Summary
Een procedure voor de levering van een chemische ablatieve oplossing aan de borstkanaalboom van de rat voor beeldgeleide preventieve behandeling van borstkanker wordt beschreven. Borstepitheelcellen kunnen worden gericht met minimale collaterale weefselschade door cannulatie rechtstreeks in de tepelopening en intraductale infusie van een 70% op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing.
Abstract
Er zijn nog een beperkt aantal primaire interventies voor de preventie van borstkanker. Voor vrouwen met een hoog risico op het ontwikkelen van borstkanker is de meest effectieve interventie profylactische mastectomie. Dit is een drastische chirurgische ingreep waarbij de borstepitheelcellen die borstkanker kunnen veroorzaken, samen met het omliggende weefsel volledig worden verwijderd. Het doel van dit protocol is om de haalbaarheid aan te tonen van een minimaal invasieve intraductale procedure die een nieuwe primaire interventie voor borstkankerpreventie zou kunnen worden. Deze lokale procedure zou bij voorkeur borstepitheelcellen aborteren voordat ze kwaadaardig kunnen worden. Intraductale methoden om oplossingen rechtstreeks aan deze epitheelcellen te leveren in knaagdiermodellen van borstkanker zijn ontwikkeld aan de Michigan State University en elders. De borstklier van de rat bestaat uit een enkele ductale boom die een eenvoudigere en meer lineaire architectuur heeft in vergelijking met de menselijke borst. Chemisch geïnduceerde rattenmodellen van borstkanker bieden echter waardevolle hulpmiddelen voor proof-of-conceptstudies van nieuwe preventieve interventies en schaalbaarheid van muismodellen tot mensen. Hier wordt een procedure beschreven voor intraductale toediening van een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing met tantaaloxide nanodeeltjes als röntgencontrastmiddel en ethylcellulose als geleermiddel in de ductale boom van de borstmruik van de rat. Toediening van waterige reagentia (bijv. cytotoxische verbindingen, siRNA's, AdCre) door intraductale injectie is eerder beschreven in muis- en rattenmodellen. Deze protocolbeschrijving legt de nadruk op methodologische veranderingen en stappen die uniek betrekking hebben op het leveren van een ablatieve oplossing, formuleringsoverwegingen om lokale en systemische bijwerkingen van de ablatieve oplossing te minimaliseren en röntgenbeeldvorming voor in vivo beoordeling van ductale boomvulling. Fluoroscopie en micro-CT-technieken maken het mogelijk om het succes van ablatieve oplossingsafgifte en de mate van ductale boomvulling te bepalen dankzij compatibiliteit met het tantaalbevattende contrastmiddel.
Introduction
Voor vrouwen in de VS1 blijft borstkanker (BC) het meest gediagnosticeerde kankertype en veroorzaakt het meer sterfgevallen dan enig ander kankertype behalve longkanker. Projecties voor 2022 schatten dat 51.400 vrouwen in situ zullen worden gediagnosticeerd met carcinoom en 287.850 vrouwen zullen worden gediagnosticeerd met invasief carcinoom, en dat 43.600 vrouwen zullen sterven aan BC1. Ondanks de prevalentie en mortaliteit geassocieerd met BC, zijn er weinig opties beschikbaar voor primaire preventie en translationeel onderzoek naar nieuwe interventies, omdat primaire preventie geen prioriteit krijgt van federale agentschappen2. Profylactische mastectomie is de meest effectieve interventie voor primaire preventie. Deze procedure wordt echter alleen aanbevolen voor personen met een hoog risico, omdat het een grote operatie is met levensveranderende gevolgen3. Deze operatie omvat volledige verwijdering van de borstepitheelcellen waaruit carcinogenese zich ontwikkelt, evenals het normale omliggende weefsel. Individuen worden vaak ontmoedigd om deze procedure te gebruiken als hun eerste optie van primaire interventie vanwege de negatieve impact van fysieke, psychologische en sociale stress. Om deze redenen kiezen zelfs sommige personen met een hoog risico ervoor om deze procedure niet te ondergaan en in plaats daarvan te kiezen voor waakzaam wachten of soortgelijke bewakingsstrategieën3. In eerdere publicatie was de toediening van 70% ethanol (EtOH) rechtstreeks in de ductale boom van muismodellen effectief bij het chemisch aborteren van borstepitheelcellen met beperkte schade aan aangrenzend normaal weefsel en bij het voorkomen van borsttumorvorming4. EtOH wordt gebruikt in meerdere klinische toepassingen als ablatief middel voor lokale behandeling van sommige kankers of scleroserend middel voor lokale behandeling van arterioveneuze zwelling en misvormingen 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Het lage toxiciteits- en veiligheidsprofiel van EtOH is goed ingeburgerd, omdat in sommige procedures tot 50 ml van 95% EtOH per sessie 5,10 kan worden toegediend.
