Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Røntgenvisualisering av intraduktal etanolbasert ablativ behandling for forebygging av brystkreft i rottemodeller

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64042
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,4, 2,5, 2,6, 7, 2, 1,2
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, Michigan State University, 3Department of Pharmacology & Toxicology, Michigan State University, 4College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, 5TechInsights Inc., 6IQ Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University, 7Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

En prosedyre for levering av en kjemisk ablativ løsning til rottepattedyrets duktale tre for bildestyrt forebyggende behandling av brystkreft er beskrevet. Brystepitelceller kan målrettes med minimal skade på sikkerhetsvev gjennom kanylering direkte inn i brystvorteåpningen og intraduktal infusjon av en 70% etanolbasert ablativ løsning.

Abstract

Det er fortsatt et begrenset antall primære tiltak for forebygging av brystkreft. For kvinner med høy risiko for å utvikle brystkreft er den mest effektive intervensjonen profylaktisk mastektomi. Dette er en drastisk kirurgisk prosedyre der brystepitelceller som kan gi opphav til brystkreft, fjernes helt sammen med det omkringliggende vevet. Målet med denne protokollen er å demonstrere muligheten for en minimal invasiv intraduktal prosedyre som kan bli et nytt primært inngrep for forebygging av brystkreft. Denne lokale prosedyren vil fortrinnsvis ablate brystepitelceller før de kan bli ondartede. Intraduktale metoder for å levere løsninger direkte til disse epitelceller i gnagermodeller av brystkreft er utviklet ved Michigan State University og andre steder. Rotte brystkjertelen består av et enkelt kanaltre som har en enklere og mer lineær arkitektur sammenlignet med det menneskelige brystet. Imidlertid tilbyr kjemisk induserte rottemodeller av brystkreft verdifulle verktøy for proof-of-concept-studier av nye forebyggende inngrep og skalerbarhet fra musemodeller til mennesker. Her beskrives en prosedyre for intraduktal levering av en etanolbasert ablativ løsning som inneholder tantaloksyd nanopartikler som røntgenkontrastmiddel og etylcellulose som geleringsmiddel i rottepattedyrets duktale tre. Levering av vandige reagenser (f.eks. cytotoksiske forbindelser, siRNA, AdCre) ved intraduktal injeksjon er tidligere beskrevet i muse- og rottemodeller. Denne protokollbeskrivelsen legger vekt på metodologiske endringer og trinn som gjelder unikt for å levere en ablativ løsning, formuleringshensyn for å minimere lokale og systemiske bivirkninger av den ablative løsningen, og røntgenbilder for in vivo-vurdering av duktal trefylling. Fluoroskopi og mikro-CT-teknikker gjør det mulig å bestemme suksessen til levering av ablativ løsning og omfanget av duktal trefylling takket være kompatibilitet med det tantalholdige kontrastmiddelet.

Introduction

For kvinner i USA1 fortsetter brystkreft (BC) å være den mest diagnostiserte krefttypen og forårsaker flere dødsfall enn noen annen krefttype unntatt lungekreft. Prognoser for 2022 anslår at 51 400 kvinner vil bli diagnostisert med karsinom in situ og 287 850 kvinner vil bli diagnostisert med invasivt karsinom, og at 43 600 kvinner vil dø av BC1. Til tross for utbredelsen og dødeligheten forbundet med BC, er det få alternativer tilgjengelig for primærforebygging og translasjonell forskning på nye intervensjoner, da primærforebygging ikke prioriteres av føderale byråer2. Profylaktisk mastektomi er den mest effektive intervensjonen for primær forebygging. Imidlertid anbefales denne prosedyren bare for høyrisikopersoner fordi det er en stor operasjon med livsendrende konsekvenser3. Denne operasjonen innebærer fullstendig fjerning av brystepitelceller hvorfra karsinogenese utvikler seg, så vel som det normale omgivende vevet. Enkeltpersoner blir ofte frarådet å bruke denne prosedyren som deres første alternativ til primærintervensjon på grunn av den negative effekten av fysisk, psykologisk og sosialt stress. Av disse grunner velger selv noen høyrisikopersoner å ikke gjennomgå denne prosedyren og velger i stedet vaktsom venting eller lignende overvåkingsstrategier3. I tidligere publikasjon var levering av 70% etanol (EtOH) direkte inn i dukttreet av musemodeller effektiv til kjemisk ablating av brystepitelceller med begrenset skade på tilstøtende normalt vev og ved å forhindre brysttumordannelse4. EtOH brukes i flere kliniske applikasjoner som enten et ablativt middel for lokal behandling av noen kreftformer eller skleroserende middel for lokal behandling av arteriovenøs hevelse og misdannelser 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Den lave toksisitets- og sikkerhetsprofilen til EtOH er godt etablert, da i noen prosedyrer kan opptil 50 ml på 95% EtOH administreres per økt 5,10.

