Summary
Ett förfarande för leverans av en kemisk ablativ lösning till råttans bröstduktala träd för bildstyrd förebyggande behandling av bröstcancer beskrivs. Bröstepitelceller kan riktas mot minimal säkerhetsvävnadsskada genom kannulering direkt i nippelöppningen och intraduktal infusion av en 70% etanolbaserad ablativ lösning.
Abstract
Det finns fortfarande ett begränsat antal primära insatser för att förebygga bröstcancer. För kvinnor med hög risk att utveckla bröstcancer är det mest effektiva ingreppet profylaktisk mastektomi. Detta är ett drastiskt kirurgiskt ingrepp där bröstepitelcellerna som kan ge upphov till bröstcancer avlägsnas helt tillsammans med den omgivande vävnaden. Målet med detta protokoll är att visa genomförbarheten av ett minimalt invasivt intraduktalt förfarande som kan bli ett nytt primärt ingrepp för förebyggande av bröstcancer. Detta lokala förfarande skulle företrädesvis ablatera bröstepitelceller innan de kan bli maligna. Intraduktala metoder för att leverera lösningar direkt till dessa epitelceller i gnagarmodeller av bröstcancer har utvecklats vid Michigan State University och på andra håll. Råttbröstkörteln består av ett enda duktalt träd som har en enklare och mer linjär arkitektur jämfört med det mänskliga bröstet. Kemiskt inducerade råttmodeller av bröstcancer erbjuder dock värdefulla verktyg för proof-of-concept-studier av nya förebyggande interventioner och skalbarhet från musmodeller till människor. Här beskrivs ett förfarande för intraduktal leverans av en etanolbaserad ablativ lösning innehållande tantaloxidnanopartiklar som röntgenkontrastmedel och etylcellulosa som gelningsmedel i råttmjölkens duktala träd. Tillförsel av vattenhaltiga reagenser (t.ex. cytotoxiska föreningar, siRNA, AdCre) genom intraduktal injektion har beskrivits tidigare i mus- och råttmodeller. Denna protokollbeskrivning betonar metodologiska förändringar och steg som unikt avser att leverera en ablativ lösning, formuleringsöverväganden för att minimera lokala och systemiska biverkningar av den ablativa lösningen och röntgenavbildning för in vivo-bedömning av duktal trädfyllning. Fluoroskopi och mikro-CT-tekniker gör det möjligt att bestämma framgången för ablativ lösningsleverans och omfattningen av duktal trädfyllning tack vare kompatibilitet med det tantalhaltiga kontrastmedlet.
Introduction
För kvinnor i USA1 fortsätter bröstcancer (BC) att vara den mest diagnostiserade cancertypen och orsakar fler dödsfall än någon annan cancertyp utom lungcancer. Prognoser för 2022 uppskattar att 51 400 kvinnor kommer att diagnostiseras med karcinom in situ och 287 850 kvinnor kommer att diagnostiseras med invasivt karcinom och att 43 600 kvinnor kommer att dö av BC1. Trots prevalensen och dödligheten i samband med BC finns det få alternativ tillgängliga för primärprevention och translationell forskning om nya interventioner eftersom primärprevention inte prioriteras av federala myndigheter2. Profylaktisk mastektomi är det mest effektiva ingreppet för primärprevention. Detta förfarande rekommenderas dock endast för högriskindivider eftersom det är en större operation med livsförändrande konsekvenser3. Denna operation innebär fullständigt avlägsnande av bröstepitelcellerna från vilka cancerframkallande utvecklas såväl som den normala omgivande vävnaden. Individer avskräcks ofta från att använda denna procedur som sitt första alternativ för primärt ingripande på grund av de negativa effekterna av fysisk, psykisk och social stress. Av dessa skäl väljer även vissa högriskindivider att inte genomgå denna procedur och väljer istället vaksam väntan eller liknande övervakningsstrategier3. I tidigare publikation var leverans av 70% etanol (EtOH) direkt i det duktala trädet i musmodeller effektiv vid kemiskt ablating bröstepitelceller med begränsad skada på intilliggande normal vävnad och för att förhindra brösttumörbildning4. EtOH används i flera kliniska tillämpningar som antingen ett ablativ medel för lokal behandling av vissa cancerformer eller skleroserande medel för lokal behandling av arteriovenös svullnad och missbildningar 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Den låga toxiciteten och säkerhetsprofilen för EtOH är väl etablerad, eftersom i vissa procedurer upp till 50 ml 95% EtOH kan administreras per session 5,10.
