorten og målrette midten af brystvorten med nålen. Nålen vil sandsynligvis dykke under huden. At trække langsomt op kan afsløre, at brystvorten er lidt over spidsen af nålen og giver plads til at gribe og trække den resten af vejen på nålen. Vær meget forsigtig, når du dykker under huden om nålens vinkel. Det er let at utilsigtet få en fedtpudeinjektion ved at stikke i den forkerte vinkel. | |||
| Injektion af fedtpude (fig. 2) | Hævet omkring brystvorten og muligvis i selve brystvorten – nemmest at se om der tilsættes farve til injektionsopløsningen | Hvis brystvorten hæver med de første par ul injiceret, skal du fjerne nålen og forsøge at indsætte igen med mere omhu af vinklen. Begynd injektionen igen og se efter yderligere hævelse. Hvis hævelsen fortsætter, skal du opgive forsøget. Det er meget sjældent, at det lykkes at injicere en brystvorte, der er startet som en fedtpudeinjektion. | |||
| Sår/skurv | Åbent sår eller skorpe nær injektionsstedet for EtOH-opløsning | Rotter er mere tilbøjelige end mus til at udvikle sår eller skorpe nær injektionsområdet. Hvis der findes sår, skal du anvende tredobbelt antibiotisk salve på åbne sår, men lad skorpede sår være i fred. Anvendelse af salve på skorper kan øge sandsynligheden for, at dyret vil genere skurven og fjerne den. Kontroller hver 1-2 dag, indtil den er helet afhængigt af sværhedsgraden af såret. Carprofen bør gives, indtil det heles, selvom det er ud over det normale vindue. | |||
| Injicer vekslende kirtler | NIELSEN | Større injektionsvolumener hos rotter gør det mere sandsynligt, at det forårsager hudafskrabninger, hvis der injiceres på hinanden følgende kirtler. For mindst sandsynlighed for traumer til injektionsområdet injiceres alternative kirtler inden for en enkelt session (dvs. injicer # 1, 3, 4 og 6 i stedet for # 1-4). Afstand mellem tredje (# 3 og # 9) og fjerde (# 4 og # 10) kirtelpar tillader injektion af begge disse kirtler i en session. | |||
Tabel 1: Nyttige tip og fejlfinding
Discussion
Som vist her ablaterer ID-levering af 70% EtOH fortrinsvis brystepitelcellerne med begrænset sikkerhedsskade på den omgivende stroma og vaskulatur hos mus4. Lokal ablation af det duktale træ er effektiv til at forhindre tumordannelse i musemodeller4. Her demonstrerer vi, at denne ablative procedure kan skaleres op til rotter.
Dette er det næste skridt på vejen til oversættelse af denne ablative procedure som en alternativ intervention til profylaktisk mastektomi til primær forebyggelse af brystkræft hos højrisikopersoner. Tilsætning af TaOx nanopartikler som et røntgenkontrastmiddel til den ablative opløsning gør det muligt at vurdere opløsningens effektivitet til forebyggelse af tumordannelse, da det kan bestemmes, om proceduren var vellykket eller ej ved fuldstændig fyldning af det duktale træ. Brug af fluoroskopi til at visualisere den injicerede brystkirtel afspejler, hvad der sandsynligvis vil blive gjort i klinikken for at guide denne ID-procedure. Billedvejledning af, hvor meget opløsningen har fyldt det duktale træ, og hvornår infusionen skal stoppes, vil være et centralt aspekt af den kliniske implementering for at sikre maksimal fyldning af hvert duktalt træ. Fejlfinding og nyttige tip er angivet i tabel 1. Effektiviteten af denne ablative procedure kræver, at den infunderede opløsning kommer i direkte kontakt med alle epitelcellerne for at maksimere hastigheden af celledrab. Reserveepitelceller i et eller flere træer kan i sidste ende tjene som en kilde til BC-udvikling. De andre grupper rapporterede ID-levering af virale partikler (f.eks. komponenter i Cre/LoxP og/eller Cas9/CRISPR-systemer), hormoner og hormonantagonister (f.eks. prolaktin, fulvestrant), kemoterapeutiske midler (f.eks. cisplatin), siRNA'er og/eller antistoffer eller andre målretningsmidler hos mus 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, rotter 21,33,46,47,48 og/eller kaniner 18,49,50,51,52,53 . Vellykket kannulation af op til otte duktale træer pr. humant bryst til lokal levering af kemoterapi er blevet rapporteret i uafhængige kliniske studier 47,54,55. Billedvejledning til infusion af disse andre løsninger rettet mod tumorforebyggelse eller rettet mod lokal behandling ville ligeledes maksimere deres effektivitet.
