Summary
이 기사는 Cucurbita pepo와 Cucurbita moschata의 종간 교잡에서 파생 된 미성숙 배아의 재생을위한 배아 구조 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 복제 할 수 있으며 스쿼시 육종 프로그램에 중요한 자원이 될 것입니다.
Abstract
Cucurbita 작물 (스쿼시)에서의 종간 교잡은 유전 적 변이를 확대하고 유용한 대립 유전자의 침입에 바람직합니다. 이러한 넓은 십자가에서 생성 된 미성숙 배아는 적절한 배아 구조 기술을 사용하여 재생되어야합니다. 이 기술은 많은 작물에 대해 잘 확립되어 있지만 일상적인 적용을 허용하는 스쿼시에 대한 적절한 방법론에 대한 자세한 설명이 부족합니다. 여기에서는 C. pepo와 C. moschata의 종간 교잡에 유용한 배아 구조 프로토콜을 설명합니다. 배아 구조를위한 실행 가능한 조합을 확인하기 위해, 24 개의 종간 교차가 수행되었다. 과일 세트는 22 개의 십자가에서 얻어졌으며 92 %의 성공률을 나타냅니다. 그러나 얻은 과일의 대부분은 배아가없는 씨앗 (빈 씨앗)이있는 단과피였습니다. 단 하나의 교차 조합만이 기초 식물 성장 배지를 사용하여 재생될 수 있는 미성숙 배아를 포함했습니다. 종간F1 열매에서 총 10 개의 배아가 구출되었으며, 배아 구조 성공률은 80 %였다. 여기에서 개발 된 배아 구조 프로토콜은 스쿼시 육종 프로그램에서 종간 교잡에 유용 할 것입니다.
Introduction
Cucurbita (2n = 40)는 27 종의 다른 종을 포함하는 Cucurbitaceae 계통의 매우 다양한 속이며 그 중 5 종은 길 들여집니다1. 이 중 Cucurbita moschata, C. pepo 및 C. maxima는 전 세계적으로 경제적으로 가장 중요합니다. 미국에서 C. moschata와 C. pepo는 농업 생산에서 가장 중요한 두 종입니다. C. pepo는 여름과 겨울 호박 품종 그룹을 모두 포함하는 4 개의 아종 (ovifera, pepo, fraternal 및 gumala)으로 구성됩니다. C. moschata는 주로 버터넛, 디킨슨, 치즈 그룹1을 포함한 겨울 스쿼시 시장 유형으로 구성됩니다. 두 종은 형태 학적으로나 표현형적으로 다양하며 C. pepo는 수확량, 얼얼함, 덤불 성장 습관 및 과일 모양, 과일 크기, 과육 색상 및 껍질 패턴을 포함한 다양한 과일 특성으로 간주됩니다. 반면에 C. moschata는 열과 습도, 질병 및 해충 저항성 6,7에 대한 적응으로 높이 평가됩니다. C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교잡은 두 종 사이의 바람직한 특성을 침해하는 중요한 전략 일뿐만 아니라 육종 프로그램 7,8에서 유전 적 기반을 넓힐 수 있습니다.
C. moschata와 C. pepo 사이의 초기 교배는 호환성 및 / 또는 분류 학적 장벽 9,10,11을 결정하기 위해 이루어졌지만 후기 연구는 주로 바람직한 특성12,13,14를 전달하는 데 중점을 두었습니다. 두 종 간의 종간 교잡은 질병 저항성, 비 생물 적 스트레스에 대한 적응성 및 C. moschata14,15,16의 활력 증가와 함께 부시 또는 반 부시 성장 습관 및 C. pepo의 수확량 향상과 같은 새로운 특성의 전달을 목표로했습니다. 예를 들어, C. pepo (P5)와 C. moschata (MO3) 사이의 특정 교배는 더 높은 과일 수확량 13을 초래 한 반면, C. moschata 가입 (나이지리아 지역 및 메니나)은 재배 된 C. pepo 품종17,18에서 포티 바이러스에 대한 내성의 주요 원천으로 널리 사용되었습니다.