Volledige verwijdering van borstepitheelcellen waaruit BC zich ontwikkelt, is het meest cruciale onderdeel van zowel profylactische mastectomie als lokale toediening van een ablatieve oplossing. Daarom is bevestiging van volledige ductale boomvulling noodzakelijk om te garanderen dat de ablatieve oplossing in direct contact is gekomen met alle borstepitheelcellen. Het leveren van een oplossing binnen de ductale boom(en) en de visualisatie ervan door middel van beeldgeleide fluoroscopie of ductografie zijn mogelijk via klinische procedures die albestaan 15,16,17. Het zal dus haalbaar zijn om deze procedure gemakkelijk te implementeren en te evalueren in klinische onderzoeken. Een belangrijke stap in het vaststellen van de werkzaamheid en translationele haalbaarheid van intraductale (ID) ablatie als een nieuwe interventie voor primaire preventie zal zijn om de haalbaarheid van deze röntgenvisualisatiebenadering aan te tonen in diermodellen van toenemende omvang en complexiteit van hun ductale boomarchitectuur 4,18,19. Een protocol dat deze ablatieve procedure opschaalt van muis20 naar rattenmodellen wordt hier beschreven. Terwijl muis- en rattenkanaalbomen een vergelijkbare lineaire structuur en vertakkingspatroon hebben, is de rat ductale boom proportioneel groter en wordt omgeven door een veel dichter stroma. We hebben in het laboratorium een methode geïmplementeerd om elke borstklier in een rat met succes te injecteren gedurende een reeks wekelijkse sessies met een ablatieve oplossing die een contrastmiddel bevat. Sessieafstand is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de dieren minimale bijwerkingen van EtOH hebben (figuur 1 en figuur 2). De procedure omvat injectie van de ablatieve oplossing rechtstreeks in de tepelopening van een isofluraan-verdoofde rat met een naald van 33 G. Enkele belangrijke verbeteringen van de procedure zijn het gebruik van uitgebreide ontstekingsremmende behandeling, injectie van hogere volumes per ductale boom dan voorgesteld21, en gasdichte spuiten voor vloeistof en gassen. De duur van de behandeling met 5 mg/kg carprofen (een NSAID) van 48 uur vóór tot 1 week na ID-injecties is vergelijkbaar met het ontstekingsremmende protocol dat wordt gebruikt voor de scleroserende behandeling van veneuze misvorming in de kliniek. De behandeling wordt uitgevoerd bij patiënten onder systemische anesthesie gevolgd door 2 dagen ontstekingsremmende medicijnen zoals NSAID's. De ontstekingsremmende behandeling kan nog een paar dagen worden verlengd om lokale ontstekingen en eventuele pijn te verminderen13. Net als bij muizen20 vermindert intraperitoneale injectie van een 5% sucrose-oplossing het kortetermijneffect van alcoholintoxicatie bij ratten. Ratten kunnen worden geïnjecteerd met maximaal 1 ml 70% EtOH (maximaal 4 kanalen; 0,2 g / dL EtOH-gehalte in het bloed) in een enkele sessie wanneer ze worden toegediend met deze sucrose-oplossing; dieren herstellen volledig binnen 4 uur na ID-injecties. We voeren sequentiële sessies uit om voldoende hersteltijd te bieden bij het injecteren van meer dan 4 klieren en/of hogere EtOH-concentraties. Alcoholintoxicatie bij vrouwen zal veel minder waarschijnlijk zijn als ID-injectie van alle ductale bomen in beide borsten, ervan uitgaande dat 16 hoofdkanalen16,17 en 2 ml per kanaal22,23, met 70% EtOH zou resulteren in minder dan 0,1 g / dL etoh-gehalte in het bloed en milde stoornissen kan veroorzaken.
Röntgenfoto's maken het mogelijk om te bepalen hoe succesvol de intraductale toediening is in elke individuele klier en of de hele ductale boom is gevuld (figuur 1, figuur 2, figuur 3). Real-time fluoroscopie beeldvorming ter voorbereiding op micro-CT-scan en/of 3D-reconstructie van DICOM-bestandsgegevens kan worden gebruikt om de mate van oplossingsafgifte in de ductale boom en eventuele lekkage in het stroma te beoordelen. Het gebruik van fluoroscopie kan helpen om de totale stralingsdosis die aan het dier wordt opgelegd te beperken. De fluoroscopietechniek benadert meer de beoogde klinische toepassing voor beeldgeleiding van deze ablatieve behandeling. Vergelijking van door de FDA goedgekeurde jodiumhoudende Isovue met tantaaloxide (TaOx) nanodeeltjes is uitgevoerd om het nut van de ablatieve oplossing verder te verfijnen 4,19. Het is gebleken dat TaOx een superieur micro-CT-contrastmiddel is dan Isovue voor visualisatie van de initiële vulling van de ductale boom bij muizen 4,19. Hier tonen we aan dat TaOx een geschikt contrastmiddel is om de eerste vulling van de rat ductale boom te visualiseren (figuur 2 en figuur 3). Zowel in translationeel onderzoek als in klinische praktijktoepassingen is het geleermiddel ethylcellulose (EC) toegevoegd aan de EtOH-oplossing om diffusie uit de beoogde doelgebieden 13,14,24,25,26,27,28,29 te minimaliseren. Studies hebben aangetoond dat toevoeging van maximaal 1,5% EC aan EtOH-bevattende ablatieve oplossingen compatibel is met TaOx-gebaseerde beeldvorming (figuur 3). Deze en verdere verfijningen van de ablatieve oplossing kunnen helpen bij de kant-en-klare vertaling van deze beeldgeleide procedure naar de kliniek.