Fullständigt avlägsnande av bröstepitelceller från vilka BC utvecklas är den mest avgörande komponenten i både profylaktisk mastektomi och lokal leverans av en ablativ lösning. Därför är bekräftelse av fullständig duktal trädfyllning nödvändig för att garantera att den ablativa lösningen har kommit i direkt kontakt med alla bröstepitelceller. Att leverera en lösning inom duktalträden och dess visualisering genom bildstyrd genomlysning eller duktografi är möjligt genom kliniska procedurer som redan finns15,16,17. Således kommer det att vara möjligt att enkelt genomföra och utvärdera denna procedur i kliniska prövningar. Ett viktigt steg för att fastställa effekten och translationell genomförbarhet av intraduktal (ID) ablation som en ny intervention för primärprevention kommer att vara att demonstrera genomförbarheten av denna röntgenvisualiseringsmetod i djurmodeller av ökande storlek och komplexitet i deras duktala trädarkitektur 4,18,19. Ett protokoll som skalar upp denna ablativa procedur från mus20 till råttmodeller beskrivs här. Medan mus- och råttduktala träd har en liknande linjär struktur och förgreningsmönster, är råttduktalträdet proportionellt större och omges av en mycket tätare stroma. Vi har implementerat en metod i laboratoriet för att framgångsrikt injicera varje bröstkörtel i en råtta under en serie veckosessioner med en ablativ lösning som innehåller ett kontrastmedel. Sessionsavstånd är nödvändigt för att säkerställa att djuren har minimala biverkningar av EtOH (figur 1 och figur 2). Förfarandet innefattar injektion av den ablativa lösningen direkt i nippelöppningen hos en isofluran-bedövad råtta med en 33 G nål. Några viktiga förbättringar av proceduren inkluderar användning av utökad antiinflammatorisk behandling, injektion av högre volymer per duktalt träd än vad som föreslås21 och gastäta sprutor för vätska och gaser. Behandlingstiden med 5 mg/kg karprofen (ett NSAID) från 48 timmar före till 1 vecka efter ID-injektioner är jämförbar med det antiinflammatoriska protokoll som används för skleroserande behandling av venös missbildning i kliniken. Behandlingen utförs på patienter under systemisk anestesi följt av 2 dagars antiinflammatoriska läkemedel såsom NSAID. Den antiinflammatoriska behandlingen kan förlängas med ytterligare några dagar för att minska lokal inflammation och eventuell smärta13. Som hos möss20 mildrar intraperitoneal injektion av en 5% sackaroslösning den kortsiktiga effekten av alkoholförgiftning hos råttor. Råttor kan injiceras med upp till 1 ml 70% EtOH (upp till 4 kanaler; 0,2 g / dL EtOH-innehåll i blod) i en enda session när de administreras med denna sackaroslösning; djur återhämtar sig helt inom 4 timmar efter ID-injektioner. Vi utför sekventiella sessioner för att ge tillräckligt med återhämtningstid när vi injicerar mer än 4 körtlar och / eller högre EtOH-koncentrationer. Alkoholförgiftning hos kvinnor kommer att vara mycket mindre sannolikt eftersom ID-injektion av alla duktala träd i båda brösten, förutsatt att 16 huvudkanaler16,17 och 2 ml per kanal22,23, med 70% EtOH skulle resultera i mindre än 0,1 g / dL EtOH-innehåll i blod och kan orsaka mild försämring.
Röntgenavbildning gör det möjligt att bestämma hur framgångsrik intraduktal leverans är i varje enskild körtel och om hela duktalträdet är fyllt (figur 1, figur 2, figur 3). Genomlysningsavbildning i realtid som förberedelse för mikro-CT-skanning och / eller 3D-rekonstruktion av DICOM-fildata kan användas för att bedöma omfattningen av lösningsleverans till det duktala trädet och eventuellt läckage i stroma. Användning av fluoroskopi kan bidra till att begränsa den totala strålningsdosen på djuret. Genomlysningstekniken approximerar närmare den avsedda kliniska applikationen för bildvägledning av denna ablativa behandling. Jämförelse av FDA-godkända jodinnehållande Isovue med tantaloxid (TaOx) nanopartiklar har utförts för att ytterligare förfina nyttan av den ablativa lösningen 4,19. Det har visat sig att TaOx är ett överlägset mikro-CT-kontrastmedel än Isovue för visualisering av den initiala fyllningen av det duktala trädet i möss 4,19. Här visar vi att TaOx är ett lämpligt kontrastmedel för att visualisera den initiala fyllningen av råttans duktala träd (figur 2 och figur 3). Både i translationell forskning och kliniska praxisapplikationer har gelningsmedlet etylcellulosa (EC) tillsatts till EtOH-lösningen för att minimera diffusion från de avsedda riktade regionerna 13,14,24,25,26,27,28,29. Studier har visat att tillägg av upp till 1,5% EC till EtOH-innehållande ablativa lösningar är kompatibelt med TaOx-baserad avbildning (figur 3). Dessa samt ytterligare förbättringar av den ablativa lösningen kan hjälpa till med färdig översättning av denna bildstyrda procedur till kliniken.