이전 연구에 따르면 C. moschata와 C. pepo 사이의 교잡은 가능하지만 어렵습니다 8,15. 종간 교배는 과일 세트 없음 (낙태), 생존 가능한 씨앗이없는 단과피 과일 (빈 씨앗), 미성숙 배아가 발달하지 않는 씨없는 과일 (stenospermocarpy) 또는 배아 구조를 통해 성숙한 식물로 구출 될 수있는 미성숙 배아가 거의없는 과일15,16. 예를 들어, C. pepo (테이블 퀸, 모계)와 C. moschata (큰 치즈, 부계)를 교배하여 생존 가능한 종자를 얻지 못했지만, 상호 교배는 134 개의 수분에서 57 개의 생존 가능한 종자를 산출했습니다9. 하야세는 10°C에서 밤새 보관된 꽃가루를 사용하여 오전 04:00에 교배를 한 경우에만 C. moschata 및 C. pepo 교배종으로부터 생존 가능한 종자를 얻었다19. Baggett는 8 개의 다른 C. moschata 품종을 C. pepo (delicata)와 교배했으며 총 103 개의 수분 중 83 개의 과일이 정상으로 보였지만 그 중 어느 것도 생존 가능한 종자를 포함하지 않았다고보고했습니다8. C. pepo (S179)와 C. moschata (NK)의 교배에서 Zhang 등은 2,994 개의 종자로 15 개의 과일을 얻었지만 그 중 12 개만 생존 할 수 있었고 나머지는 초보적인 발달 만 보였습니다. 이 연구는 C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교배가 매우 유익하지만 십자가에서 생존 가능한 씨앗으로 과일을 얻는 것은16을 요구한다는 것을 시사합니다.
배아 구조는 조기 낙태 또는 잘 발달되지 않은 배아에서 발생하는 문제를 극복하기 위한 적절한 방법으로 제안되었으며 미성숙 배아의 재생을 위한 가장 초기의 가장 성공적인 시험관 배양 기술 중 하나입니다16,20. 배아 구조는 저개발 / 미성숙 배아의 시험관 내 배양에 이어 묘목 및 궁극적으로 성숙한 식물21의 회복을 촉진하기 위해 멸균 영양 배지로 옮기는 것을 포함합니다. 배아 구조는 일반적으로 스쿼시 육종에 사용되지만 일상적인 적용을 허용하는 적절한 방법론에 대한 자세한 설명이 부족합니다. Cucurbita 종에서 종간 교잡 장벽을 극복하기 위해 배아 구조 기술을 사용하는 것은 이미 195422 년에보고되었습니다. 그러나 초기 연구에서 배아 구조의 성공은보고되지 않았거나 매우 낮았다. Metwally et al. C. pepo와 C. martinezii23 사이의 교배에서 구출 된 100 개의 종간 잡종 배아 중 10 %의 성공률 (성숙한 식물로의 재생)을보고했습니다. Sisko et al. 서로 다른 교차 조합으로부터 얻은 배아 중 배아 재생의 다양한 성공률을보고했다 : C. maxima (Bos. Max)와 C. pepo (Gold Rush)를 교배하여 얻은 잡종의 재생률은 15.5 % 였고, C. pepo (Zucchini)와 C. moschata (Hokaido)는 20 % 였고, C. pepo (Gold Rush)와 C. moschata (Dolga)는 37.5 % 24였다. 유전자형 이외에, 배지 및 시험관 내 배양 조건은 기술25,26의 성공을위한 중요한 요소입니다. 현재 연구에서는 C. moschata와 C. pepo 사이의 다양한 교차 조합을 테스트하고 스쿼시에서 배아 구조 기술을 활용하기위한 간단한 방법론을 개발했습니다. 간단하고 쉽게 재현 가능한 배아 구조 기술의 개발은 스쿼시 육종 프로그램에서 종간 교잡 및 생식질 향상을 촉진할 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 심기 및 수분
참고: 교잡이 과일 세트와 생존 가능한 배아의 생산을 초래할 수 있는 호환 가능한 유전자형을 식별하는 것이 중요합니다.
- 심기 조건 및 유지 관리
- 교잡화를 위해 호박 유전자형(품종/가입)의 종자를 얻습니다(표 1).
- 50 셀 시작 플랫 (25cm 너비 x 50cm 길이)을 1.38g / kg N, 1.38g / kg P 및 1.38g / kg K를 포함하는 완전한 NPK 비료로 수정 된 화분 배지로 채 웁니다.