Protocol
Alle experimenten die worden beschreven, zijn uitgevoerd onder protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Michigan State University.
1. Uitgebreide ontstekingsremmende behandeling
- Bereid sucralose gel cups als orale dosering van carprofen. Geef ratten deze ontstekingsremmende behandeling vanaf 2 dagen voordat ze een ID-injectie van 70% EtOH krijgen tot 7 dagen na de procedure.
- Verdun een werkoplossing van carprofen in steriel PBS voor injectie in de beker. Bereid uit 50 mg/ml stamoplossing een verdunde oplossing van 2 mg/ml gekleurd met 1% v/v steriele blauwe levensmiddelenkleurstof en injecteer 500 μL in elke beker. Toevoeging van de kleurstof helpt bij de visualisatie van volledige vermenging van het medicijn in de sucralose van de beker.
- Volg de aanbeveling van de fabrikant om de beker voor te bereiden op de toevoeging van carprofen. Tenzij anders aangegeven door de verkoper, verwarmt u de beker in een waterbad bij 60 °C gedurende 15 minuten en droogt u deze af bij verwijdering om het risico op besmetting te verminderen.
- Veeg het deksel van de sucralosebeker schoon met 70% EtOH in het gebied en breng de naald van de spuit met de carprofen-werkoplossing. Doseer het juiste volume (500 μL).
- Bedek de lekke band met een sticker. Schud de beker energetisch gedurende 15 s en plaats die beker vervolgens in een vortex voor nog eens 15 s. Beoordeel visueel het homogene en volledige mengen voordat u het opslaat voor later gebruik. Zoek naar de aanwezigheid van een donkerblauwe kleur.
LET OP: Laat de kopjes op kamertemperatuur komen. Bewaar de bekers indien gewenst bij kamertemperatuur, maar let op de richtlijnen voor de werkzaamheid van het geneesmiddel van de fabrikant. U kunt de bekers ook bij 4 °C bewaren en binnen een maand gebruiken. Het dateren van de sticker is een goede gewoonte om de injectiedatum bij te houden zonder het risico dat een pen of scherpe marker het deksel doorboort.
- Veeg vlak voor gebruik de buitenkant van de beker af met 70% EtOH. Verwijder het deksel voordat u de beker in de dierenkooi plaatst. Vervang bekers om de dag of wanneer ze leeg zijn. Controleer dagelijks het gelgehalte om een adequate dosering te garanderen. Eén beker kan carprofen leveren voor maximaal twee ratten gedurende maximaal 2 dagen; ratten kunnen echter de hele kop eerder consumeren.
2. Preoperatieve voorbereiding
OPMERKING: Zorg ervoor dat de diervoorbereidingsstap 2-3 dagen voorafgaat aan de ID-injectieprocedure.
- Zet de isofluraanverdamper aan (2%-3% isofluraan, 1,5 l/min zuurstof) om de rat te verdoven. Verplaats het dier naar een neuskegel op een opwarmkussen. Breng oogsmeermiddel aan op de rat en plaats het dier vervolgens op zijn rug. Controleer zorgvuldig de ademhaling van het dier om ervoor te zorgen dat het verdovingsvlak op 1% -3% isofluraan wordt gehouden.
OPMERKING: Een elektrisch scheermes kan worden gebruikt om overtollig bont te verwijderen voordat het wordt ontharen. Uiterste zorg moet worden genomen om geen tepels te beschadigen met het scheermes. Om deze reden kan deze stap worden overgeslagen. Ratten zijn gevoeliger voor ontharingscrème dan muizen, dus het verwijderen van overtollige crème is erg belangrijk. Vermijd het injecteren van een ethanolhoudende oplossing in een gebied waar al een slijtage aanwezig is door ontharen. Sommige crèmes hebben verbindingen toegevoegd zoals aloë en lanoline die kunnen helpen de kans op schaafwonden te minimaliseren. - Gebruik een katoenen tip applicator om de vrij verkrijgbare ontharingscrème op het tepelgebied te verspreiden. Gebruik de applicator om de crème gedurende 10-30 s in het gebied te wrijven. Controleer of de vacht snel is losgekomen.
- Laat de crème zo kort mogelijk op de rat zitten en verwijder deze volledig om verbranding van de huid te voorkomen. Ratten zijn zelfs gevoeliger voor deze procedure dan muizen.