Fullstendig fjerning av brystepitelceller som BC utvikler seg fra, er den mest avgjørende komponenten i både profylaktisk mastektomi og lokal levering av en ablativ løsning. Derfor er bekreftelse på fullstendig duktal trefylling nødvendig for å garantere at den ablative løsningen har kommet i direkte kontakt med alle brystepitelceller. Å levere en løsning i dukttreet (e) og dets visualisering ved bildestyrt fluoroskopi eller duktografi er mulig gjennom kliniske prosedyrer som allerede eksisterer15,16,17. Dermed vil det være mulig å enkelt implementere og evaluere denne prosedyren i kliniske studier. Et sentralt skritt i å etablere effekten og translasjonell gjennomførbarhet av intraductal (ID) ablasjon som en ny intervensjon for primær forebygging vil være å demonstrere gjennomførbarheten av denne røntgenvisualiseringsmetoden i dyremodeller av økende størrelse og kompleksitet av deres duktale trearkitektur 4,18,19. En protokoll som skalerer opp denne ablative prosedyren fra mus20 til rottemodeller er beskrevet her. Mens mus og rotte ductal trær har en lignende lineær struktur og forgrening mønster, rotte ductal treet er proporsjonalt større og er omgitt av en mye tettere stroma. Vi har implementert en metode i laboratoriet for å injisere hver brystkjertel i en rotte over en serie ukentlige økter med en ablativ løsning som inneholder et kontrastmiddel. Øktavstand er nødvendig for å sikre at dyrene har minimale bivirkninger av EtOH (figur 1 og figur 2). Prosedyren innebærer injeksjon av den ablative løsningen direkte inn i brystvorteåpningen av en isofluranbedøvet rotte med en 33 G nål. Noen viktige forbedringer av prosedyren inkluderer bruk av utvidet antiinflammatorisk behandling, injeksjon av høyere volumer per duktalt tre enn foreslått21, og gasstette sprøyter for væske og gasser. Varigheten av behandlingen med 5 mg / kg karprofen (et NSAID) fra 48 timer før til 1 uke etter ID-injeksjoner er sammenlignbar med den antiinflammatoriske protokollen som brukes til skleroserende behandling av venøs misdannelse i klinikken. Behandlingen utføres på pasienter under systemisk anestesi etterfulgt av 2 dager med antiinflammatoriske medisiner som NSAIDs. Den betennelsesdempende behandlingen kan forlenges i noen dager til for å redusere lokal betennelse og eventuell smerte13. Som hos mus20, reduserer intraperitoneal injeksjon av en 5% sukroseoppløsning den kortsiktige effekten av alkoholforgiftning hos rotter. Rotter kan injiseres med opptil 1 ml 70 % EtOH (opptil 4 kanaler; 0,2 g/dl EtOH-innhold i blod) i en enkelt økt når de administreres med denne sukroseoppløsningen; dyr blir helt friske innen 4 timer etter ID-injeksjoner. Vi utfører sekvensielle økter for å gi nok restitusjonstid når vi injiserer mer enn 4 kjertler og/eller høyere EtOH-konsentrasjoner. Alkoholforgiftning hos kvinner vil være mye mindre sannsynlig som ID-injeksjon av alle duktale trær i begge brystene, forutsatt at 16 hovedkanaler16,17 og 2 ml per kanal22,23, med 70% EtOH vil resultere i mindre enn 0,1 g / dL EtOH-innhold i blod og kan forårsake mild svekkelse.

Røntgenbilder gjør det mulig å bestemme hvor vellykket intraduktal levering er i hver enkelt kjertel og om hele dukttreet er fylt (figur 1, figur 2, figur 3). Sanntids fluoroskopiavbildning som forberedelse til mikro-CT-skanning og / eller 3D-rekonstruksjon av DICOM-fildata kan brukes til å vurdere omfanget av løsningslevering i dukttreet og eventuell lekkasje i stroma. Bruk av fluoroskopi kan bidra til å begrense den totale stråledosen som pålegges dyret. Fluoroskopiteknikken nærmer seg nærmere den tiltenkte kliniske applikasjonen for bildeveiledning av denne ablative behandlingen. Sammenligning av FDA-godkjent jodholdig Isovue til tantaloksyd (TaOx) nanopartikler er utført for ytterligere å avgrense nytten av den ablative løsningen 4,19. Det har blitt funnet at TaOx er et overlegent mikro-CT-kontrastmiddel enn Isovue for visualisering av den første fyllingen av dukttreet hos mus 4,19. Her demonstrerer vi at TaOx er et egnet kontrastmiddel for å visualisere den første fyllingen av rottedukttreet (figur 2 og figur 3). Både i translasjonell forskning og klinisk praksis har geleringsmiddelet etylcellulose (EC) blitt tilsatt EtOH-løsningen for å minimere diffusjon fra de tiltenkte målrettede regionene 13,14,24,25,26,27,28,29. Studier har vist at tillegg av opptil 1,5 % EC til EtOH-holdige ablative oppløsninger er kompatibelt med TaOx-basert bildebehandling (figur 3). Disse samt ytterligere forbedringer til den ablative løsningen kan hjelpe til med klar oversettelse av denne bildestyrte prosedyren til klinikken.