- 씨앗을 길이와 같은 깊이로 뿌리고 화분 매체로 덮으십시오. 고인 물을 만들지 않고 평지에 물을주십시오. 그런 다음 하루에 한 번 손으로 물을 주어 미디어를 촉촉하게 유지하십시오.
- 두 번째 진정한 잎 단계에서 묘목을 직경 25cm에서 30cm 화분에 이식하고 3 큰술 / 화분에 완전한 NPK 비료로 수정합니다. 물 갤런 당 500g 농도에 NPK 20:20:20을 함유 한 액체 비료 1mL / 냄비로 일주일에 한 번 식물을 비옥하게합니다.
- 자연 채광 체제에서 22-28 ° C 사이의 온도에서 온실에 식물을 유지하십시오. 유전자형 덩굴의 경우 온실에서지지 격자를 제공하십시오 (그림 1).
- 수분 수행
- 일반적으로 스쿼시의 개화는 품종에 따라 파종 후 6-8 주에 시작됩니다 (그림 2A, B). 식물이 개화하기 시작하자마자 제어 된 교잡 (십자가)을 시작하십시오. 온실 상태에서 수분은 일년 내내 할 수 있습니다.
- 다음날 수분 준비가 될 C. pepo 및 C . moschata 품종의 수꽃과 암꽃을 확인하십시오. 그러한 꽃을 식별하려면 꽃잎이 노란색 색조를 띠지 만 열리지 않은 꽃을 확인하십시오. 우발적 인 곤충 수분을 방지하기 위해 마스킹 테이프를 사용하여 상단에서 닫힌 꽃을 부드럽게 테이프로 붙입니다 (그림 2C, D).
- 다음날 아침, 꽃은 수분 할 준비가되었습니다. 교잡 성공률을 높이기 위해 오전 10:00 이전에 수분을 수행하십시오27.
- 꽃잎의 테이프 상단 부분을 부드럽게 제거하여 암꽃과 수꽃을 엽니 다. 수꽃에서 꽃잎을 제거하고 암꽃의 암술머리에 꽃밥을 부드럽게 문질러 꽃가루를 옮깁니다(그림 3A).
- 수분 후 즉시 마스킹 테이프로 수분 된 암화를 닫습니다. 태그를 사용하여 수분 날짜를 기록하고 십자가에 사용 된 부계 및 모계 부모를 나타냅니다 (그림 3B).
- 성공적인 교배는 1 주일 이내에 빠르게 작은 열매를 형성하는 확장 된 난소로 표시됩니다 (그림 4A). 그런 다음 식물은 수분 후 45-55 일 후에 수확 할 준비가됩니다28 (그림 4B).
2. 배아 구조 기술
- 미디어 준비
- 항생제 스톡 준비: 세포탁심(나트륨염)의 경우 항생제를 탈이온수 또는 증류수 4mL에 녹이고 멸균된 0.22μm 주사기 필터로 여과한 다음 0.5mL 분취량을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. 생성 된 저장 용액의 농도는 250 mg / mL입니다.
- 암피실린(나트륨염)의 경우 분말을 물 10mL에 녹이고 멸균된 0.22μm 주사기 필터로 여과한 다음 최종 농도가 100mg/mL인 1mL 스톡에 분취합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
- 1L 병에 증류수 500mL에 2.45g의 배지(4.91g/L 농도)를 용해시켜 무라시게와 스쿠그(MS) 배지를 만듭니다. 젤란 검 1.5g을 넣고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 젤란 검은 오토 클레이브 중에 완전히 용해됩니다.
- 오토클레이빙 후, 병을 50°C의 수조에 넣어 배지를 냉각시킨다. 냉동실에서 항생제 스톡을 제거하고 층류 캐비닛에서 해동하십시오.
- 중간 병을 층류 후드로 옮깁니다. 0.6mL의 세포탁심 원액(250mg/mL)과 0.25mL의 암피실린 원액(100mg/mL)을 중간 병에 넣고 잘 섞습니다. 약 7mL의 배지를 멸균 페트리 접시 (60mm x 15mm)에 붓습니다.
- 배지가 페트리 접시에서 약 15-20분 동안 굳도록 합니다. 밀봉 랩으로 페트리 접시를 닫고 보관 상자에 넣으십시오. 실온에서 보관하십시오.
- 배아 구조
- 시작하기 전에 층류 공기 흐름 캐비닛을 70 % 에틸 알코올로 청소하고 살균하십시오.