- Na 10-30 s aanbrengen, nat gaas met warm water en gebruik het om de crème en de losgemaakte vacht van het dier te spoelen. Voer ten minste drie spoelingen van het gebied uit met vers bevochtigd gaas en droog met droog gaas na de laatste spoeling. Bevestig goed zicht en toegang tot het gebied van de tepel van waaruit de vacht wordt verwijderd. Herhaal indien nodig de ontharingsprocedure.
- Plaats de rat in een schone kooi op een verwarmingskussen en laat hem herstellen. Controleer de rat om er zeker van te zijn dat hij volledig hersteld is van de anesthesie voordat je hem terugbrengt naar zijn permanente kooi.
- Plaats een carprofen-gedoseerde (1 mg /kop) sucralose gel cup in de kooi voor een ontstekingsremmende behandeling. Controleer de gelconsumptie dagelijks en vervang deze door een verse beker. Laat de beker niet langer dan 2 dagen staan. Meestal moeten bekers na 1 dag worden vervangen.
3. Intraductale injectie
- Bereid de TaOx stockoplossing op 333,3 mM zoals beschreven19 met behulp van steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwarm de oplossing als het poeder niet volledig oplost. Roer zachtjes. Draai niet te vortexen of krachtig te schudden om bubbelvorming te voorkomen.
- Meng drie delen van 333,3 mM TaOx met zeven delen van 100% EtOH voor een uiteindelijke 70% EtOH 100 mM/TaOx oplossing. Voeg eventueel een geschikte hoeveelheid van 0,5% -1,5% ethylcellulose (EC) toe als geleermiddel om de lokale retentie van de ablatieve oplossing te maximaliseren. Voeg 1% v/v blauwe voedselkleurstof toe aan de ablatieve oplossing voor visueel onderzoek van de toediening in de ductale boom tijdens de infusie.
- Bereid een volume voor dat geschikt is voor experimentele behoeften. Klierparen 1 (cervicaal) en 6 (inguinaal) kunnen worden gevuld met maximaal 100 μL van de oplossing, terwijl alle andere paren kunnen worden gevuld met maximaal 300 μL.
- Verdoof de rat zoals in stap 2.1 en verplaats de rat naar de neuskegel zodra deze volledig is verdoofd. Breng oogsmeermiddel aan op beide ogen en plaats het dier vervolgens op zijn rug. Bevestig de rat onder de stereoscoop met tape in de buurt van de tepels die indien gewenst worden geïnjecteerd. Het gewicht van de rat is over het algemeen voldoende om te voorkomen dat hij substantieel beweegt zonder te tapen.
- Om de tepels voor te bereiden op injectie, verwijdert u indien mogelijk alle dode huid die de tepelopening bedekt met een fijne puntige tang. Ratten hebben vaak een plug die uit de tepelopening steekt die een succesvolle cannulatie van de tepel kan voorkomen als deze niet wordt verwijderd.
OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat grotere injectievolumes van ablatieve oplossingen die bij ratten worden gebruikt, eerder kunnen leiden tot oppervlakkige huidwonden in de buurt van de injectieplaats (en). Om deze reden is het injecteren van elke andere tepel in een enkele sessie minder schadelijk en irriterend voor het dier dan het injecteren van aangrenzende tepels. Het controleren van de ratten op schaafwonden gedurende 7 dagen na de injectie helpt om ervoor te zorgen dat er geen ernstige gezondheidseffecten zijn van het krabben van het dier en het introduceren van de mogelijkheid van infectie door besmetting met puin van de kooivloer. Drievoudige antibiotische zalf of wasbeurten met chloorhexidine-oplossing kunnen worden gebruikt om eventuele tekenen van letselinfectie te behandelen (tabel 1). - Gebruik een spuit van 500 μL met een naald van 33 G om 101-301 μL ablatieve oplossing aan te zuigen. Zuig een extra 1 μL van de oplossing op voor mogelijke kleine lekkage bij het verwijderen van de gecannuleerde naald.
OPMERKING: Dit zijn aanbevelingen voor volumes die gericht zijn op het volledig vullen van de ductale boom (en): tot 100 μL in cervicale en inguinale klieren en tot 300 μL in de andere klieren. Voor andere toepassingen kan het aangewezen zijn om kleinere of grotere volumes te gebruiken. - Gebruik een pincet om de tepel voorzichtig vast te houden en kan de naald in de tepelopening plaatsen. Blijf voorzichtig doorgaan met het inbrengen van de naald totdat de schuine kant volledig in de tepel zit. Om de naald in de tepel te plaatsen, brengt u de tepel omhoog naar de naald in plaats van de naald naar beneden in de tepel te duwen. (Tabel 1). Zorg ervoor dat u het pad van de tepelopening volgt.
OPMERKING: Rattentepels zijn over het algemeen veel gemakkelijker te manipuleren en met succes te cannuleren dan die bij muizen vanwege de grotere omvang. De verhoogde hoeveelheid vet rond de tepelopening maakt het echter ook waarschijnlijker om per ongeluk het vetkussen te injecteren als de naald afwijkt van het hoofdkanaal. - Zodra de naaldafschuin volledig is ingebracht, injecteert u de oplossing langzaam met een constante snelheid van ongeveer 100 μL/min bij ratten. Abrupte veranderingen in de infusiesnelheid kunnen barsten of de ductale boom beschadigen. Wacht 30 s na het einde van de infusie voordat u de naald uit de gecannuleerde boom verwijdert met behulp van een tang; dit zorgt ervoor dat het geïnjecteerde volume binnen de ductale boom blijft (figuur 2) en vermindert de kans op lekkage.