Protocol

Alle forsøkene som er beskrevet ble utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Michigan State University.

1. Utvidet antiinflammatorisk behandling

  1. Tilbered sukralosegelkopper som oral dosering av karprofen. Gi rotter denne antiinflammatoriske behandlingen fra 2 dager før de mottar ID-injeksjon på 70% EtOH til 7 dager etter prosedyren.
  2. Fortynn en arbeidsløsning av karprofen i steril PBS til injeksjon i koppen. Fra 50 mg / ml stamløsning, lag en fortynnet 2 mg / ml oppløsning farget med 1% v / v sterilt blått matfargestoff og injiser 500 μL i hver kopp. Tilsetning av fargestoffet hjelpemidler i visualisering av fullstendig blanding av stoffet i sukralose av koppen.
  3. Følg produsentens anbefaling om å forberede koppen for tilsetning av karprofen. Med mindre annet er angitt av leverandøren, varm koppen i et vannbad ved 60 °C i 15 minutter og tørk av ved fjerning for å redusere risikoen for forurensning.
    1. Tørk av lokket på sukralosekoppen med 70 % EtOH i området og introduser nålen på sprøyten som inneholder karprofenoppløsningen. Dispenser riktig volum (500 μL).
    2. Dekk punkteringen med et klistremerke. Rist koppen energisk i 15 s, og legg deretter koppen i en virvel i ytterligere 15 s. Vurder visuelt homogen og fullstendig blanding før lagring for senere bruk. Se etter tilstedeværelsen av en mørk blå farge.
      MERK: La koppene få romtemperatur. Oppbevar koppene ved romtemperatur om ønskelig, men vær oppmerksom på produsentens effektveiledning. Alternativt kan du oppbevare koppene ved 4 °C og bruke dem innen en måned. Datering av klistremerket er en god praksis for å holde oversikt over injeksjonsdatoen uten risiko for at en penn eller skarp markør punkterer lokket.
  4. Tørk av utsiden av koppen med 70% EtOH rett før bruk. Fjern lokket før du legger koppen inn i dyreburet. Bytt kopper annenhver dag eller når de er tomme. Kontroller nivået av gel daglig for å sikre tilstrekkelig dosering. En kopp kan levere karprofen for opptil to rotter i opptil 2 dager; Rotter kan imidlertid konsumere hele koppen før.

2. Preoperativ forberedelse

MERK: Forsikre deg om at forberedelsestrinnet for dyr går foran ID-injeksjonsprosedyren med 2-3 dager.

  1. Slå på isofluranfordamperen (2%-3% isofluran, 1,5 l/min oksygen) for å bedøve rotten. Flytt dyret til en nesekjegle på en varmepute. Påfør øye smøremiddel til rotten, og plasser deretter dyret på ryggen. Overvåk dyrets respirasjon nøye for å sikre at bedøvelsesplanet opprettholdes ved 1% -3% isofluran.
    MERK: En elektrisk barberhøvel kan brukes til å fjerne overflødig pels før hårfjerning. Ekstrem forsiktighet må utvises for ikke å skade noen brystvorter med barberhøvelen. Av denne grunn kan dette trinnet hoppes over. Rotter er mer følsomme for hårfjerningskrem enn mus, så fjerning av overflødig krem er svært viktig. Unngå å injisere en etanolholdig løsning i et område som allerede har en slitasje tilstede fra depilering. Noen kremer har tilsatt forbindelser som aloe og lanolin som kan bidra til å minimere sannsynligheten for slitasje.
  2. Bruk en bomullsapplikator for å spre den reseptfrie hårfjerningskremen på brystvorteområdet. Bruk applikatoren til å gni kremen inn i området i 10-30 s. Sjekk om pelsen raskt har løsnet.
    1. La kremen ligge på rotta i kortest mulig intervall og fjern helt for å unngå å brenne huden. Rotter er enda mer følsomme for denne prosedyren enn mus.
  3. Etter 10-30 s påføring, våt gasbind med varmt vann og bruk det til å skylle krem og løsnet pels fra dyret. Utfør minst tre skyll av området med fersk fuktet gasbind og tørk med tørt gasbind etter den endelige skyllingen. Bekreft god synlighet og tilgang til området av brystvorten der pelsen er fjernet. Gjenta hårfjerningsprosedyren om nødvendig.
  4. Plasser rotten i et rent bur på en varmepute og la den komme seg. Kontroller rotta for å forsikre deg om at den er helt restituert fra anestesi før du bringer den tilbake til sitt permanente bur.
  5. Plasser en karprofendosert (1 mg / kopp) sukralosegelkopp i buret for antiinflammatorisk behandling. Kontroller gelforbruket daglig og erstatt med en ny kopp etter behov. Ikke la koppen stå i mer enn 2 dager. Vanligvis må kopper byttes ut etter 1 dag.