- 호박 열매를 주 포도나무에서 부수거나 잘라 수확하고 느슨한 먼지가 모두 제거될 때까지 실험실 싱크대에서 액체 세제(예: 0.3% 클로록시레놀)로 세척하여 과일 표면을 소독합니다(그림 5A).
- 충분한 수돗물로 헹굽니다. 깨끗한 종이 타월로 과일을 말리십시오. 과일을 층류 캐비닛으로 옮깁니다(그림 5B).
- 표면은 멸균 층류 공기 흐름 캐비닛의 과일에 70 % 에탄올을 뿌려 과일을 살균합니다. 멸균 칼 (그림 5C)로 과일을 이등분하고 씨앗을 추출하십시오.
- 멸균 겸자를 사용하여 종자 코트를 무균 적으로 열고 미성숙 배아를 노출시킵니다 (그림 6). 미성숙 배아를 세포탁심과 암피실린이 보충된 MS 배지가 들어 있는 페트리 접시에 조심스럽게 놓습니다(그림 7A). 페트리 접시를 닫고 포장 필름으로 밀봉하십시오.
참고: 배아의 크기에 따라 페트리 접시에 5개 또는 6개의 배아를 넣을 수 있습니다. - 배아와 함께 밀봉된 페트리 접시를 25°C 및 70% 상대 습도에서 16시간 광주기 하에 성장 챔버에 놓습니다. 오염이 발생하면 오염되지 않은 배아를 동일한 배지로 새 판에 즉시 계대 배양하십시오.
- 자엽은 4 일 후에 팽창하기 시작하고 10 일 후에 녹색으로 변합니다 (그림 7B). 이 시점에서 필요한 경우 조직 확장을 허용하기 위해 동일한 배지를 포함하는 새 플레이트로 계대 배양을 수행하십시오. 뿌리는 14 일에 나타나기 시작하고 (그림 7C), 21 일에 묘목은 확장 된 뿌리와 자엽을 갖게됩니다 (그림 7D).
참고: 프로토콜에 사용된 배양 배지는 보충 성장 조절제 없이 새싹과 뿌리로 분화하는 데 적합합니다. - 이 단계에서 페트리 접시에서 묘목을 제거하고 수돗물로 뿌리에서 미디어를 부드럽게 씻어냅니다 (그림 8). 묘목을 플라스틱 용기 (14cm x 9cm x 4cm)에 넣고 젖은 종이 타월로 뿌리를 덮습니다 (그림 9A). 용기를 덮고 필요에 따라 종이 타월을 다시 적십니다.
- 용기를 실온(25-28°C) 및 16시간 광주기로 보관하십시오. 이 단계는 묘목을 순응시킵니다. 용기에 7-10 일 동안 순응 한 후, 묘목의 길이는 약 3-4 개입니다. 이 기간 동안 필요에 따라 종이 타월을 다시 적시십시오.
- 묘목을 이전에 설명한대로 비료로 수정 된 50 개의 셀 시작 플랫 (너비 25cm x 길이 50cm)으로 옮기고 온실로 옮깁니다 (그림 9B). 썩지 않도록 묘목에 물을 너무 많이 주지 마십시오. 필요에 따라 셀당 약 10-20mL를 추가합니다.
- 두 번째에서 세 번째 진정한 잎 단계에서 묘목을 앞서 설명한대로 비료로 수정 된 화분 배지로 채워진 직경 30cm 화분에 이식합니다 (그림 10A). 덩굴 식물에 대한 격자 지지대를 제공하고 이전에 설명한 대로 식물이 개화하기 시작할 때 제어된 교잡화를 수행합니다(그림 10B).