- Reinig elke gemorste oplossing met bevochtigd gaas of een EtOH-doekje om een externe contrastoplossing in de afbeeldingen te voorkomen.
- Injecteer PBS met 5% sucrose (10 ml /kg) intraperitoneaal om de effecten van alcoholintoxicatie te verzachten als ethanol zich in de ID-injectieoplossingen bevindt. Deze dosis kan aan het begin en aan het einde van de procedure worden gegeven.
4. Micro-CT beeldvorming
- Nadat alle gewenste klieren zijn geïnjecteerd, verplaatst u het dier snel naar het micro-CT-systeem en blijft u de anesthesie handhaven met behulp van de ingebouwde isofluraanverdamper.
- Strek de wervelkolom van het dier en plak elke achterpoot in een verlengde positie vast, zodat de beenbotten van het dier verder weg zijn van de onderste klieren van belang en niet overlappen met het gebied van belang in de gescande afbeelding.
- Tape over de buik om ademhalingsartefacten te minimaliseren bij het scannen van de onderste klieren.
OPMERKING: Dieren kunnen worden afgebeeld met verschillende scanparameters (bijv. hoge resolutie, longitudinale scans) als ervoor wordt gezorgd dat een geschikte levenslange dosis straling voor ratten wordt bepaald en ervoor wordt gezorgd dat de cumulatieve dosis dit niveau niet overschrijdt. De blootstelling aan straling kan verder worden verminderd door fluoroscopiestills en -video's te verkrijgen zonder scans uit te voeren (figuur 2). - TaOx-beeldvorming van de ductale boom van de rat uitvoeren met een goede resolutie en gelegenheid voor herhaalde standaard (2 min) acquisitiescans met behulp van de volgende scanparameters: 90 kVp / 88 μA; gezichtsveld (FOV), 72 mm; aantal plakjes, 512; plakdikte, 72 μm; voxel resolutie, 72 μm3. Scans met een hoge resolutie voor langere perioden (4-14 min) kunnen ook worden verkregen bij dieren die niet in de lengterichting worden gescand met dezelfde parameters.
- Na gegevensverzameling neemt u de rat voorzichtig weg van de anesthesiekegel en plaatst u deze in een nieuwe schone kooi op een verwarmingskussen. Controleer de rat om er zeker van te zijn dat hij volledig hersteld is van de anesthesie voordat je hem terugbrengt naar zijn permanente kooi. Plaats de carprofenbevattende sucralose beker en vervang op passende wijze zoals beschreven in stap 2.5 om ervoor te zorgen dat de dieren de komende 7 dagen een ontstekingsremmende behandeling blijven krijgen.
- Verwerk de gescande beelden tot snelle weergaven binnen de micro-CT-software om eventuele contrastlekken, slechts gedeeltelijke vulling of overvulling beter te waarderen (figuur 2).
- Ga naar de volgende sectie om formele beeldverwerking uit te voeren voor publicatie of gedetailleerde analyse van scans indien gewenst (figuur 3).
5. Beeldanalyse
- Gebruik gespecialiseerde softwarepakketten om renderings van de gevulde ductale boom te produceren.
OPMERKING: Het is het beste om het borstvetkussen te segmenteren om de beste weergave van de geïnjecteerde ductale boom te krijgen. Spline traceert de donkere grenzen van het vetkussen over de volledige dikte van het dier om deze segmentatie te bereiken. - Om het vetkussen te segmenteren (in tegenstelling tot muizen zijn de grenzen van dit compartiment niet zo gemakkelijk te onderscheiden van de peritoneale holte, femorale spieren en huid als gevolg van vergelijkbare Hounsfield-eenheden) waarbinnen de ductale boom van belang zich bevindt, is het selecteren van de optie "spline trace" in het handmatige menu de eerste stap in het maken van een rendering.
- Spline traceer de omtrek van het vetkussen in elke derde plak. Klik op de optie Objecten doorgeven in het semi-automatische menu. Dit zal alle segmenten verspreiden en verbinden tot een enkel gesegmenteerd object van belang.
OPMERKING: Het wijzigen van de drempel binnen het gesegmenteerde gebied maakt visualisatie van het signaal alleen mogelijk binnen een bepaald bereik van Hounsfield-eenheden (HU); voor andere contrastmiddelen of beeldparameters moet dit bereik mogelijk worden aangepast. Een softwarepakket of kunstmatige intelligentie-analyse kan worden gebruikt om andere metingen en afbeeldingen te doen om te laten zien hoeveel de ductale boom is gevuld. - Stel HU-waarden in op een dieptepunt van 300 en een hoog punt van 3.000 in het semi-automatische menu onder het tabblad drempelvolume. Dit maakt het mogelijk om een weergave te maken die alleen het contrast (TaOx) in de ductale boom weergeeft.