3. Intraduktal injeksjon

  1. Klargjør TaOx stamløsning ved 333,3 mM som beskrevet19 ved bruk av steril fosfatbufret saltvann (PBS). Varm oppløsningen hvis pulveret ikke oppløses helt. Rør forsiktig. Ikke virvle eller rist kraftig for å unngå bobledannelse.
  2. Bland tre deler 333,3 mM TaO x med syv deler 100 % EtOH for en endelig 70 % EtOH 100 mM/TaOx-løsning. Eventuelt tilsett en passende mengde 0,5% -1,5% etylcellulose (EC) som et geleringsmiddel for å maksimere lokal oppbevaring av den ablative løsningen. Tilsett 1 % v/v blått konditorfargestoff til den ablative oppløsningen for visuell undersøkelse av tilførselen til dukttreet under infusjonen.
  3. Forbered et volum som passer for eksperimentelle behov. Kjertelpar 1 (cervical) og 6 (inguinal) kan fylles med opptil 100 μL av løsningen, mens alle andre par kan fylles med opptil 300 μL.
  4. Bedøv rotta som i trinn 2.1 og flytt rotta til nesekjeglen når den er fullstendig bedøvet. Påfør øye smøremiddel til begge øynene og legg deretter dyret på ryggen. Fest rotta under stereoskopet ved hjelp av tape nær brystvortene som skal injiseres, om ønskelig. Vekten av rotten er generelt nok til å holde den fra å bevege seg vesentlig uten taping.
  5. For å klargjøre brystvortene for injeksjon, fjern eventuell død hud som dekker brystvorteåpningen med fine spisse tang, hvis mulig. Rotter har ofte en plugg som stikker ut fra brystvorteåpningen som kan forhindre vellykket kanylering av brystvorten hvis den ikke fjernes.
    MERK: Det er viktig å merke seg at større injeksjonsvolumer av ablative oppløsninger som brukes til rotter, kan ha større sannsynlighet for å føre til overfladiske hudsår nær injeksjonsstedet/-ene. Av denne grunn er injeksjon av annenhver brystvorte i en enkelt økt mindre skadelig og irriterende for dyret enn å injisere tilstøtende brystvorter. Overvåking av rottene for eventuelle skrubbsår i 7 dager etter injeksjon bidrar til å sikre ingen alvorlige helseeffekter fra dyret som riper og introduserer muligheten for infeksjon fra forurensning med burgulvrester. Trippel antibiotisk salve eller vask med klorhexidinoppløsning kan brukes til å behandle eventuelle tegn på skadeinfeksjon som kan oppstå (tabell 1).
  6. Bruk en 500 μL sprøyte med en 33 G nål for å aspirere 101-301 μL ablativ oppløsning. Aspirer ytterligere 1 μL av oppløsningen for mulig mindre lekkasje når kanylen fjernes.
    MERK: Dette er anbefalinger for volumer som tar sikte på å fylle duktalt tre (er): opptil 100 μL i livmorhals- og inngangskjertler, og opptil 300 μL i de andre kjertlene. For andre applikasjoner kan det være hensiktsmessig å bruke mindre eller større volumer.
  7. Bruk en pinsett til å holde brystvorten forsiktig og kanylere nålen inn i brystvorteåpningen. Fortsett forsiktig å sette inn nålen til skråkanten er helt inne i brystvorten. For å få plass til nålen i brystvorten, før brystvorten opp mot nålen i stedet for å skyve nålen ned i brystvorten. (Tabell 1). Pass på å følge stien til brystvorteåpningen.
    MERK: Rottebrystvorter er generelt mye lettere å manipulere og kanylere vellykket enn de hos mus på grunn av større størrelse. Imidlertid gjør den økte mengden fett som omgir brystvorteåpningen det også mer sannsynlig å feilaktig injisere fettputen hvis nålen avviker fra hovedkanalen.
  8. Når kanylekanten er helt satt inn, skal oppløsningen langsomt tilsettes med en konstant hastighet på ca. 100 μL/min hos rotter. Brå endringer i infusjonshastigheten kan sprekke eller skade duktaltreet. Vent i 30 s etter slutten av infusjonen før du fjerner nålen fra det kanylerte treet med hjelp ved hjelp av tang; Dette sikrer at det injiserte volumet forblir innenfor dukttreet (figur 2) og reduserer sannsynligheten for lekkasje.
  9. Rengjør eventuell sølt oppløsning med fuktet gasbind eller en EtOH-våtserviett for å unngå overflødig kontrastoppløsning i bildene.
  10. Injiser PBS inneholdende 5 % sukrose (10 ml/kg) intraperitonealt for å redusere effekten av alkoholforgiftning dersom etanol finnes i ID-injeksjonsløsningene. Denne dosen kan gis i begynnelsen og slutten av prosedyren.