- 자연 채광 체제에서 22-28 ° C 사이의 온도에서 온실의 식물을 유지하십시오. 과일과 종자 특성에 대해 식물을 평가하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
과일 세트 및 종자 생존력
다양한 교차 조합에서 과일 세트와 종자 생존력을 결정하기 위해 초기 테스트가 수행되었습니다. 총 15 개의 스쿼시 유전자형, 4 개의 C. pepo 및 11 개의 C. moschata가 선택되었습니다 (표 1). 시도된 24개의 종간 교차 조합 중 22개에 대해 과일 세트가 얻어졌으며(표 2), 과일 세트에서 전체 >92%의 성공을 나타냅니다. O와 M, E와 J를 교배하여 성숙한 과일을 얻지 못한 반면, F와 J를 교배하여 가장 많은 수의 과일 (n = 6)을 얻었습니다 (표 2). 다른 교차 조합에 대해 수분 된 꽃의 수는 1에서 11까지 다양했으며 수분 성공률은 0 %에서 100 % 사이였습니다. 서로 다른 교차 조합으로 수분되는 꽃의 수는 꽃 세트의 수와 남성과 여성의 꽃 사이의 개화 동기화에 따라 다양했습니다. 두 개를 제외한 모든 십자가에서 열매를 얻었지만 과일을 자른 후 평가한 결과 대부분의 과일이 생존 가능한 씨앗이 없는 배아를 유산한 것으로 나타났습니다. 대부분의 십자가에서 나온 열매는 정상으로 보였지만 씨앗이 없거나 초보적인 배아가있는 씨앗으로 구성되었습니다. 모든 교차 조합에서 총 44 개의 과일이 생산되었으며, C와 J를 교배하여 개발 된 하나의 과일 만이 배아 구조 기술을 통해 회복 될 수있는 배아가 잘 발달되지 않았습니다.
배아 구조 및 추가 발전
C와 J를 교배하여 개발 된F1 종간 잡종은 총 44 개의 종자를 가지고 있었지만 그 중 10 개만이 세대 진행을 위해 구조 될 수있는 배아를 가지고있었습니다. 나머지 씨앗에는 배아가 없었습니다. 10개의 배아 모두를 배아 구조 배지에서 배양하고 매일 성장과 발달을 확인했습니다. 10 개의 미성숙 배아의 크기는 3.51mm에서 8.26mm 사이였습니다. 배아 구조의 성공률은 80 %였습니다. C. moschata와 C. pepo (C 및 J)를 교차시켜 개발 된 F 1 종간 잡종 (브리지 라인)은 두 종의 게놈을 1 :1 (각각 50 %) 비율로 포함했다. 이 식물은 두 종에 걸쳐 경제적으로 중요한 형질의 침입을위한 다리 선으로 사용되었습니다. 예를 들어, C. moschata와 이러한 교량을 건너면 각각 75 % C. moschata 및 25 % C. pepo 유전 적 배경을 가진 잡종이 생성됩니다. 이 다리 라인에서 얻은 과일에는 생존 할 수없는 씨앗과 미성숙 배아가있는 씨앗이 혼합되어있어 재생을 위해 조직 배양이 필요했습니다. 예를 들어, 과일 중 하나에는 총 54 개의 씨앗이 있었으며 그 중 14 개의 씨앗에는 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 구출 된 미성숙 배아가있었습니다.
그림 1: 온실에서 수직으로 자라는 호박 식물을 위한 지지 격자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 열린 꽃과 테이프로 붙인 꽃의 그림. 온실에서 (A) 수컷과 (B) 암컷 호박 꽃을 엽니 다. (C) Cucurbita moschata 친부모의 테이프 수꽃. (D) 쿠커비타 페포 모성 부모의 테이프로 붙인 암꽃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 수분의 그림. (A) 암꽃의 오명에 꽃밥을 부드럽게 문질러 수꽃에서 꽃가루를 옮깁니다. (B) 수분 후 암꽃을 테이프로 붙이고 태그를 사용하여 수분 날짜와 십자가에 사용 된 부계 및 외부모를 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 과일 세트. (A) 수분 후 난소가 빠르게 확장되어 1 주일 이내에 작은 열매를 형성합니다. (B) 수분후 45 일에 과일을 수확 할 준비가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 과일 준비 . (A) 세제로 과일을 씻으십시오. 실험실 싱크대에서 액체 세제로 과일을 씻어 과일 표면을 수확하고 소독하십시오. (B) 과일을 헹구고 말립니다. 충분한 수돗물로 헹군 후 깨끗한 종이 타월로 과일을 말리고 층류 캐비닛으로 옮깁니다. (C) 멸균 칼로 과일을 이등분합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 씨앗에서 배아를 추출합니다. 멸균 집게를 사용하여 종자 코트를 무균 적으로 열고 미성숙 배아를 노출시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: MS 배지에서의 배아 재생. (A) 미성숙 배아를 MS 배지가 들어있는 페트리 접시에 조심스럽게 넣습니다. (B) 자엽은 10 일 이내에 확장되어 녹색이됩니다. (C) 뿌리는 14 일에 나타나기 시작합니다. (D) 21 일에 묘목은 순응을 위해 플라스틱 용기로 옮길 준비가 된 확장 된 뿌리와 자엽을 갖게됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 뿌리를 씻으십시오. 