- Stel de weergave in als primair met behulp van de knop "weergave". Hierdoor wordt de weergave gewijzigd zodat alleen de 3D-weergave van de ductale boom wordt weergegeven.
OPMERKING: Voer een reconstructie van de ductale boom uit voor verdere analyse.
Representative Results
Elk van de 12 borstklieren van een vrouwelijke rat bevat een enkele ductale boom die opent bij de tepelopening. Ondanks de verschillen in grootte tussen de muis en de rat, is de ontwikkelingstiming van de borstklieren en de tijd dat deze dieren volwassen worden zeer vergelijkbaar30,31. Een korte beschrijving van de belangrijkste stadia van de ontwikkeling van de melkklier bij ratten als representatief voor beide knaagdiersoorten wordt gegeven. Terminale eindknoppen (TEB's) zijn de zeer proliferatieve structuren aan de uiteinden van de langwerpige ductale boom die ductalevertakkingen 30,31 sturen. De piek van proliferatie en dichtheid van de TEB's treedt op op een leeftijd van 3-4 weken tijdens de verlengingsfase van de ductale boom in de puberale ontwikkeling30. Tegen de leeftijd van 9-10 weken zijn er nog maar weinig TEB's over, omdat de ductale boom is gegroeid om de hele lengte van het vetkussen30 te bezetten. Daarna is de groei en uitzetting van de ductale boom evenredig met die van het vetkussen en van het dier32. Terminale ductale lobulaire eenheden (TDLUs) in de menselijke borst vervullen een vergelijkbare rol als de TEB's bij knaagdieren. TDLUs zijn de belangrijkste bron voor het initiëren van carcinogenese en progressie naar BC33,34. We kunnen tot 300 μL 70% EtOH-oplossing injecteren om de hele ductale boom van de thoracale en abdominale borstklieren van de 9 weken oude Sprague-Dawley-rat te vullen (figuur 1, figuur 2, figuur 3). In tegenstelling tot muizen20 zijn de tepels van de cervicale en inguinale klieren van de Sprague-Dawley-ratten meestal geschikt voor injectie bij meer dan 80% van de dieren, en tot 100 μL van 70% EtOH-oplossing is vereist om de hele ductale boom te vullen (figuur 2). We injecteren routinematig maximaal 10 borstklieren met de ablatieve oplossing die wordt bestudeerd. Een typisch experimenteel ontwerp bestaat uit twee onafhankelijke wekelijkse ID-injectiesessies, waarbij vijf wisselklieren worden toegediend met de ablatieve oplossing met röntgencontrastmiddel en/of EC als geleermiddel (figuur 2). Voor TaOx-bevattende (50-200 mM) ablatieve oplossing wordt fluoroscopie en/of micro-CT-scanning uitgevoerd na het einde van elke sessie om het individuele succes van het infunderen van elke ductale boom met gedeeltelijke of volledige hoeveelheid geïnfundeerde oplossing te bepalen en vast te leggen (figuur 2). Onmiddellijke en longitudinale beeldvorming na injectie maakt het mogelijk te beoordelen hoe veranderingen in de formulering, met name de concentratie van EC-geleermiddel, de buitendiffusie van de ablatieve oplossing als functie van het geïnjecteerde volume beïnvloeden en beperken (figuur 3). Deze beeldvormingsanalyse biedt informatie om de optimale parameters te begrijpen om maximale ablatie te bereiken met minimale collaterale weefselschade.