4. Mikro-CT-avbildning

  1. Etter at alle ønskede kjertler er injisert, flytt dyret raskt til mikro-CT-systemet og fortsett å opprettholde anestesi ved hjelp av den innlemmede isofluranfordamperen.
  2. Rett ryggraden til dyret og tape hvert bakben i en utvidet stilling, slik at benbenene til dyret vil være lenger unna de nedre kjertlene av interesse og ikke overlappe med interesseområdet i det skannede bildet.
  3. Tape over magen for å minimere pusteartefakter hvis du skanner underkjertlene.
    MERK: Dyr kan avbildes med forskjellige skanneparametere (f.eks. høy oppløsning, langsgående skanninger) hvis det utvises forsiktighet for å bestemme en passende akseptabel levetidsdose av stråling for rotter og sikre at den kumulative dosen ikke overskrider dette nivået. Strålingseksponeringen kan reduseres ytterligere ved å ta stillbilder og videoer med fluoroskopi uten å utføre skanninger (figur 2).
  4. Utfør TaO x-avbildning av rottedukttreet med god oppløsning og mulighet for gjentatte standard (2 min) innsamlingsskanninger ved hjelp av følgende skanneparametere: 90 kVp / 88 μA; synsfelt (FOV), 72 mm; antall skiver, 512; skive tykkelse, 72 μm; Voxel-oppløsning, 72 μm3. Høyoppløselige skanninger i lengre tidsperioder (4-14 min) kan også kjøpes hos dyr som ikke vil bli skannet i lengderetningen ved hjelp av de samme parametrene.
  5. Etter datainnsamling, ta rotta forsiktig bort fra anestesikjeglen og legg i et nytt rent bur på en varmepute. Sjekk rotten for å sikre at den har kommet seg helt fra anestesi før du bringer den tilbake til sitt permanente bur. Plasser karprofenholdig sukralosekopp og erstatt på riktig måte som beskrevet i trinn 2.5 for å sikre at dyrene fortsetter å få betennelsesdempende behandling de neste 7 dagene.
  6. Behandle de skannede bildene til raske gjengivelser i mikro-CT-programvaren for bedre å sette pris på eventuelle kontrastlekkasjer, bare delvis fylling eller overfylling (figur 2).
  7. Gå videre til neste avsnitt for å utføre formell bildebehandling for publisering eller detaljert analyse av skanninger om ønskelig (figur 3).

5. Bildeanalyse

  1. Bruk spesialiserte programvarepakker til å produsere gjengivelser av det fylte kanaltreet.
    MERK: Det er best å segmentere brystfettputen for å få best mulig gjengivelse av det injiserte duktale treet. Spline sporer de mørke grensene til fettputen gjennom hele tykkelsen på dyret for å oppnå denne segmenteringen.
  2. For å segmentere fettputen (i motsetning til mus, er grensene til dette rommet ikke like lett å skille fra bukhulen, lårmusklene og huden på grunn av lignende Hounsfield-enheter) der det duktale treet av interesse er inneholdt, er valg av "spline trace" -alternativet fra den manuelle menyen det første trinnet i å lage en gjengivelse.
  3. Spline sporer fettputeomrisset i hvert tredje stykke. Klikk på alternativet Forplant objekter fra den halvautomatiske menyen. Dette vil forplante og koble alle skivene til et enkelt segmentert objekt av interesse.
    MERK: Endring av terskelen i det segmenterte området tillater visualisering av signalet bare innenfor et visst område av Hounsfield-enheter (HU); For andre kontrastmidler eller bildeparametere kan det hende at dette området må justeres. En programvarepakke eller kunstig intelligensanalyse kan brukes til å gjøre andre målinger og bilder for å vise hvor mye dukttreet ble fylt.
  4. Sett HU-verdier til et lavpunkt på 300 og et høypunkt på 3 000 på den halvautomatiske menyen under terskelvolumfanen. Dette gjør det mulig å opprette en gjengivelse som bare viser kontrasten (TaOx) i duktaltreet.
  5. Angi gjengivelsen som primær ved hjelp av "vis" -knappen. Dette endrer visningen slik at den bare viser 3D-gjengivelsen av duktaltreet.
    MERK: Utfør rekonstruksjon av dukttreet for videre analyse.