페트리 접시에서 묘목을 제거하고 수돗물로 뿌리에서 미디어를 부드럽게 씻어냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 묘목을 순응시킵니다. (A) 묘목을 플라스틱 용기에 넣고 뿌리를 젖은 종이 타월로 5 일 동안 덮어 순응시킵니다. (B) 완전한 NPK 비료로 수정 된 상업용 화분 믹스가 들어있는 세포 트레이에 묘목을 옮깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 묘목을 화분에 이식하십시오. (A) 두 번째에서 세 번째 진정한 잎 단계에서 묘목을 비료로 수정 된 화분 매체로 채워진 직경 30cm 화분에 이식합니다. (B) 덩굴 식물에 격자 지지대를 제공하고 식물이 개화하기 시작할 때 제어된 교잡화를 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 랩 코드 | 종 | 근원 |
| A | C. 모샤타 | 지역 농민 시장 |
| B | C. 모샤타 | 지역 농민 시장 |
| C | C. 모샤타 | 지역 농민 시장 |
| D | C. 모샤타 | 지역 농민 시장 |
| E | C. 모샤타 | 지역 농민 시장 |
| F | C. 모샤타 | 지역 농민 시장 |
| G | C. 모샤타 | 플로리다 대학교 번식 라인 |
| H | C. 모샤타 | 플로리다 대학교 번식 라인 |
| 나는 | C. 페포 | NCRPIS (노스 센트럴 지역 플랜트 인트루 덕트 스테이션) |
| J | C. 페포 | NCRPIS (노스 센트럴 지역 플랜트 인트루 덕트 스테이션) |
| M | C. 페포 | NCRPIS (노스 센트럴 지역 플랜트 인트루 덕트 스테이션) |
| O | C. 모샤타 | 플로리다 대학교 번식 라인 |
| Q | C. 모샤타 | 플로리다 대학교 번식 라인 |
| W | C. 페포 | 플로리다 대학교 번식 라인 |
| Y | C. 모샤타 | 버피 씨앗 공동 |
표 1: 스쿼시의 총 15 개의 유전자형, 4 개의 C. pepo 및 11 개의 C. moschata가 종간 교배에 대한 연구에 사용되었습니다.
| 크로스 (여성 x 남성) | N. 수분 된 꽃의 | N. 과일 수 | 과일 세트 (%) | N. 중단 된 종자 | N. 미성숙 배아 | N. 구조 된 배아 | ||
| A (C. 모샤타) x I (C. 페포) | 5 | 4 | 80 | 0 | 0 | 0 | ||
| H (C. 모샤타) x I (C. 페포) | 2 | 2 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| B (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| C (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 3 | 1 | 33.3 | 44 | 10 | 8 | ||
| E (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 11 | 6 | 54.5 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 2 | 2 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| J (C. 페포) x H (C. 모샤타) | 7 | 2 | 28.6 | 0 | 0 | 0 | ||
| J (C. 페포) x O (C. 모샤타) | 6 | 1 | 16.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 6 | 1 | 16.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| Q (C. 모샤타) x J (C. 페포) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| C (C. 모샤타) x M (C. 페포) | 4 | 3 | 75 | 0 | 0 | 0 | ||
| D (C. 모샤타) x M (C. 페포) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. 모샤타) x M (C. 페포) | 9 | 5 | 55.6 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. 모샤타) x M (C. 페포) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. 모샤타) x M (C. 페포) | 22 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Q (C. 모샤타) x M (C. 페포) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. 모샤타) x W (C. 페포) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. 모샤타) x W (C. 페포) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| H (C. 모샤타) x W (C. 페포) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. 모샤타) x W (C. 페포) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Y (C. 모샤타) x W (C. 페포) | 3 | 2 | 66.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| M (C. 페포) x H (C. 모샤타) | 3 | 2 | 66.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| M (C. 페포) x O (C. 모샤타) | 4 | 4 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| 합계 | 44 | 10 | 8 | |||||