Figuur 1: Schema's van de procedure voor intraductale injectie en beeldanalyse bij ratten. De stapsgewijze procedure voor intraductale injectie en beeldanalyse worden gemarkeerd. Zie de video voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van tepelcantnulatie en toedieningsuitkomst van de ablatieve oplossing in meerdere borstklieren. (A) Typische presentatie van tepelvormen in de Sprague-Dawley-rattenstam. Tepellengte correleert met de kans op succesvolle cannulatie. Langere tepels zijn gemakkelijker te cannuleren dan korte tepels, terwijl te korte of rudimentaire tepels niet kunnen worden gecannuleerd. Eenmaal gecannuleerd, kunnen zowel lange als korte tepels worden doordrenkt met de oplossing en vergelijkbare slagingspercentages van de bevalling bereiken. Blauwe voedselkleurstof in de geïnjecteerde oplossing kan worden gebruikt als in vivo bewijs van ductale boomvulling en leveringssucces (meest duidelijk, koepelvorming, voor een mislukte vetkusseninjectie). Real-time fluoroscopie (B) en 3D micro-CT-uitvoeringen gegenereerd na beeldacquisitie (C) leveren in vivo bewijs van leveringssucces en meer kwantitatieve beoordeling van de oplossing die de TEB's bereikt. (B) Elke abdominale borstklier van het eerste paar (# 4, # 10) ontving ablatieve oplossing met 1% EC (oranje omtrek) of zonder (groene omtrek) (C) Succesvolle levering (blauwe omtrek) van de ablatieve oplossing in de rechter cervicale (# 7), tweede paar thoracale (# 3, # 9) en eerste paar abdominale (# 4, # 10) borstklieren, en mislukte injectie (onderbroken witte omtrek) in de linker thoracale (# 1) klier. Schaalbalken komen overeen met 1 mm in de afbeeldingen bij verschillende vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: 3D-reconstructie en beoordeling van het vullen en diffusie van ablatieve oplossing. 70% EtOH/100 mM TaOx nanodeeltjes met 1% EC (boven) of zonder EC (onder) werden intraductaal geïnjecteerd in het tweede abdominale borstklierpaar (#4 en #10) en onmiddellijk in beeld gebracht door micro-CT. Elke Sprague-Dawley-rat kreeg een toenemend volume van beide oplossingen. Individuele ductale bomen werden gereconstrueerd met behulp van een softwarepakket voor beeldanalyse (spline trace + propagate object + threshold rendition). Met 1% EC kan de oplossing worden gezien die de eindeinden bereikt. Naarmate het geleverde volume toeneemt, wordt het aantal gevulde TEB's duidelijker. De schaalbalk komt in alle uitvoeringen overeen met 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Uitgeven | Uiterlijk | Oplossing | |||
| Korte tepel (fig. 2) | Tepel heeft een laag profiel – moeilijk te grijpen | Het is soms gemakkelijker om de huid in de buurt van de tepel te houden en het midden van de tepel met de naald te richten. De naald zal waarschijnlijk onder de huid duiken. Langzaam optrekken kan onthullen dat de tepel iets over de punt van de naald ligt en ruimte geven om deze vast te pakken en de rest van de weg op de naald te trekken. Wees heel voorzichtig wanneer u onder de huid duikt over de hoek van de naald. Het is gemakkelijk om per ongeluk een vetkusseninjectie te krijgen door in de verkeerde hoek te steken. | |||
| Vet pad injectie (Fig. 2) | Gezwollen rond tepel en mogelijk in tepel zelf – het gemakkelijkst om te zien of kleur wordt toegevoegd aan de injectie-oplossing | Als de tepel opzwelt met de eerste paar ul geïnjecteerd, verwijder dan de naald en probeer opnieuw in te brengen met meer zorg voor de hoek. Begin opnieuw met injecteren en let op verdere zwelling. Als de zwelling aanhoudt, stop dan met het proberen. Het is zeer zeldzaam om met succes een tepel te injecteren die is begonnen als een vetkusseninjectie. | |||
| Wonden/korstvorming | Open wond of korstvorming nabij de injectieplaats van EtOH-oplossing | Ratten hebben meer kans dan muizen om wonden of korstvorming te ontwikkelen in de buurt van het injectiegebied. Als wonden worden gevonden, breng dan drievoudige antibiotische zalf aan op open wonden, maar laat korstwonden met rust. Het aanbrengen van zalf op korstjes kan de kans vergroten dat het dier de korst stoort en verwijdert. Controleer elke 1-2 dagen totdat het genezen is, afhankelijk van de ernst van de wond. Carprofen moet worden gegeven totdat het genezen is, zelfs als het buiten het normale venster ligt. | |||
| Injecteer wisselklieren | N.V.T | Grotere injectievolumes bij ratten maken het waarschijnlijker dat huidschaafwonden worden veroorzaakt bij het injecteren van opeenvolgende klieren. Voor de minste kans op trauma aan het injectiegebied, alternatieve klieren geïnjecteerd binnen een enkele sessie (d.w.z. injecteren # 1, 3, 4 en 6 in plaats van # 1-4). Afstand tussen derde (# 3 en # 9) en vierde (# 4 en # 10) klierparen maakt injectie van beide klieren in één sessie mogelijk. | |||
Tabel 1: Handige tips en probleemoplossing
Discussion
Zoals hier getoond, abtueert ID-levering van 70% EtOH bij voorkeur de borstepitheelcellen met beperkte nevenschade aan het omliggende stroma en de vasculatuur bij muizen4. Lokale ablatie van de ductale boom is effectief in het voorkomen van tumorvorming in muismodellen4. Hier tonen we aan dat deze ablatieve procedure kan worden opgeschaald naar ratten.
Dit is de volgende stap op weg naar vertaling van deze ablatieve procedure als een alternatieve interventie voor profylactische mastectomie voor primaire preventie van borstkanker bij personen met een hoog risico. Toevoeging van TaOx nanodeeltjes als röntgencontrastmiddel aan de ablatieve oplossing maakt het mogelijk om de effectiviteit van de oplossing bij het voorkomen van tumorvorming te beoordelen, omdat kan worden bepaald of de procedure succesvol was of niet bij het volledig vullen van de ductale boom. Het gebruik van fluoroscopie om de geïnjecteerde borstklier te visualiseren, weerspiegelt wat er waarschijnlijk in de kliniek zal worden gedaan om deze ID-procedure te begeleiden. Beeldbegeleiding van hoeveel de oplossing de ductale boom heeft gevuld en wanneer de infusie moet worden gestopt, zal een belangrijk aspect van de klinische implementatie zijn om een maximale vulling van elke ductale boom te garanderen. Probleemoplossing en nuttige tips staan vermeld in tabel 1. Effectiviteit van deze ablatieve procedure vereist dat de geïnfundeerde oplossing direct contact maakt met alle epitheelcellen om de snelheid van celdoding te maximaliseren. Reserve-epitheelcellen in een of meer bomen kunnen uiteindelijk dienen als een bron voor bc-ontwikkeling. De andere groepen rapporteerden ID-toediening van virale deeltjes (bijv. componenten van Cre / LoxP- en / of Cas9 / CRISPR-systemen), hormonen en hormoonantagonisten (bijv. Prolactine, fulvestrant), chemotherapeutische middelen (bijv. Cisplatine), siRNA's en / of antilichamen of andere targetingmiddelen bij muizen 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, ratten 21,33,46,47,48 en/of konijnen 18,49,50,51,52,53 . Succesvolle cannulatie van maximaal acht ductale bomen per menselijke borst voor lokale toediening van chemotherapie is gemeld in onafhankelijke klinische studies 47,54,55. Beeldbegeleiding voor infusie van deze andere oplossingen gericht op tumorpreventie of gericht op lokale behandeling zou op dezelfde manier hun effectiviteit maximaliseren.
De schaalbaarheid en verfijning van deze procedure van muis tot rat ductale boom wordt hier gedemonstreerd. TaOx nanodeeltje in de murine 4,19 en rat (ongepubliceerde gegevens) ductale boom bieden hoge resolutie beeldvorming die de door de FDA goedgekeurde jodiumhoudende röntgencontrastmiddelen overtreft. Evenzo zijn we ons niet bewust van andere ductale boombeeldvormingsbenaderingen bij muizen40,41 of andere diermodellen18 die een vergelijkbare resolutie kunnen bieden als TaOx. Relevant voor klinische vertaling is het feit dat het geleereffect van EC in deze rattenmodellen van gemiddelde grootte een formuleringsverfijning mogelijk maakt om collaterale weefselschade te minimaliseren. Naarmate we deze ablatieve ID-procedure blijven beoordelen op zijn vermogen om BC te voorkomen, zullen we nauwkeuriger kunnen bepalen uit welke klieren BC zich ontwikkelt door de toegevoegde informatie die wordt verstrekt door beeldvorming na ID-levering in chemisch geïnduceerde en andere rattenmodellen van BC. Deze gegevens zullen de veiligheid van deze procedure bepalen en eventuele zorgen of tekortkomingen vaststellen over de vraag of gedeeltelijk of niet-mislukt behandelde ductale bomen meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van BC bij een vrouw met een hoog risico.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Cancer Institute R21 CA226579 en R01 CA258314 subsidies aan LFS en door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 subsidie aan EMS. We zijn het MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core-faciliteit dankbaar voor het gebruik van hun beeldvormingssystemen en technische expertise. We bedanken Dr. Danielle Ferguson voor het beoordelen van de inhoud van de video en de cijfers voor de naleving van dierenwelzijnsrichtlijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Wild, C. P. The global cancer burden: necessity is the mother of prevention. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 123-124 (2019).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal of Gastroenterology. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the breast treated with percutaneous ethanol injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutic Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Faguy, K. Ductography: When, how, and why. Radiologic Technology. 92 (5), 487-503 (2021).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (121), e55209 (2017).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Kenyon, E., et al. Intraductal delivery and x-ray visualization of ethanol-based ablative solution for prevention and local treatment of breast cancer in mouse models. Journal of Visualized Experiments. (182), e63457 (2022).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Lai, Y. E., Morhard, R., Ramanujam, N., Nolan, M. W. Minimally invasive ethyl cellulose ethanol ablation in domesticated cats with naturally occurring head and neck cancers: Six cats. Veterinary and Comparative Oncology. 19 (3), 492-500 (2021).
- Mueller, J. L., et al. Optimizing ethyl cellulose-ethanol delivery towards enabling ablation of cervical dysplasia. Scientific Reports. 11 (1), 16869 (2021).
- Nief, C., et al. Polymer-assisted intratumoral delivery of ethanol: Preclinical investigation of safety and efficacy in a murine breast cancer model. PLoS One. 16 (1), 0234535 (2021).
- Chelales, E., et al. Radiologic-pathologic analysis of increased ethanol localization and ablative extent achieved by ethyl cellulose. Scientific Reports. 11 (1), 20700 (2021).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Trans Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Russo, I. H., Russo, J. Developmental stage of the rat mammary gland as determinant of its susceptibility to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. Journal of the National Cancer Institute. 61 (6), 1439-1449 (1978).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Research Treatment. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Scientific Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast - A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 907-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translational Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. The Biochemical Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Preview Research (Phila). 6 (1), 51-58 (2013).