Representative Results

Hver av de 12 brystkjertlene til en kvinnelig rotte inneholder et enkelt kanaltre som åpnes ved brystvorteåpningen. Til tross for forskjellene i størrelse mellom musen og rotten, er utviklingstidspunktet for brystkjertlene og tiden disse dyrene når voksen alder svært lik30,31. En kort beskrivelse av de viktigste stadiene av brystkjertelutvikling hos rotter som representant for begge gnagerarter er gitt. Terminal end knopper (TEBs) er de svært proliferative strukturer på spissene av det langstrakte duktale treet som styrer duktaleforgrening 30,31. Toppet av spredning og tetthet av TEBs forekommer ved 3-4 ukers alder i den langstrakte fasen av dukttreet i pubertetsutvikling30. Ved 9-10 ukers alder er det få TEBer igjen da dukttreet har vokst til å oppta hele lengden på fettputen30. Etter det er vekst og utvidelse av dukttreet proporsjonalt med fettputen og dyret32. Terminale duktale lobulære enheter (TDLU) i det menneskelige brystet utfører en lignende rolle som TEBene hos gnagere. TDLU er hovedkilden for initiering av karsinogenese og progresjon til BC33,34. Vi kan injisere opptil 300 μL 70% EtOH-løsning for å fylle hele dukttreet i bryst- og bukbrystkjertlene hos den 9 uker gamle Sprague-Dawley-rotten (figur 1, figur 2, figur 3). I motsetning til mus 20 er brystvortene i livmorhals- og inngangskjertlene til Sprague-Dawley-rottene vanligvis egnet for injeksjon hos mer enn 80% av dyrene, og opptil 100 μL70% EtOH-løsning er nødvendig for å fylle hele dukttreet (figur 2). Vi injiserer rutinemessig opptil 10 brystkjertler med den ablative løsningen som studeres. Et typisk eksperimentelt design består av to uavhengige ukentlige ID-injeksjonsøkter, der fem vekselkjertler infunderes med den ablative løsningen som inneholder røntgenkontrastmiddel og/eller EC som geleringsmiddel (figur 2). For TaOx-holdig (50-200 mM) ablativ oppløsning utføres fluoroskopi og/eller mikro-CT-skanning etter slutten av hver økt for å bestemme og registrere den individuelle suksessen med infusjon av hvert duktalt tre med delvis eller full mengde infundert oppløsning (figur 2). Umiddelbar og longitudinell avbildning etter injeksjon gjør det mulig å vurdere hvordan endringer i formulering, spesielt konsentrasjonen av EC-geleringsmiddel, påvirker og begrenser utadgående diffusjon av den ablative oppløsningen som en funksjon av det injiserte volumet (figur 3). Denne bildeanalysen gir informasjon for å forstå de optimale parametrene for å oppnå maksimal ablasjon med minimal sikkerhetsvevskader.

Figure 1
Figur 1: Skjema for prosedyre for intraduktal injeksjon og bildeanalyse hos rotter. Den trinnvise prosedyren for intraduktal injeksjon og bildeanalyse fremheves. Se video for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Eksempler på brystvortekanylering og leveringsresultat av den ablative løsningen i flere brystkjertler . (A) Typisk presentasjon av brystvortefigurer i Sprague-Dawley rottestammen. Brystvortelengden korrelerer med sannsynligheten for vellykket kanylering. Lengre brystvorter er lettere å kanylere enn korte brystvorter, mens for korte eller vestigiale brystvorter ikke kan kanyleres. Når de er kanylert, kan både lange og korte brystvorter infunderes med løsningen og oppnå lignende suksessrater for levering. Blå konditorfarge i den injiserte løsningen kan brukes som in vivo bevis på duktal trefylling og leveringssuksess (mest tydelig, kuppeldannelse, for en mislykket fettputeinjeksjon). Sanntids fluoroskopi (B) og 3D mikro-CT-gjengivelser generert etter bildeinnsamling (C) gir in vivo bevis på leveringssuksess og mer kvantitativ vurdering av løsningen som når TEB-ene. (B) Hver abdominal brystkjertel i det første paret (# 4, # 10) fikk ablativ løsning med 1% EC (oransje omriss) eller uten det (grønt omriss) (C) Vellykket levering (blå omriss) av den ablative løsningen i høyre livmorhals (# 7), andre par thorax (# 3, # 9) og første par abdominal (# 4, # 10) brystkjertler, og mislykket injeksjon (stiplet hvitt omriss) i venstre thorax (# 1). Skalastenger tilsvarer 1 mm i bildene ved forskjellig forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: 3D-rekonstruksjon og vurdering av ablativ løsningsfylling og diffusjon . 70 % EtOH/100 mM TaOx nanopartikler med 1 % EC (øverst) eller uten EC (nederst) ble intraduktalt injisert i det andre abdominale brystkjertelparet (#4 og #10) og umiddelbart avbildet med mikro-CT. Hver Sprague-Dawley-rotte fikk et økende volum av begge løsningene. Individuelle duktale trær ble rekonstruert ved hjelp av en programvarepakke for bildeanalyse (spline trace + propagate object + threshold rendition). Med 1 % EC kan man se løsningen nå terminalendene. Etter hvert som det leverte volumet økes, er antall TEB-er fylt tydeligere. Skalalinjen tilsvarer 10 mm i alle gjengivelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Utstede Utseende Løsning
Kort brystvorte (fig 2) Brystvorten har lav profil – vanskelig å gripe Det er noen ganger lettere å holde huden nær brystvorten og målrette midten av brystvorten med nålen. Nålen vil sannsynligvis dykke under huden. Hvis du trekker sakte opp, kan det avsløre at brystvorten er litt over nålespissen og gi rom til å gripe og trekke den resten av veien på nålen. Vær veldig forsiktig når du dykker under huden om nålens vinkel. Det er lett å utilsiktet få en fettputeinjeksjon ved å stikke i feil vinkel.
Injeksjon av fettpute (fig 2) Hovent rundt brystvorten og muligens i selve brystvorten – lettest å se om farge tilsettes injeksjonsvæske, oppløsning Hvis brystvorten er hevelse med de første par ul injisert, fjern nålen, og prøv å sette inn igjen med mer forsiktighet tatt av vinkel. Begynn injeksjonen igjen og se etter ytterligere hevelse. Hvis hevelse fortsetter, forlat forsøket. Det er svært sjelden å lykkes injisere en brystvorte som har startet som en fett pute injeksjon.
Sår/ Åpent sår eller nær injeksjonsstedet for EtOH-oppløsning Rotter er mer sannsynlige enn mus for å utvikle sår eller scabbing nær injeksjonsområdet. Hvis sår er funnet, bruk trippel antibiotisk salve for å åpne sår, men la scabbed sår alene. Bruk av salve på scabs kan øke sannsynligheten for at dyr vil plage skorpen og fjerne den. Sjekk hver 1-2 dag til helbredet, avhengig av alvorlighetsgraden av såret. Karprofen skal gis inntil det er tilhelet, selv om det er utenfor normalt vindu.
Injiser vekslende kjertler N/A Større injeksjonsvolumer hos rotter gjør det mer sannsynlig å forårsake hudslitasje hvis du injiserer påfølgende kjertler. For minst sannsynlighet for traumer til injeksjonsområdet, injiserte alternative kjertler i løpet av en enkelt økt (dvs. injiser # 1, 3, 4 og 6 i stedet for # 1-4). Avstand mellom tredje (# 3 og # 9) og fjerde (# 4 og # 10) kjertelpar tillater injeksjon av begge disse kjertlene i en økt.