Skalerbarheden og forfiningen af denne procedure fra mus til rottekanaltræ demonstreres her. TaOx nanopartikel i murine 4,19 og rotte (upublicerede data) duktale træ giver billeddannelse i høj opløsning, der overgår de FDA-godkendte jodholdige røntgenkontrastmidler. På samme måde er vi uvidende om andre duktale træbilleddannelsesmetoder hos mus40,41 eller andre dyremodeller18, der kan give sammenlignelig opløsning til TaOx. Relevant for klinisk oversættelse er det faktum, at geleringseffekten af EC i denne mellemliggende rottemodel er en muliggørende formuleringsforfining for at minimere sikkerhedsvævsskade. Da vi fortsætter med at vurdere denne ablative ID-procedure for dens evne til at forhindre BC, vil vi være i stand til mere præcist at bestemme, hvorfra kirtler BC udvikler sig gennem de tilføjede oplysninger, der leveres af billeddannelse efter ID-levering i kemisk inducerede og andre rottemodeller af BC. Disse data vil bestemme sikkerheden ved denne procedure og lokalisere eventuelle bekymringer eller mangler ved, om delvise eller mislykkede behandlede duktale træer kan være mere tilbøjelige til at udvikle BC hos en højrisikokvinde.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute R21 CA226579 og R01 CA258314 tilskud til LFS og af National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 tilskud til EMS. Vi er taknemmelige for MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core facilitet for brug af deres billeddannelsessystemer og tekniske ekspertise. Vi takker Dr. Danielle Ferguson for at have gennemgået indholdet af videoen og tallene for overholdelse af dyrevelfærdsretningslinjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Wild, C. P. The global cancer burden: necessity is the mother of prevention. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 123-124 (2019).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal of Gastroenterology. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the breast treated with percutaneous ethanol injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutic Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Faguy, K. Ductography: When, how, and why. Radiologic Technology. 92 (5), 487-503 (2021).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (121), e55209 (2017).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Kenyon, E., et al. Intraductal delivery and x-ray visualization of ethanol-based ablative solution for prevention and local treatment of breast cancer in mouse models. Journal of Visualized Experiments. (182), e63457 (2022).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Lai, Y. E., Morhard, R., Ramanujam, N., Nolan, M. W. Minimally invasive ethyl cellulose ethanol ablation in domesticated cats with naturally occurring head and neck cancers: Six cats. Veterinary and Comparative Oncology. 19 (3), 492-500 (2021).
- Mueller, J. L., et al. Optimizing ethyl cellulose-ethanol delivery towards enabling ablation of cervical dysplasia. Scientific Reports. 11 (1), 16869 (2021).
- Nief, C., et al. Polymer-assisted intratumoral delivery of ethanol: Preclinical investigation of safety and efficacy in a murine breast cancer model. PLoS One. 16 (1), 0234535 (2021).
- Chelales, E., et al. Radiologic-pathologic analysis of increased ethanol localization and ablative extent achieved by ethyl cellulose. Scientific Reports. 11 (1), 20700 (2021).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Trans Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Russo, I. H., Russo, J. Developmental stage of the rat mammary gland as determinant of its susceptibility to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. Journal of the National Cancer Institute. 61 (6), 1439-1449 (1978).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Research Treatment. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Scientific Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast - A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 907-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translational Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. The Biochemical Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Preview Research (Phila). 6 (1), 51-58 (2013).