Protocol
Alla experiment som beskrivs utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Michigan State University.
1. Förlängd antiinflammatorisk behandling
- Förbered sukralos gelkoppar som oral dosering av karprofen. Ge råttor denna antiinflammatoriska behandling från 2 dagar innan du får ID-injektion av 70% EtOH till 7 dagar efter proceduren.
- Späd en arbetslösning av karprofen i steril PBS för injektion i koppen. Från 50 mg / ml stamlösning, bered en utspädd 2 mg / ml lösning färgad med 1% v / v sterilt blått livsmedelsfärgämne och injicera 500 μl i varje kopp. Tillsats av färgämnet hjälper till att visualisera fullständig blandning av läkemedlet i koppens sukralos.
- Följ tillverkarens rekommendation för att förbereda koppen för tillsats av carprofen. Om inget annat anges av säljaren, värm koppen i ett vattenbad vid 60 °C i 15 minuter och torka av vid borttagning för att minska risken för kontaminering.
- Torka av locket på sukralosekoppen med 70% EtOH i området och inför nålen på sprutan som innehåller karprofenarbetslösningen. Fördela lämplig volym (500 μl).
- Täck punkteringen med en klistermärke. Skaka koppen energiskt i 15 s och lägg sedan koppen i en virvel i ytterligare 15 s. Visuellt bedöma den homogena och fullständiga blandningen innan den lagras för senare användning. Leta efter närvaron av en mörkblå färg.
OBS: Låt kopparna komma till rumstemperatur. Förvara kopparna vid rumstemperatur om så önskas men var uppmärksam på läkemedelseffektivitetsvägledning från tillverkaren. Alternativt kan du förvara muggarna vid 4 °C och använda dem inom en månad. Datering av klistermärket är en bra metod för att hålla reda på injektionsdatumet utan risk för att en penna eller skarp markör punkterar locket.
- Torka av utsidan av koppen med 70% EtOH före användning. Ta bort locket innan du placerar koppen i djurburet. Byt ut koppar varannan dag eller när de är tomma. Kontrollera nivån av gel dagligen för att säkerställa adekvat dosering. En kopp kan leverera carprofen för upp till två råttor i upp till 2 dagar; Råttor kan dock konsumera hela koppen tidigare.
2. Preoperativ förberedelse
OBS: Se till att djurberedningssteget föregår ID-injektionsproceduren med 2-3 dagar.
- Slå på isofluranförångaren (2%-3% isofluran, 1,5 L/min syre) för att bedöva råttan. Flytta djuret till en näskotte på en uppvärmningsplatta. Applicera ögonsmörjmedel på råttan och placera sedan djuret på ryggen. Noggrant övervaka djurets andning för att säkerställa att bedövningsplanet hålls vid 1% -3% isofluran.
OBS: En elektrisk rakhyvel kan användas för att ta bort överflödig päls före depilering. Extrem försiktighet måste vidtas för att inte skada några bröstvårtor med rakhyveln. Av denna anledning kan detta steg hoppas över. Råttor är känsligare för hårborttagningskräm än möss, så avlägsnandet av överskott av grädde är mycket viktigt. Undvik att injicera en etanolhaltig lösning i ett område som redan har en nötning från depilering. Vissa krämer har tillsatt föreningar som aloe och lanolin som kan hjälpa till att minimera sannolikheten för nötning. - Använd en bomullsspetsapplikator för att sprida den receptfria hårborttagningskrämen på bröstvårtan. Använd applikatorn för att gnugga grädden i området i 10-30 s. Kontrollera om pälsen snabbt har lossnat.
- Lämna krämen på råttan under kortast möjliga intervall och ta bort helt för att undvika brännande av huden. Råttor är ännu känsligare för denna procedur än möss.
- Efter 10-30 s applicering, våt gasbindning med varmt vatten och använd det för att skölja grädden och den lossade pälsen från djuret. Utför minst tre sköljningar av området med färsk fuktad gasbindning och torka med torr gasbindning efter den slutliga sköljningen. Bekräfta god synlighet och tillgång till bröstvårtans område där pälsen tas bort. Upprepa hårborttagningsproceduren om det behövs.
- Placera råttan i en ren bur på en värmepanna och låt den återhämta sig. Kontrollera råttan för att se till att den är helt återställd från anestesi innan du tar tillbaka den till sin permanenta bur.
- Placera en karprofendoserad (1 mg/kopp) sukralos gelkopp i buren för antiinflammatorisk behandling. Kontrollera gelförbrukningen dagligen och ersätt med en ny kopp efter behov. Lämna inte koppen i mer än 2 dagar. Vanligtvis måste koppar bytas ut efter 1 dag.
3. Intraduktal injektion
- Bered TaOx stamlösningen vid 333,3 mM enligt beskrivningen19 med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Värm lösningen om pulvret inte löser sig helt. Rör om försiktigt. Virvla inte eller skaka kraftigt för att undvika bubbelbildning.
- Blanda tre delar av 333,3 mM TaO x med sju delar 100% EtOH för en slutlig 70% EtOH 100 mM/TaOx lösning. Tillsätt eventuellt en lämplig mängd av 0,5%-1,5% etylcellulosa (EC) som gelningsmedel för att maximera lokal retention av den ablativa lösningen. Tillsätt 1% v/v blått matfärgämne till den ablativa lösningen för visuell undersökning av tillförseln i det duktala trädet under infusionen.
- Förbered en volym som är lämplig för experimentella behov. Körtelpar 1 (livmoderhals) och 6 (ljumsk) kan fyllas med upp till 100 μl av lösningen medan alla andra par kan fyllas med upp till 300 μl.
- Bedöva råttan som i steg 2.1 och flytta råttan till näskonen när den är helt bedövad. Applicera ögonsmörjmedel på båda ögonen och placera sedan djuret på ryggen. Säkra råttan under stereoskopet med tejp nära bröstvårtorna som ska injiceras, om så önskas. Råttans vikt är i allmänhet tillräcklig för att förhindra att den rör sig väsentligt utan tejpning.
- För att förbereda bröstvårtorna för injektion, ta bort all död hud som täcker bröstvårtöppningen med fina spetsiga pincett, om möjligt. Råttor har ofta en plugg som sticker ut från bröstvårtöppningen som kan förhindra framgångsrik kannulering av bröstvårtan om den inte tas bort.
OBS: Det är viktigt att notera att större injektionsvolymer av ablativa lösningar som används på råttor kan vara mer benägna att resultera i ytliga hudsår nära injektionsstället (erna). Av denna anledning är injektion av varannan bröstvårtor i en enda session mindre skadlig och irriterande för djuret än att injicera intilliggande bröstvårtor. Övervakning av råttorna för eventuella nötningar i 7 dagar efter injektionen bidrar till att säkerställa inga allvarliga hälsoeffekter från djurets repor och införa risken för infektion från kontaminering med burgolvskräp. Trippel antibiotisk salva eller tvättar med klorhexidinlösning kan användas för att behandla eventuella tecken på skadeinfektion som kan uppstå (tabell 1). - Använd en 500 μL spruta med en 33 G nål för att aspirera 101-301 μL ablativ lösning. Aspirera ytterligare 1 μl av lösningen för eventuellt mindre läckage när du tar bort den kannulerade nålen.
OBS: Detta är rekommendationer för volymer som syftar till att helt fylla duktalträden: upp till 100 μL i livmoderhals- och ljumskkörtlar och upp till 300 μL i de andra körtlarna. För andra applikationer kan det vara lämpligt att använda mindre eller större volymer. - Använd en pincett för att försiktigt hålla i bröstvårtan och kannulera nålen i bröstvårtöppningen. Fortsätt försiktigt att sätta in nålen tills avfasningen är helt inne i bröstvårtan. För att få plats med nålen i bröstvårtan, för bröstvårtan upp mot nålen istället för att trycka ner nålen i bröstvårtan. (Tabell 1). Var noga med att följa nippelöppningens väg.
OBS: Råtta bröstvårtor är i allmänhet mycket lättare att manipulera och kannulera framgångsrikt än de hos möss på grund av större storlek. Den ökade mängden fett som omger nippelöppningen gör det dock också mer troligt att felaktigt injicera fettkudden om nålen avviker från huvudkanalen. - När nålfasningen är helt isatt, infusera lösningen långsamt med en konstant hastighet av cirka 100 μl/min hos råttor. Abrupta förändringar i infusionshastigheten kan brista eller skada duktalträdet. Vänta i 30 s efter infusionens slut innan du tar bort nålen från det kannulerade trädet med hjälp av pincett; Detta säkerställer att den injicerade volymen förblir i det duktala trädet (figur 2) och minskar sannolikheten för läckage.
- Rengör alla spillda lösningar med fuktad gasväv eller en EtOH-torkduk för att undvika främmande kontrastlösning i bilderna.
- Injicera PBS innehållande 5% sackaros (10 ml/kg) intraperitonealt för att mildra effekterna av alkoholförgiftning om etanol finns i ID-injektionslösningarna. Denna dos kan ges i början och i slutet av proceduren.
4. Mikro-CT-avbildning
- När alla önskade körtlar har injicerats, flytta djuret snabbt till mikro-CT-systemet och fortsätt att upprätthålla anestesi med hjälp av den införlivade isofluranförångaren.
- Räta ut djurets ryggrad och tejpa varje bakben i ett utsträckt läge, så att djurets benben kommer längre bort från de nedre körtlarna av intresse och inte överlappar med det intressanta området i den skannade bilden.
- Tejpa över buken för att minimera andningsartefakter om du skannar underkörtlarna.
OBS: Djur kan avbildas med olika skanningsparametrar (t.ex. högupplösta, longitudinella skanningar) om man är noga med att bestämma en lämplig acceptabel livstidsdos av strålning för råttor och se till att den kumulativa dosen inte överstiger denna nivå. Strålningsexponeringen kan minskas ytterligare genom att man skaffar fluoroskopibilder och videor utan att utföra skanningar (figur 2). - Utför TaOx-avbildning av råttduktalträdet med god upplösning och möjlighet till upprepade standardskanningar (2 min) med hjälp av följande skanningsparametrar: 90 kVp/88 μA; synfält (FOV), 72 mm; antal skivor, 512; skivans tjocklek, 72 μm; voxel upplösning, 72 μm3. Högupplösta skanningar under längre tidsperioder (4-14 min) kan också förvärvas hos djur som inte skannas i längdriktningen med samma parametrar.
- Efter datainsamling, ta försiktigt råttan bort från anestesikonen och placera i en ny ren bur på en värmepanna. Kontrollera råttan för att se till att den har återhämtat sig helt från anestesi innan du tar tillbaka den till sin permanenta bur. Placera den karprofenhaltiga sukralosekoppen och byt ut den på lämpligt sätt enligt beskrivningen i steg 2.5 för att säkerställa att djuren fortsätter att få antiinflammatorisk behandling under de kommande 7 dagarna.
- Bearbeta de skannade bilderna till snabba återgivningar i mikro-CT-programvaran för att bättre uppskatta eventuella kontrastläckor, endast delvis fyllning eller överfyllning (figur 2).
- Fortsätt till nästa avsnitt för att utföra formell bildbehandling för publicering eller detaljerad analys av skanningar om så önskas (figur 3).
5. Bildanalys
- Använd specialiserade programvarupaket för att producera renderingar av det fyllda duktala trädet.
OBS: Det är bäst att segmentera ut bröstfettkudden för att få bästa återgivning av det injicerade duktala trädet. Spline spårar fettkuddens mörka gränser genom djurets fullständiga tjocklek för att uppnå denna segmentering. - För att segmentera fettkudden (till skillnad från möss är gränserna för detta fack inte lika lätt att skilja från bukhålan, lårbensmusklerna och huden på grund av liknande Hounsfield-enheter) inom vilka det duktala trädet av intresse finns, att välja alternativet "spline trace" från den manuella menyn är det första steget i att skapa en rendering.
- Spline spårar fettkuddens kontur i var tredje skiva. Klicka på alternativet Sprid objekt från den halvautomatiska menyn. Detta kommer att sprida och ansluta alla segment till ett enda segmenterat objekt av intresse.
OBS: Att ändra tröskeln inom det segmenterade området möjliggör visualisering av signalen endast inom ett visst intervall av Hounsfield-enheter (HU); För andra kontrastmedel eller avbildningsparametrar kan detta intervall behöva justeras. Ett mjukvarupaket eller en analys av artificiell intelligens kan användas för att göra andra mätningar och bilder för att visa hur mycket det duktala trädet fylldes. - Ställ in HU-värden till en lågpunkt på 300 och en hög punkt på 3 000 på den halvautomatiska menyn under tröskelvolymfliken. Detta gör det möjligt att skapa en återgivning som endast visar kontrasten (TaOx) i det duktala trädet.
- Ställ in återgivningen som primär med knappen "visa". Detta ändrar skärmen så att den bara visar 3D-återgivningen av det duktala trädet.
OBS: Utför rekonstruktion av duktalträdet för vidare analys.
Representative Results
Var och en av de 12 bröstkörtlarna hos en kvinnlig råtta innehåller ett enda duktalt träd som öppnas vid bröstvårtöppningen. Trots skillnaderna i storlek mellan musen och råttan är utvecklingstidpunkten för bröstkörtlarna och den tid som dessa djur når vuxen ålder mycket lika30,31. En kort beskrivning av de viktigaste stadierna av bröstkörtelutveckling hos råttor som är representativa för båda gnagararterna tillhandahålls. Terminaländknoppar (TEB) är de mycket proliferativa strukturerna vid spetsarna på det långsträckta duktala trädet som leder duktal förgrening30,31. Toppet av proliferation och densitet hos TEBs uppträder vid 3-4 veckors ålder under den långsträckta fasen av det duktala trädet i pubertetsutveckling30. Vid 9-10 veckors ålder finns det få TEB kvar eftersom det duktala trädet har vuxit för att uppta hela längden på fettkudden30. Därefter är tillväxten och expansionen av det duktala trädet proportionellt mot fettkudden och djuret32. Terminala duktala lobulära enheter (TDLU) i det mänskliga bröstet utför en liknande roll som TEB hos gnagare. TDLU är den viktigaste källan för initiering av cancerframkallande och progression till BC33,34. Vi kan injicera upp till 300 μL 70% EtOH-lösning för att fylla hela duktalträdet i bröstkorgs- och bukbröstkörtlarna hos den 9 veckor gamla Sprague-Dawley-råttan (figur 1, figur 2, figur 3). Till skillnad från möss 20 är bröstvårtorna i livmoderhals- och ljumskkörtlarna hos Sprague-Dawley-råttorna vanligtvis lämpliga för injektion hos mer än 80% av djuren, och upp till 100 μl70% EtOH-lösning krävs för att fylla hela duktalträdet (Figur 2). Vi injicerar rutinmässigt upp till 10 bröstkörtlar med den ablativa lösningen som studeras. En typisk experimentell design består av två oberoende veckovisa ID-injektionssessioner, där fem alternerande körtlar infunderas med den ablativa lösningen innehållande röntgenkontrastmedel och/eller EC som gelningsmedel (figur 2). För TaOx-innehållande (50-200 mM) ablativ lösning utförs genomlysning och/eller mikro-CT-skanning efter slutet av varje session för att bestämma och registrera den individuella framgången med att införa varje duktalträd med partiell eller full mängd infunderad lösning (figur 2). Omedelbar och longitudinell avbildning efter injektion möjliggör bedömning av hur förändringar i formuleringen, särskilt koncentrationen av EC-geleringsmedel, påverkar och begränsar utåtdiffusionen av den ablativa lösningen som en funktion av den injicerade volymen (figur 3). Denna bildanalys ger information för att förstå de optimala parametrarna för att uppnå maximal ablation med minimal säkerhetsvävnadsskada.
Figur 1: Scheman över proceduren för intraduktal injektion och bildanalys hos råttor. Steg-för-steg-proceduren för intraduktal injektion och bildanalys markeras. Se video för mer information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på nippelkannulering och leveransresultat av den ablativa lösningen i flera bröstkörtlar . (A) Typisk presentation av bröstvårtformer i Sprague-Dawley-råttstammen. Bröstvårtlängden korrelerar med sannolikheten för framgångsrik cannulation. Längre bröstvårtor är lättare att kannulera än korta bröstvårtor, medan alltför korta eller vestigiala bröstvårtor inte kan kannuleras. När de har kannulerats kan både långa och korta bröstvårtor infunderas med lösningen och uppnå liknande framgångsgrader för leverans. Blått matfärgämne i den injicerade lösningen kan användas som in vivo-bevis på duktal trädfyllning och leveransframgång (mest uppenbart, kupolbildning, för en misslyckad fettkuddeinjektion). Realtidsfluoroskopi (B) och 3D-mikro-CT-återgivningar som genereras efter bildförvärv (C) ger in vivo-bevis på leveransframgång och mer kvantitativ bedömning av lösningen som når TEB. (B) Varje bukbröstkörtel i det första paret (#4, #10) fick ablativ lösning med 1% EC (orange kontur) eller utan den (grön kontur) (C) Framgångsrik leverans (blå kontur) av ablativ lösning i höger livmoderhals , andra par bröstkorg (#3, #9) och första par buk (#4, #10) bröstkörtlar och misslyckad injektion (streckad vit kontur) i vänster bröstkorg körtel. Skalstreck motsvarar 1 mm i bilderna med olika förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: 3D-rekonstruktion och bedömning av ablativ lösningsfyllning och diffusion . 70% EtOH/100 mM TaOx nanopartiklar med 1% EC (överst) eller utan EC (botten) injicerades intraduktivt i det andra bukbröstkörtelparet (#4 och #10) och avbildades omedelbart med mikro-CT. Varje Sprague-Dawley-råtta fick en ökande volym av endera lösningen. Enskilda duktala träd rekonstruerades med hjälp av ett programvarupaket för bildanalys (spline trace + propagate object + threshold rendition). Med 1% EC kan lösningen ses nå terminaländarna. När den levererade volymen ökas är antalet fyllda TEB tydligare. Skalstrecket motsvarar 10 mm i alla återgivningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Utfärda | Utseende | Lösning | |||
| Kort bröstvårta (fig. 2) | Bröstvårtan har låg profil – svår att ta tag i | Det är ibland lättare att hålla huden nära bröstvårtan och rikta in sig på mitten av bröstvårtan med nålen. Nålen kommer sannolikt att dyka under huden. Att dra upp långsamt kan avslöja att bröstvårtan är något över nålspetsen och ge utrymme att ta tag i och dra den resten av vägen på nålen. Var mycket försiktig när du dyker under huden om nålens vinkel. Det är lätt att oavsiktligt få en fettkuddeinjektion genom att sticka i fel vinkel. | |||
| Injektion av fettkudde (fig. 2) | Svullen runt bröstvårtan och eventuellt i själva bröstvårtan – enklast att se om färg tillsätts injektionslösningen | Om bröstvårtan svullnar med de första ul-injicerade, ta bort nålen och försök att sätta in igen med mer omsorg om vinkeln. Börja injektionen igen och se upp för ytterligare svullnad. Om svullnaden fortsätter, överge försöket. Det är mycket sällsynt att framgångsrikt injicera en bröstvårta som har börjat som en fettkuddeinjektion. | |||
| Sår/skabb | Öppna sår eller skabb nära injektionsstället för EtOH-lösning | Råttor är mer benägna än möss att utveckla sår eller skabb nära injektionsområdet. Om sår hittas, applicera trippel antibiotikasalva på öppna sår men lämna skabbiga sår ensamma. Att applicera salva på scabs kan öka sannolikheten för att djuret kommer att störa skabbet och ta bort det. Kontrollera var 1-2: e dag tills den är läkt beroende på svårighetsgraden av såret. Carprofen ska ges tills det är läkt även om det är bortom det normala fönstret. | |||
| Injicera alternerande körtlar | Ej tillämpligt | Större injektionsvolymer hos råttor gör det mer sannolikt att orsaka hudskador om man injicerar på varandra följande körtlar. För minsta sannolikhet för trauma till injektionsområdet, alternativa körtlar injiceras inom en enda session (dvs. injicera # 1, 3, 4 och 6 snarare än # 1-4). Avstånd mellan tredje (#3 och #9) och fjärde (#4 och #10) körtelpar möjliggör injektion av båda dessa körtlar i en session. | |||
Tabell 1: Användbara tips och felsökning
Discussion
Som visas här ablaterar ID-leverans av 70% EtOH företrädesvis bröstepitelcellerna med begränsad säkerhetsskada på omgivande stroma och vaskulatur hos möss4. Lokal ablation av det duktala trädet är effektivt för att förhindra tumörbildning i musmodeller4. Här visar vi att detta ablativa förfarande kan skalas upp till råttor.
Detta är nästa steg på vägen till översättning av detta ablativa förfarande som ett alternativt ingrepp till profylaktisk mastektomi för primärt förebyggande av bröstcancer hos högriskindivider. Tillsats av TaOx nanopartiklar som ett röntgenkontrastmedel till den ablativa lösningen gör det möjligt att bedöma lösningens effektivitet vid förebyggande av tumörbildning, eftersom det kan bestämmas om proceduren lyckades eller inte vid fullständig fyllning av duktalträdet. Att använda fluoroskopi för att visualisera den injicerade bröstkörteln speglar vad som sannolikt kommer att göras i kliniken för att vägleda denna ID-procedur. Bildvägledning av hur mycket lösningen har fyllt det duktala trädet och när infusionen ska stoppas kommer att vara en viktig aspekt av den kliniska implementeringen för att säkerställa maximal fyllning av varje duktalträd. Felsökningar och användbara tips visas i tabell 1. Effektiviteten av detta ablativa förfarande kräver att den infunderade lösningen tar direktkontakt med alla epitelceller för att maximera celldödningshastigheten. Reservepitelceller i ett eller flera träd kan så småningom fungera som en källa för BC-utveckling. De andra grupperna rapporterade ID-tillförsel av viruspartiklar (t.ex. komponenter i Cre/LoxP- och/eller Cas9/CRISPR-system), hormoner och hormonantagonister (t.ex. prolaktin, fulvestrant), kemoterapeutiska medel (t.ex. cisplatin), siRNA och/eller antikroppar eller andra målsökande medel hos möss 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, råttor 21,33,46,47,48 och/eller kaniner 18,49,50,51,52,53 . Framgångsrik kannulering av upp till åtta duktala träd per bröst per bröst för lokal leverans av kemoterapi har rapporterats i oberoende kliniska studier 47,54,55. Bildvägledning för infusion av dessa andra lösningar som syftar till tumörförebyggande eller inriktade på lokal behandling skulle på samma sätt maximera deras effektivitet.
Skalbarheten och förfining av denna procedur från mus till råtta duktalt träd demonstreras här. TaOx nanopartikel i murin 4,19 och råtta (opublicerade data) duktalt träd ger högupplöst avbildning som överträffar de FDA-godkända jodinnehållande röntgenkontrastmedlen. På samma sätt är vi inte medvetna om andra duktala trädavbildningsmetoder hos möss40,41 eller andra djurmodeller18 som kan ge jämförbar upplösning med TaOx. Relevant för klinisk översättning är det faktum att gelningseffekten av EC i denna mellanstora råttmodeller är en möjliggörande formuleringsförfining för att minimera vävnadsskador i säkerhet. När vi fortsätter att bedöma detta ablativa ID-förfarande för dess förmåga att förhindra BC, kommer vi att kunna bestämma, mer exakt, från vilka körtlar BC utvecklas genom den tillagda informationen som tillhandahålls genom avbildning efter ID-leverans i kemiskt inducerade och andra råttmodeller av BC. Dessa data kommer att avgöra säkerheten för denna procedur och fastställa eventuella problem eller brister i huruvida partiella eller misslyckade behandlade duktala träd kan vara mer benägna att utveckla BC hos en högriskkvinna.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute R21 CA226579 och R01 CA258314 bidrag till LFS och av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 bidrag till EMS. Vi är tacksamma mot MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core-anläggningen för användning av deras bildsystem och tekniska expertis. Vi tackar Dr. Danielle Ferguson för att ha granskat innehållet i videon och siffrorna för efterlevnad av riktlinjer för djurs välbefinnande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Wild, C. P. The global cancer burden: necessity is the mother of prevention. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 123-124 (2019).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal of Gastroenterology. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the breast treated with percutaneous ethanol injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutic Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Faguy, K. Ductography: When, how, and why. Radiologic Technology. 92 (5), 487-503 (2021).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (121), e55209 (2017).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Kenyon, E., et al. Intraductal delivery and x-ray visualization of ethanol-based ablative solution for prevention and local treatment of breast cancer in mouse models. Journal of Visualized Experiments. (182), e63457 (2022).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Lai, Y. E., Morhard, R., Ramanujam, N., Nolan, M. W. Minimally invasive ethyl cellulose ethanol ablation in domesticated cats with naturally occurring head and neck cancers: Six cats. Veterinary and Comparative Oncology. 19 (3), 492-500 (2021).
- Mueller, J. L., et al. Optimizing ethyl cellulose-ethanol delivery towards enabling ablation of cervical dysplasia. Scientific Reports. 11 (1), 16869 (2021).
- Nief, C., et al. Polymer-assisted intratumoral delivery of ethanol: Preclinical investigation of safety and efficacy in a murine breast cancer model. PLoS One. 16 (1), 0234535 (2021).
- Chelales, E., et al. Radiologic-pathologic analysis of increased ethanol localization and ablative extent achieved by ethyl cellulose. Scientific Reports. 11 (1), 20700 (2021).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Trans Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Russo, I. H., Russo, J. Developmental stage of the rat mammary gland as determinant of its susceptibility to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. Journal of the National Cancer Institute. 61 (6), 1439-1449 (1978).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Research Treatment. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Scientific Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast - A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 907-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translational Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. The Biochemical Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Preview Research (Phila). 6 (1), 51-58 (2013).