Tabell 1 Nyttige tips og feilsøking

Discussion

Som vist her, ablaterer ID-levering av 70% EtOH fortrinnsvis brystepitelceller med begrenset sikkerhetsskade på den omkringliggende stroma og vaskulatur hos mus4. Lokal ablasjon av dukttreet er effektivt for å forhindre tumordannelse i musemodeller4. Her demonstrerer vi at denne ablative prosedyren kan skaleres opp til rotter.

Dette er neste skritt i veien til oversettelse av denne ablative prosedyren som en alternativ intervensjon til profylaktisk mastektomi for primær forebygging av brystkreft hos høyrisikoindivider. Tilsetning av TaOx nanopartikler som røntgenkontrastmiddel til den ablative løsningen gjør det mulig å vurdere effektiviteten av løsningen ved å forhindre tumordannelse, da det kan bestemmes om prosedyren var vellykket eller ikke ved fullstendig fylling av duktaltreet. Ved hjelp av fluoroskopi for å visualisere injisert brystkjertel speiler hva som sannsynligvis vil bli gjort i klinikken for å veilede denne ID-prosedyren. Bildeveiledning av hvor mye oppløsningen har fylt dukttreet og når infusjonen skal stoppes, vil være et viktig aspekt ved den kliniske implementeringen for å sikre maksimal fylling av hvert duktalt tre. Feilsøking og nyttige tips er listet opp i tabell 1. Effektiviteten av denne ablative prosedyren krever at den infunderte løsningen tar direkte kontakt med alle epitelceller for å maksimere frekvensen av celledreping. Reserveepitelceller i ett eller flere trær kan til slutt tjene som en kilde til BC-utvikling. De andre gruppene rapporterte ID-levering av viruspartikler (f.eks. komponenter i Cre/LoxP og/eller Cas9/CRISPR-systemer), hormoner og hormonantagonister (f.eks. prolaktin, fulvestrant), kjemoterapeutiske midler (f.eks. cisplatin), siRNA og/eller antistoffer eller andre målrettede midler hos mus 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, rotter 21,33,46,47,48 og/eller kaniner 18,49,50,51,52,53 . Vellykket kanylering av opptil åtte duktale trær per bryst for lokal levering av kjemoterapi er rapportert i uavhengige kliniske studier 47,54,55. Bildeveiledning for infusjon av disse andre løsningene rettet mot tumorforebygging eller rettet mot lokal behandling vil på samme måte maksimere effektiviteten.