표 2: 15가지 호박 유전자형과 해당 과일 세트, 낙태된 종자의 수, 미성숙 배아 및 성공적인 배아 구조로 교차 조합을 시도했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. moschata와 C. pepo 사이의 성공적인 종간 교잡을위한 두 가지 주요 병목 현상이 있습니다 : 하이브리드 배아를 생산하기위한 유전자형 반응성에 의해 결정되는 교차 호환성 장벽과 정상 종자에 대한 하이브리드 배아의 발달을 방해하는 수정 후 장벽. 스쿼시에 대해 이전에보고 된 바와 같이, 현재 연구의 교차 호환성 테스트는 대부분의 과일이 parthenocarpically 발달했으며 대부분의 씨앗은 생존 할 수 없다는 것을 보여주었습니다16. 부모의 유전자형은 C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교잡의 호환성에 상당한 영향을 미친다. 현재 연구에서 테스트 된 24 개의 교차 조합 중 하나만 (C 및 J) 배아 구조를 위해 미성숙 배아를 산출했습니다. 따라서이 연구는 개발 된 프로토콜의 효율성을 테스트하기위한 생물학적 복제물의 부족으로 인해 제한되었습니다. 그러나, C 및 J 크로스로부터 구출된 10개의 미성숙 배아에 대해 80%의 재생 효율이 얻어졌다. 이전 연구에서는 C. pepo 및 C. moschata 교배에 대한 배아 구조에서 재생 성공률이 낮다고 보고하여 새로운 프로토콜14,15의 효과를 입증했습니다. 예를 들어, De Oliveira et al. 26 개의 배아 중 C. pepo cv. 아스 마라와 C. 모샤타 cv. 피라모이타, 재생제는 얻지 못했습니다. 그러나 저자들은 다른 유전자형 조합 (C. pepo cv. Asmara 및 C. moschata cv. Duda)을 사용했을 때 16 %의 재생 성공을보고했습니다14. 서로 다른 Cucurbita 종 간의 종간 교잡에 대한 또 다른 연구에서 Rakha et al. C. ficifolia x C. pepo 및 C. martinezii x C. pepo를 각각 교배하여 얻은 미성숙 배아에서 40 % 및 15 %의 재생 효율을보고했습니다15. 현재 연구는 배아 구조 15,29,30을 위해 복잡한 배지를 사용하는 이전에 확립된 프로토콜과 비교하여 보충 성장 조절제가 없는 MS 배지를 사용했습니다. 또한, 항생제 세포탁심과 암피실린의 첨가는 미생물 오염을 예방하는 데 충분했습니다. 따라서이 배지는 저렴하고 숙련 된 인력없이 준비하기 쉽고 자원이 제한된 소규모 육종 프로그램에 채택 될 수 있다는 장점이 있습니다.
현재 연구에서 과일은 배아 성숙과 재생을 최대화하기 위해 수분 후 45-55 일 (DPP)에 수확되었습니다. 현재 연구를 위해 선택된 DPP는 배아에 대한 에너지 매장량(대부분 지질 및 단백질)의 최적 축적이 60 DPP31,32에서 발생했음을 보여주는 이전 보고서를 기반으로 했습니다. Muskmelon에서 Nunez-Palenius et al. 배아 구조의 성공과 DPP30 사이에 긍정적 인 상관 관계를보고했습니다.
현재의 연구에서, 종간 F1 잡종을 C. moschata 와 교배시킴으로써 개발 된 2 세대 과일은 정상적인 종자를 산출하지 못했다. 이 관찰은 이전에 보고된 바와 같이 한 세대에서 C. moschata와 C . pepo 사이의 출산력 장벽을 극복하기가 어렵다는 것을 나타냅니다.16. 그러나 현재 프로토콜의 채택은 육종 프로그램에서 Cucurbita 종간 잡종의 성공적인 개발에 도움이 될 것입니다. 육종가에 대한 생식질 접근성을 확대하기 위해 더 넓은 유전자형의 교차 호환성을 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 USDA 국립 식량 농업 연구소, NRS 프로젝트 번호의 지원을 받았습니다. FLA-TRC-006176 및 플로리다 대학교 식품 및 농업 과학 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. Cucurbits. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S.
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S.
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K.
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , Humana Press. 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).
- Vining, K. J. Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).