Skalerbarheten og forbedringen av denne prosedyren fra mus til rotte ductal tree er demonstrert her. TaOx nanopartikkel i murine 4,19 og rotte (upubliserte data) ductal tree gir høyoppløselig bildebehandling som overgår FDA-godkjente jodholdige røntgenkontrastmidler. På samme måte er vi ikke klar over andre duktale treavbildningsmetoder hos mus40,41 eller andre dyremodeller18 som kan gi sammenlignbar oppløsning til TaOx. Relevant for klinisk oversettelse er det faktum at geleringseffekten av EC i denne mellomstore rottemodellen er en muliggjørende formuleringsforbedring for å minimere skade på sikkerhetsvev. Når vi fortsetter å vurdere denne ablative ID-prosedyren for dens evne til å forhindre BC, vil vi kunne bestemme, mer presist, fra hvilke kjertler BC utvikler seg gjennom den ekstra informasjonen som tilbys ved avbildning etter ID-levering i kjemisk induserte og andre rottemodeller av BC. Disse dataene vil bestemme sikkerheten til denne prosedyren og fastslå eventuelle bekymringer eller mangler ved om delvise eller mislykkede behandlede duktale trær kan være mer tilbøyelige til å utvikle BC hos en høyrisikokvinne.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute R21 CA226579 og R01 CA258314 tilskudd til LFS og av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 stipend til EMS. Vi er takknemlige for MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core anlegget for bruk av deres bildebehandlingssystemer og teknisk kompetanse. Vi takker Dr. Danielle Ferguson for gjennomgang av innholdet i videoen og tallene for overholdelse av dyrevelferdsretningslinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnalyzeDirect  v12.0 Caliper n/a For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL Allivet 50647 For anti-inflammatory treatment
Ethyl cellulose Acros Organics 9004-57-3 For intraductal injection
Evans blue Sigma E2129-50G For injection visualization
Hot water bath Toolots Yidu_HH-S2 For preparing carprofen cups
MediGel Sucralose Cups ClearH2O 74-02-5022 For delivery of carprofen
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL Hamilton 81220 For intraductal injection
Photoshop 2021 Adobe n/a For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System Perkin Elmer  CLS149276 For micro-CT image acquisition
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) Hamilton 7747-01 For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series AmScope SM-4TPZ-144 For intraductal injection
Sterile blue food dye McCormick 930641 For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher 14190250 For solution preparation
Stickers DOT Scientific DOTSCI-C50 For preparing carprofen cups
Sucrose Calbiochem 8550-5KG For intraductal injection
Syringes Fisher 14-826-79 For preparing carprofen cups
Vortex VWR 10153-834 For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s) Braintree Scientific HTP-1500 120V; AP-R 26E For intraductal injection/preoperative preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Wild, C. P. The global cancer burden: necessity is the mother of prevention. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 123-124 (2019).
  3. Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
  4. Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
  5. Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
  6. Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1003-1008 (2012).
  7. Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal of Gastroenterology. 19 (22), 3397-3403 (2013).
  8. Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
  9. Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the breast treated with percutaneous ethanol injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
  10. Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutic Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
  11. Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
  12. Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
  13. Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
  14. Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
  15. Faguy, K. Ductography: When, how, and why. Radiologic Technology. 92 (5), 487-503 (2021).
  16. Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
  17. Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
  18. Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (121), e55209 (2017).
  19. Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
  20. Kenyon, E., et al. Intraductal delivery and x-ray visualization of ethanol-based ablative solution for prevention and local treatment of breast cancer in mouse models. Journal of Visualized Experiments. (182), e63457 (2022).
  21. Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
  22. King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
  23. Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
  24. Lai, Y. E., Morhard, R., Ramanujam, N., Nolan, M. W. Minimally invasive ethyl cellulose ethanol ablation in domesticated cats with naturally occurring head and neck cancers: Six cats. Veterinary and Comparative Oncology. 19 (3), 492-500 (2021).
  25. Mueller, J. L., et al. Optimizing ethyl cellulose-ethanol delivery towards enabling ablation of cervical dysplasia. Scientific Reports. 11 (1), 16869 (2021).
  26. Nief, C., et al. Polymer-assisted intratumoral delivery of ethanol: Preclinical investigation of safety and efficacy in a murine breast cancer model. PLoS One. 16 (1), 0234535 (2021).
  27. Chelales, E., et al. Radiologic-pathologic analysis of increased ethanol localization and ablative extent achieved by ethyl cellulose. Scientific Reports. 11 (1), 20700 (2021).
  28. Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Trans Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
  29. Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
  30. Russo, I. H., Russo, J. Developmental stage of the rat mammary gland as determinant of its susceptibility to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. Journal of the National Cancer Institute. 61 (6), 1439-1449 (1978).
  31. Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
  32. Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
  33. Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Research Treatment. 73 (1), 75-83 (2002).
  34. Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
  35. Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Scientific Translational Medicine. 6 (217), (2014).
  36. de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
  37. Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast - A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 907-913 (2019).
  38. Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
  39. Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
  40. Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
  41. Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
  42. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
  43. Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments. (85), e51171 (2014).
  44. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (148), e59502 (2019).
  45. Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments. (67), e4030 (2012).
  46. Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
  47. Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translational Medicine. 3 (106), (2011).
  48. Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
  49. Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
  50. Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
  51. Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. The Biochemical Journal. 115 (5), 58 (1969).
  52. Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
  53. Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
  54. Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
  55. Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Preview Research (Phila). 6 (1), 51-58 (2013).

Tags

Kreftforskning utgave 190 duktaltre intraductal brystkjertel ductografi kjemisk ablasjon bildeveiledet prosedyre
Røntgenvisualisering av intraduktal etanolbasert ablativ behandling for forebygging av brystkreft i rottemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kenyon, E., Zaluzec, E., Powell, K., … More

Kenyon, E., Zaluzec, E., Powell, K., Volk, M., Chakravarty, S., Hix, J., Kiupel, M., Shapiro, E. M., Sempere, L. F. X-Ray Visualization of Intraductal Ethanol-Based Ablative Treatment for Prevention of Breast Cancer in Rat Models. J. Vis. Exp. (190), e64042, doi:10.3791/64042 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter