Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

فحص نقل الخلايا البطانية كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الشبكي الداخلي

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

يوضح هذا البروتوكول مقايسة عبر الخلايا البطانية في المختبر كنموذج لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الداخلي للشبكية عن طريق قياس قدرة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية على نقل بيروكسيديز الفجل عبر الخلايا في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة الكهف.

Abstract

يساهم خلل الحاجز الدموي الشبكي (BRB) في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى وذمة شبكية العين وفقدان البصر اللاحق. يتكون الحاجز الدموي الداخلي للشبكية (iBRB) بشكل أساسي من بطانة وعائية شبكية العين ذات نفاذية منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية. يتم تنظيم هذه الميزة من النفاذية المنخفضة بإحكام والحفاظ عليها من خلال معدلات منخفضة من النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المجاورة للشبكية ، وكذلك النقل عبر الخلايا (transcytosis) من خلالها. قد يوفر تقييم نفاذية الحاجز عبر الخلوي في الشبكية رؤى أساسية حول سلامة iBRB في الصحة والمرض. في هذه الدراسة ، نصف فحص الخلايا البطانية (EC) ، كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية iBRB ، باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية (HRMECs). يقيم هذا الفحص قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين وبيروكسيديز الفجل (HRP) في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة المستقبلات والكهف ، على التوالي. تم احتضان مركبات HRMECs المتقاربة بالكامل المستزرعة على غشاء مسامي مع ترانسفيرين موسوم بالفلورسنت (transcytosis المعتمد على clathrin) أو HRP (transcytosis بوساطة الكهف) لقياس مستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية ، مما يدل على مستويات transcytosis عبر الطبقة الأحادية EC. تم تعديل إشارات Wnt ، وهي مسار معروف ينظم iBRB ، لإظهار طريقة فحص transcytosis القائمة على HRP بوساطة الكهف. قد يوفر فحص EC transcytosis الموصوف هنا أداة مفيدة للتحقيق في المنظمين الجزيئيين لنفاذية EC وسلامة iBRB في أمراض الأوعية الدموية ولفحص أنظمة توصيل الأدوية.

Introduction

شبكية العين البشرية هي واحدة من أعلى الأنسجة التي تتطلب الطاقة في الجسم. يتطلب الأداء السليم للشبكية العصبية إمدادات فعالة من الأكسجين والمواد المغذية إلى جانب تدفق مقيد من الجزيئات الأخرى التي يحتمل أن تكون ضارة لحماية بيئة الشبكية ، والتي يتم توسطها عبر حاجز الدم والشبكية (BRB)1. على غرار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) في الجهاز العصبي المركزي ، يعمل BRB كحاجز انتقائي في العين ، حيث ينظم حركة الأيونات والماء والأحماض الأمينية والسكر داخل وخارج شبكية العين. يحافظ BRB أيضا على توازن الشبكية وامتيازه المناعي من خلال منع التعرض لعوامل الدورة الدموية مثل الخلايا المناعية والأجسام المضادة ومسببات الأمراض الضارة2. يساهم خلل BRB في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مثل اعتلال الشبكية السكري ، والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، واعتلال الشبكية الخداجي (ROP) ، وانسداد الوريد الشبكي ، والتهاب القزحية ، مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ وفقدان البصر اللاحق3،4،5.

يتكون BRB من حاجزين منفصلين لشبكتين وعائيتين عينيتين متميزتين ، على التوالي: الأوعية الدموية الشبكية و choriocapillaris المعششة تحت شبكية العين. يتكون BRB الداخلي (iBRB) في المقام الأول من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الشبكية (RMECs) التي تبطن الأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية ، والتي تغذي الطبقات العصبية الداخلية للشبكية. من ناحية أخرى ، تشكل ظهارة صبغة الشبكية المكون الرئيسي ل BRB الخارجي ، والذي يقع بين شبكية العين الحسية العصبية و choriocapillaris2. بالنسبة ل iBRB ، يحدث النقل الجزيئي عبر RMECs من خلال كل من الطرق شبه الخلوية وعبر الخلوية (الشكل 1). تعتمد الدرجة العالية من انتقائية المواد عبر iBRB على (i) وجود مجمعات البروتين الموصلة التي تقيد النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية المجاورة (ECs) ، و (ii) مستويات التعبير المنخفضة لوسطاء الكهف والناقلات والمستقبلات داخل الخلايا البطانية التي تحافظ على معدلات منخفضة من النقل عبر الخلايا1،6،7،8 . تتكون مجمعات الوصلات التي تنظم التدفق شبه الخلوي من تقاطعات ضيقة (كلودين ، أوكلودين) ، تلتصق بالتقاطعات (كادهيرين VE) ، وتقاطعات الفجوة (connexins) ، مما يسمح بمرور الماء والمركبات الصغيرة القابلة للذوبان في الماء. في حين تنتشر الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بشكل سلبي عبر المناطق الداخلية من RMECs ، يتم تنظيم حركة الجزيئات الأكبر محبة للدهون والمحبة للماء من خلال مسارات عبر البطانية مدفوعة ب ATP بما في ذلك النقل الحويصلي وناقلات الغشاء 5,9.

يمكن تصنيف الترانسسيتوسيس الحويصلي على أنه ترانسكيتوسيس كهفي بوساطة الكافولين، وترانسكتوري كنزية كليبرات العين المعتمد على الكلاثرين (وبوساطة المستقبلات)، وندرة الخلايا الكبيرة المستقلة عن الكلاثرين (الشكل 2). تتضمن عمليات النقل الحويصلي هذه حويصلات مختلفة الحجم ، حيث تكون الماكروبينوسومات هي الأكبر (تتراوح من 200-500 نانومتر) وتكون الكهف هي الأصغر (بمتوسط 50-100 نانومتر) ، في حين تتراوح الحويصلات المغلفة بالكلاثرين من 70-150 نانومتر10. Caveolae هي غزوات غشاء بلازما غنية بالدهون على شكل قارورة مع معطف بروتين ، يتكون في المقام الأول من caveolin-1 الذي يربط الكوليسترول الغشائي الدهني والبروتينات الهيكلية والإشارات الأخرى عبر مجال سقالات الكهف11. تعمل الكافيولين جنبا إلى جنب مع الكافين المتصل محيطيا لتعزيز استقرار الكهف في غشاء البلازما12. قد تحمل الأغشية الكهفية أيضا مستقبلات لجزيئات أخرى مثل الأنسولين والألبومين والبروتينات الدهنية المتداولة بما في ذلك البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) للمساعدة في حركتها عبر الخلايا البطانية13. أثناء التطوير ، يعتمد تكوين BRB الوظيفي على قمع EC transcytosis8. وبالتالي ، فإن بطانة الشبكية الناضجة تحتوي على مستويات منخفضة نسبيا من مستقبلات الكافولا والكافولين-1 والألبومين فيما يتعلق بالخلايا البطانية الأخرى في ظل الظروف الفسيولوجية ، مما يساهم في خصائصها الحاجزة 4,9.

نظرا لأن انهيار iBRB هو السمة المميزة الرئيسية للعديد من حالات العين المرضية ، فمن الضروري تطوير طرق لتقييم نفاذية الأوعية الدموية في شبكية العين في الجسم الحي وفي المختبر. تساعد هذه الأساليب على توفير رؤى محتملة حول آليات سلامة BRB المعرضة للخطر وتقييم فعالية الأهداف العلاجية المحتملة. عادة ما تستخدم فحوصات التصوير الحالية في الجسم الحي أو فحوصات تسرب الأوعية الدموية الكمية الفلورسنت (فلوريسين الصوديوم والدكستان) ، أو قياس الألوان (صبغة إيفانز الزرقاء وركيزة بيروكسيديز الفجل [HRP]) ، أو المقتفيات الإشعاعية14 للكشف عن الإسراف من الأوعية الدموية إلى أنسجة الشبكية المحيطة باستخدام التصوير المجهري أو في محللات الأنسجة المعزولة. يجب أن يكون المقتفي المثالي لقياس سلامة الأوعية الدموية خاملا وكبيرا بما يكفي لتخلل الأوعية المعرضة للخطر بحرية أثناء حبسه داخل الشعيرات الدموية السليمة والسليمة. تستخدم الطرق التي تستخدم فلوريسين الصوديوم أو الفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران المقترن (FITC-dextran) في تصوير الأوعية الدموية الحية للقاع (FFA) أو حوامل الشبكية المسطحة المعزولة على نطاق واسع لقياس إسراف الشبكية في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يتميز FITC-dextran بأنه متاح في أوزان جزيئية مختلفة تتراوح من 4-70 kDa للدراسات الانتقائية للحجم15،16،17. FITC-albumin (~ 68 kDa) هو متتبع بروتين بديل كبير الحجم ذو صلة بيولوجية بدراسات تسرب الأوعية الدموية18. تعتمد صبغة إيفانز بلو ، التي يتم حقنها داخل القلب19 ، أو في المدار الرجعي ، أو من خلال الوريد الذيل 20 ، أيضا على ارتباطها بالألبومين الداخلي المنشأ لتشكيل جزيء كبير يمكن تحديده كميا عن طريق الكشف عن الطيف الضوئي في الغالب أو ، بشكل أقل شيوعا ، المجهر الفلوري في حوامل مسطحة20،21. ومع ذلك، فإن منهجيات التصوير الكمي أو الضوئي هذه غالبا ما لا تميز النقل شبه الخلوي عن النقل عبر البطانة. بالنسبة للتحليل المحدد لانتقال الخلايا مع التصور فوق الهيكلي للحويصلات المتحولة عبر الخلايا ، تستخدم جزيئات التتبع مثل HRP عادة لتحديد موقع الحويصلات المتحولة داخل الخلايا البطانية التي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني 22،23،24 (الشكل 3A-C).

يمكن أن يوفر تطوير واستخدام نماذج iBRB في المختبر لتقييم نفاذية الخلايا البطانية تقييما قويا وعالي الإنتاجية لاستكمال التجارب في الجسم الحي والمساعدة في التحقيق في المنظمين الجزيئيين لتسرب الأوعية الدموية. تشمل المقايسات الشائعة الاستخدام لتقييم النقل شبه الخلوي وسلامة التقاطعات الضيقة المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، وهو مقياس للتوصيل الأيوني (الشكل 4) 2,25 ، واختبار تسرب الأوعية الدموية في المختبر باستخدام مقتفيات الفلورسنت الصغيرة ذات الوزن الجزيئي26. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام اختبارات transcytosis القائمة على الترانسفيرين نمذجة BBB لاستكشاف transcytosis المعتمد على clathrin27. على الرغم من ذلك ، فإن الفحوصات لتقييم BRB ، وبشكل أكثر تحديدا ، transcytosis الكهفية EC شبكية العين في المختبر محدودة.

في هذه الدراسة ، نصف فحص EC transcytosis باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMECs) كنموذج في المختبر لتحديد نفاذية iBRB و EC transcytosis. يعتمد هذا الفحص على قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين أو HRP عبر مسارات transcytosis التي تتوسط فيها المستقبلات أو المعتمدة على الكهف ، على التوالي (الشكل 2). تم احتضان HRMECs المستزرعة إلى الالتقاء الكامل في الغرفة القمية (أي إدراج المرشح) مع الترانسفيرين المترافق مع الفلورسنت (Cy3-Tf) أو HRP لقياس شدة التألق المقابلة لمستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية من خلال EC transcytosis فقط. يمكن تأكيد التقاء الطبقة الأحادية للخلية عن طريق قياس TEER ، مما يشير إلى سلامة التقاطع الضيق25. لإثبات تقنية اختبار TEER و transcytosis ، تم استخدام المعدلات الجزيئية المعروفة لنفاذية الأوعية الدموية و transcytosis EC ، بما في ذلك عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)28 وتلك الموجودة في إشارات Wnt (روابط Wnt: Wnt3a و Norrin)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال لتوليد المجهر الضوئي وصور EM (الشكل 3). يمكن الحصول على بروتوكولات للدراسات في الجسم الحي من Wang et al.24. تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية (HRMECs) من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) في مستشفى بوسطن للأطفال.

1. إعداد الكواشف

  1. حل لطلاء طبق زراعة الأنسجة: تحضير محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ عن طريق إذابة 1 مل من محلول مخزون الجيلاتين (40٪ -50٪) في 500 مل من زراعة الأنسجة المعقمة الصف 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4). تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يخزن محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ على درجة حرارة 2-8 درجة مئوية. يمكن تخزينه في درجة الحرارة المذكورة لفترة غير محددة في حالة معقمة.
  2. متوسط النمو: تحضير 500 مل من الوسط الكامل لنمو الخلايا البطانية (EGM) عن طريق إذابة مكملات EGM في الوسط القاعدي لنمو الخلايا البطانية (EBM) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). أليكوت متوسط النمو في أنابيب 50 مل وتخزين الأنابيب في 4 درجة مئوية. العمر الافتراضي لوسط النمو هو 12 شهرا عند 4 درجات مئوية.
  3. محلول التربسين: بالنسبة لمحلول التريبسين-EDTA بنسبة 0.25٪ ، قم بنقل aliquot من قارورة المخزون إلى أنابيب 50 مل وتخزينها عند 4 درجات مئوية (حتى أسبوعين) أو -20 درجة مئوية (حتى 24 شهرا).

2. زراعة الموارد البشرية

  1. زراعة الخلايا الأولية
    1. قم بتغطية أطباق بتري (قطرها 100 مم × ارتفاعها 20 مم) مع 5 مل من محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ تحت غطاء محرك السيارة الرقائقي واحتفظ بها دون إزعاج في الغطاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لطلاء موحد.
      ملاحظة: طلاء الجيلاتين للأطباق يعزز ارتباط الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام قوارير ثقافة T75 المطلية بالجيلاتين.
    2. قبل بذر الخلايا ، قم بشفط محلول الجيلاتين باستخدام مضخة تفريغ. كان ضغط الفراغ للشفاط المستخدم يصل إلى 724 مم زئبق.
      ملاحظة: يجب أن يتم الشفط مباشرة قبل بذر الخلايا لمنع الجفاف من محلول الطلاء.
    3. قم بإذابة قارورة مجمدة من HRMECs (من التخزين في النيتروجين السائل) إما باستخدام حمام مائي عند 37 درجة مئوية أو عن طريق إضافة وسط نمو دافئ إلى القارورة. بمجرد إذابته ، انقل تعليق الخلية إلى 9 مل من وسط النمو (على افتراض أن القارورة المذابة من HRMECs هي 1 مل).
      ملاحظة: تم الحصول على مراكز إدارة الموارد البشرية تجاريا (جدول المواد). يجب دائما تسخين وسط النمو المضاف إلى الخلايا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    4. قم بتدوير الخلايا عند 200 × g لمدة 5 دقائق في RT وقم بشفط السوبرناتانت بعناية لتجنب إزالة حبيبات الخلية.
    5. أعد تعليق حبيبة الخلية في 10 مل من وسط النمو وانقل التعليق الناتج إلى طبق بتري مغطى بالجيلاتين. حافظ على الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. عادة ما تكون HRMECs ملتقية بنسبة 70٪ -80٪ بعد 72 ساعة.
      ملاحظة: يتم تغيير وسيط النمو كل يومين.
  2. الزراعة الفرعية ل HRMECs على إدخالات غشاء نفاذية
    1. قم بإعداد إدخالات مرشح زراعة الخلايا (إدراج 6.5 مم مع غشاء بولي كربونات بحجم 0.4 ميكرومتر بحجم المسام ، يوضع في صفيحة من 24 بئرا) لبذر HRMECs عن طريق طلاء كل إدراج (غرفة قمي) ب 200 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ لمدة 30 دقيقة تحت غطاء تدفق صفائحي. تأكد من أن المحلول يغطي السطح السفلي بالكامل لإدراج الفلتر.
      ملاحظة: يحتوي كل بئر على غرفة قمية وبازوجانبية مفصولة بغشاء مسامي.
    2. أخرج طبق بتري مع HRMECs المستزرعة (الخطوة 2.1.5) من الحاضنة واستطلع وسائط النمو. شطف بلطف الخلايا 2x مع 10 مل من 1x PBS تحت غطاء تدفق الصفيحة للتخلص من الخلايا العائمة / الميتة المحتملة.
    3. افصل الخلايا بمحلول 0.5-1 مل من محلول التريبسين-EDTA بنسبة 0.25٪ وضع طبق بتري في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإخماد نشاط التربسين عن طريق إضافة 4.5-9 مل من وسائط النمو ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 10 مل.
    5. قم بتدوير الخلايا عند 200 × g لمدة 5 دقائق في RT ، وقم بإزالة supernatant بعناية ، وأعد تعليق الكريات في 3 مل من وسائط النمو.
    6. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس خلايا الدم اليدوي أو عداد الخلايا الآلي والبذور بكثافة 4 × 104 خلايا لكل إدراج مرشح (أي 1.25 × 105 خلايا / سم2). حجم تعليق الخلية لكل إدراج هو 250 ميكرولتر.
    7. شفط محلول الطلاء من الآبار التي تحتوي على إدخالات نفاذة ونقل 250 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل إدراج (الغرفة القمي). أضف وسيطا فقط (أي بدون خلايا) إلى إحدى الإدخالات ، والتي سيتم استخدامها ك "عنصر تحكم فارغ" لقياس TER. في الوقت نفسه ، أضف أيضا 750 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ، في الغرف القاعدية.
    8. احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا مع إدخالات نفاذة في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 7-12 يوما حتى تصبح الخلايا المستزرعة ملتقية تماما ويتم تحقيق قيمة TEER المطلوبة من ~ 20 Ω · سم2.
    9. تغيير وسط النمو كل يومين. أثناء تغيير الوسائط ، قم بشفط الوسائط بعناية لتقليل اضطراب الطبقة الأحادية للخلية وإضافة 250 ميكرولتر و 750 ميكرولتر من الوسائط الجديدة لكل بئر إلى الغرف القمية والقاعدية ، على التوالي.
      ملاحظة: يتم تغيير وسط النمو لكل من الغرف القمية والقاعدية في الآبار.

3. قياسات TEER (الشكل 4)

  1. في اليوم 14 بعد بذر الخلايا (الخطوة 2.2.9) ، قم بقياس TEER ل HRMECs باستخدام نظام المقاومة الكهربائية (ER) الظهاري فولت أوم متر (EVOM) (جدول المواد) على النحو التالي.
  2. اشحن نظام التقارير الإلكترونية مسبقا وتحقق من وظيفة العداد باستخدام قطب الاختبار STX04. معايرة، إذا لزم الأمر.
  3. قم بتوصيل القطب بالعداد وقم بموازنة القطب عن طريق نقعه أولا في 70٪ من الإيثانول لمدة 15-20 دقيقة ثم غمره لفترة وجيزة في وسط نمو EGM لزراعة الخلايا.
  4. في غضون ذلك ، احتفظ بلوحة 24 بئرا المحتوية على الخلية في غطاء التدفق الرقائقي في RT لمدة 15-20 دقيقة لتحقيق توازن درجة الحرارة.
    ملاحظة: تتأثر قياسات TEER بدرجة الحرارة ، لذا فإن خطوة التوازن ضرورية.
  5. لقياس TEER ، أضف وسط نمو جديد إلى كل من الغرف القمية (250 ميكرولتر) والقاعدية (750 ميكرولتر) للآبار.
  6. قم بإجراء قياس TEER عن طريق غمر القطب بعناية بحيث يكون الطرف الأقصر في الإدراج ويلامس الطرف الأطول قاع البئر. قم بقياس المقاومة عبر عنصر التحكم الفارغ أولا. لكل إدراج، قم بقياس TEER في ثلاثة أجزاء.
    ملاحظة: لشطف القطب الكهربائي بين القياسات، يتم استخدام وسائط الاستزراع. تأكد من تثبيت القطب الكهربائي بزاوية 90 درجة في الجزء السفلي من الإدراج للحصول على قراءات مستقرة.
  7. حساب المقاومة الكهربائية (Ω · سم 2) عبر الطبقة الأحادية باستخدام الصيغة ، TEER = صافي المقاومة (Ω) × مساحة سطح إدراج المرشح (سم2) ؛ هنا ، المقاومة الصافية هي الفرق بين مقاومة كل بئر (وسط نمو مع خلايا) والبئر الفارغ (وسط نمو فقط).
  8. قم بإجراء مزيد من المعالجة للخلايا فقط بعد أن تصل قيمة TEER إلى ~ 20 Ω · سم2. إذا لم يتم الوصول إلى مستوى TEER المطلوب ، فاحتفظ باللوحة في الحاضنة وقم بقياس TEER في اليوم التالي.
    ملاحظة: يمكن أيضا التحقق من صحة التقاء HRMEC عن طريق الفحص المورفولوجي لشكل الخلية (تحت المجهر) مع مورفولوجيا الحصى النموذجية و / أو عن طريق وجود بروتينات تقاطع الخلية مع تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية بشكل منفصل.

4. فحص ترانسكيتوسيس

  1. فحص ترانسكتوري عبر الخلايا بوساطة كلاثرين في المختبر باستخدام ترانسفيرين موسومة ب Cy3 (الشكل 5)
    1. عند الوصول إلى الالتقاء مع قيم TEER حوالي 20 Ω · سم 2 ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 باستخدام 0.5٪ FBS في EBM (وسط مختزل بالمصل) في كلا الغرفتين (الغرفة القمي: 250 ميكرولتر والغرفة القاعدية: 750 ميكرولتر) قبل العلاج بالرباط. تم استخدام EBM المخفض في المصل طوال فترة الفحص.
    2. احتضن الخلايا (باستخدام الوسط المختزل بالمصل في الخطوة 4.1.1.) في الغرفة القمية باستخدام ليغاند ترانسفيرين الموسومة بالفلورسنت (السيانين 3) (Cy3-Tf) (التركيز النهائي ل 40 ميكروغرام / مل) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب حماية الألواح التي تحتوي على Cy3-Tf من الضوء لتجنب التبييض الضوئي ل Cy3-Tf عن طريق لفها برقائق الألومنيوم وإجراء التجربة في غطاء محرك السيارة المزروع للخلايا مع إطفاء الأنوار.
    3. بعد 1 ساعة ، ضع الطبق على الثلج واغسل الطبقة الأحادية بشكل حسي وعرضي 4x (3-5 دقائق لكل غسلة) مع الوسط المخفض للمصل في RT لإزالة Cy3-TF المجاني غير المقيد.
      ملاحظة: الغسيل ضروري لإزالة جزيئات التتبع الحرة والسماح بقراءة دقيقة لانتقال الخلايا دون تسرب محتمل من الطريق شبه الخلوي.
    4. أضف وسيطا طازجا مخفضا للأمصال (كما هو الحال في الخطوة 4.1.1) إلى إدخالات المرشح المغسولة جيدا التي تحتوي على خلايا وانقل الإدخالات إلى آبار جديدة في الصفيحة المكونة من 24 بئرا تحتوي على وسط مخفض للمصل تم تسخينه مسبقا.
    5. احتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة أخرى في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) ، ثم اجمع الوسط من الغرفة القاعدية.
    6. سجل شدة التألق للمحلول من الغرفة القاعدية باستخدام كاشف التألق. تشير مستويات كثافة التألق ، التي تقاس كوحدات فلورسنت نسبية (RFU) ، إلى كمية مركب Cy3-Tf المتحولة عبر الطبقة الأحادية HRMEC عبر ترانسكسيتوسيس المعتمد على كلاثرين.
  2. فحص كثرة الخلايا بوساطة الكهف في المختبر باستخدام HRP (الشكل 6)
    1. عند الوصول إلى الالتقاء الكامل مع قيم TEER حول 20 Ω · سم 2 ، يحرم المصل الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 باستخدام 0.5٪ من وسط EBM المحتوي على FBS (وسط منخفض المصل) قبل العلاج (كما هو الحال في الخطوة 4.1.1). تم استخدام وسيط EBM المخفض في المصل طوال الفحص بأكمله.
    2. عالج الخلايا في الغرفة القمية بالعلاجات المطلوبة وضوابط السيارة.
      ملاحظة: هنا ، استخدمنا معدلات Wnt كمثال لإثبات تنظيم transcytosis بوساطة caveolae بواسطة مسار إشارات Wnt في HRMECs: Norrin المؤتلف البشري ومثبط Wnt XAV939. في تجربة نموذجية ، تمت معالجة الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) مع التركيزات التالية: Norrin (125 ng/mL) ، Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) ، ومحلول التحكم في المركبات. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الوسط المشروط Wnt3a (المنتج من خلايا L Wnt-3A).
    3. احتضن الخلايا في الغرفة القمية باستخدام HRP (5 مجم / مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. بعد ذلك ، ضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا على الجليد واغسل الغرف القمية والقاعدية بشكل مكثف 6x باستخدام المخزن المؤقت P (10 mM HEPES pH = 7.4 ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 10 mM glucose ، 3 mM CaCl2 ، 145 mM NaCl) من أجل إزالة HRP الحر خارج الخلية.
      ملاحظة: الغسيل ضروري لإزالة جزيئات التتبع الحرة والسماح بقراءة دقيقة لانتقال الخلايا دون تسرب محتمل من الطريق شبه الخلوي.
    5. أضف وسيطا جديدا مخفضا للأمصال (كما هو الحال في الخطوة 4.1.1) إلى الغرفة القمية وانقل الإدخالات إلى بئر طازجة تحتوي على وسائط تم تسخينها مسبقا.
    6. احتضن الطبقة الأحادية لمدة 90 دقيقة إضافية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل جمع الوسط من الغرفة القاعدية.
    7. إلى الوسط الذي تم جمعه ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة البيروكسيديز الفلوروجينية HRP (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واحتضنها في RT لمدة 10 دقائق قبل إيقاف التفاعل باستخدام 100 ميكرولتر من محلول Stop.
    8. اكتشف مستويات منتج تفاعل الركيزة HRP في الوسائط باستخدام قارئ لوحة التألق. قياس شدة التألق عند الطول الموجي للانبعاث 420 نانومتر (مع إثارة 325 نانومتر) وكوحدات فلورسنت نسبية (RFU). تشير القيم إلى مستوى HRP transcytossed عبر طبقة HRMEC من خلال ترانسكيتوسيس بوساطة الكهف.
      ملاحظة: منتج الفلورسنت المستخدم هنا (جدول المواد) لا يبيض ضوئيا. ليست هناك حاجة إلى حماية الضوء ضد التبييض الضوئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر صور EM للبطانة الوعائية الشبكية النقل الحويصلي عبر الخلوي والحويصلات الكهفية في الخلايا البطانية في الجسم الحي.
يمكن تصور ترانسسيتوسيس EC في الجسم الحي داخل المقاطع العرضية للشبكية مع راسب بني داكن يعكس الأوعية الدموية المحتوية على HRP تحت المجهر الضوئي (الشكل 3A) وكراسب كثيف الإلكترون يدل على الحويصلات العابرة للخلايا المحتوية على HRP (الشكل 3B ، C) باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، مما يدل على انتقال الخلايا EC عبر iBRB. من المحتمل أن تعكس الحويصلات الكبيرة ندرة الخلايا الكبيرة (رأس السهم الأبيض; الشكل 3B)، ومن المحتمل أن تمثل الحويصلات الصغيرة الحويصلات الكهفية (رؤوس الأسهم البيضاء; الشكل 3 جيم). علاوة على ذلك ، يمكن رؤية توطين الكهف في الأوعية الدموية في شبكية العين على أنه تلطيخ مشترك للجسم المضاد CAV-1 لعلامة الكهف مع الإيزوليكتين (علامة EC) في الأوعية الدموية تحت المجهر الفلوري (الشكل 3D). تم تحديد الحويصلات الكهفية الإيجابية CAV-1 تحت TEM بواسطة الأجسام المضادة CAV-1 التي تحمل علامة CAV-1 المناعية (النقاط السوداء; الشكل 3 هاء) داخل الخلايا البطانية الوعائية الشبكية. يمكن الحصول على بروتوكولات للدراسات في الجسم الحي من Wang et al.24.

يزيد علاج VEGF من نفاذية الأوعية الدموية في HRMECs كما تم قياسها بواسطة المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER)
قبل إجراء فحوصات EC transcytosis ، يجب استزراع HRMECs إلى التقاء الكامل ، مما يدل على مورفولوجيا الحصى المميزة ، والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الضوئي. يمكن التحقق من التقاء الخلايا الكامل عن طريق قياس المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) (الشكل 4A) ، مع قراءات تصل إلى ~ 20 Ω · سم2 ل HRMECs30 المتقاربة ، مما يوحي بمستويات منخفضة من النقل شبه الخلوي عبر الطبقة الأحادية من خلال تقاطعات ضيقة أو فجوة. تم استخدام عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) كمثال لإثبات قياس TER. وأدت معالجة هذه المراكز باستخدام VEGF إلى انخفاض كبير في مستويات TEER، مما يعكس زيادة نفاذية HRMEC (الشكل 4B). كما لوحظ انخفاض في قيم TEER في الخلايا الضابطة ، وربما يرجع ذلك إلى مدة الزرع والقياسات المتعددة المأخوذة على فترات زمنية مختلفة والتي قد تكون ضارة بالخلايا31.

يمكن استخدام نقل Cy3-transferrin لتقييم ترانسكيتوسيس EC بوساطة الكلاثرين في HRMECs
بالنسبة لترانسكسيتوسيس EC بوساطة الكلاثرين ، تم احتضان HRMECs المتقاربة المستزرعة على غشاء مسامي مع ترانسفيرين موسوم بالفلورسنت (Cy3) للكشف عن انتقاله عبر ECs (الشكل 5A). يستغل هذا الفحص حقيقة أن نقل الترانسفيرين هو عملية نقل الخلايا بوساطة المستقبلات. لوحظ Cy3-transferrin endocytosis (أحمر) في طبقة أحادية HRMEC ملطخة بوصمة عار نووية ، DAPI (أزرق) (الشكل 5B) ، مما يؤكد امتصاصها في الخلايا. يمكن قياس شدة التألق للترانسفيرين الموسوم (Cy3) كميا من الصور لتقييم عملية كثرة الخلايا الداخلية و / أو قياسها من الوسط الذي تم جمعه من الغرفة القاعدية الجانبية للآبار لتحديد مستويات ترانسكيتوسيس بوساطة كلاثرين27.

ينظم مسار إشارات Wnt عملية تحويل الخلايا EC بوساطة الكهف عبر HRMECs في فحص قائم على HRP
في السابق ، وجد أن إشارات Wnt تنظم نقل الخلايا بوساطة الكهف المعتمدة على MFSD2A عبر ECs الوعائية الشبكية للحفاظ على iBRB24. تم تقييم آثار معدلات Wnt في اختبار عبر الخلايا في المختبر القائم على HRP (الشكل 6A). تمت معالجة HRMECs المتقاربة بالكامل باستخدام منشطات مسار Wnt: الوسط المشروط Wnt3a (Wnt3a-CM) أو المؤتلف البشري Norrin، مع أو بدون مثبط إشارات Wnt / β-catenin XAV939 ، وتم الكشف عن مستويات HRP عبر الخلايا عبر HRMECs. كشف العلاج باستخدام Wnt3a-CM أو Norrin عن انخفاض كبير في مستويات HRP عبر الخلايا ، مما يدل على انخفاض ترانسكيتوسيس الخلايا الكهفي. بالإضافة إلى ذلك، أظهر العلاج المشترك مع مثبط إشارات Wnt XAV939 مستويات غير منظمة من HRP المنقول عبر الخلايا في HRMECs، وبالتالي طمس آثار منشطات Wnt على نفاذية HRMEC (الشكل 6B، C)24.

Figure 1
الشكل 1: طرق النقل المختلفة عبر بطانة الأوعية الدموية في الشبكية. رسم تخطيطي يوضح الطرق المختلفة للتدفق الجزيئي عبر الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الشبكية (RMECs). يتم النقل عبر الخلايا البطانية الوعائية الشبكية داخل الحاجز الدموي الداخلي للشبكية عبر طريقين رئيسيين: المسارات شبه الخلوية وعبر الخلايا بما في ذلك ترانس كليبراتوس. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Yemanyi et al.5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على مسارات النقل الحويصلي عبر الخلايا البطانية وتقييم كل منها في المختبر . في الخلايا البطانية (ECs) ، يحدث نقل الجزيئات الكبيرة عبر الخلايا من خلال ثلاثة أنواع رئيسية من الحويصلات: الحويصلات الكهفية (50-100 نانومتر) ، أو الحويصلات المغلفة بالكلاثرين (70-150 نانومتر) ، أو الماكروبينوسومات المستقلة عن الكلاثرين (200-500 نانومتر). Caveolae هي نطاقات دقيقة على شكل قارورة ، كروية ، غنية بالدهون في غشاء البلازما ، تتكون من كافولين وكافين. يمكن تحديد مستويات transcytosis من خلال هذه الحويصلات عن طريق المقايسات المختبرية القائمة على التألق في ثقافة EC باستخدام بيروكسيديز الفجل (HRP) جنبا إلى جنب مع الركيزة الفلورية ، الترانسفيرين الموسوم بالفلورسنت (Cy3-Tf) ، أو ألبومين مصل البقر الموسومة برباعي ميثيل الرودامين (TMR-BSA) ل transcytosis بوساطة الكهف ، transcytosis بوساطة clathrin ، و macropinocytosis ، على التوالي ، لتقييم نفاذية حاجز الدم والشبكية الداخلي (iBRB). في حين أن كل مسار له سمات وآليات نقل مميزة ، يمكن أن يحدث تداخل في الوظيفة ونقل المواد ، خاصة بين النقل الكهفي و macropinocytosis ، وكلاهما مستقل عن الكلاثرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تصور لانتقال الخلايا EC في شبكية العين. (A) تظهر صورة المجهر الضوئي تجويف الأوعية الدموية المملوء ب HRP من قسم شبكية العين للفأر من النوع البري (WT) البالغ من العمر 3 أشهر ، ملطخا ب 3,3'-diamino benzidine (DAB) (أسود). تم حقن HRP في المدار الرجعي في فئران WT ، يليه عزل العين وتضمين الأنسجة. تم تلطيخ المقاطع الرقيقة بركيزة DAB كثيفة الإلكترونات للكشف اللوني عن HRP كراسب بني داكن وتم تصويرها تحت المجهر الضوئي للكشف عن HRP داخل تجويف الأوعية الدموية في شبكية العين. (ب، ج) ثم تمت معالجة العينات بشكل أكبر باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) المقطع الرقيق للغاية لتصور الحويصلات العابرة للخلايا المحتوية على HRP ، والتي تصور ترانسسيتوسيس EC عبر iBRB. تظهر صور TEM قسما شبكيا لفأر WT يبلغ من العمر 3 أشهر مع تجويف الأوعية الدموية المملوء ب HRP والحويصلات المحتوية على HRP داخل RMECs. (ب) من المحتمل أن تعكس الحويصلة الكبيرة العرضية الماكروبينوسوم (رأس السهم) داخل ECs ، مع وجود خلايا الدم الحمراء (العلامة النجمية) على الجانب المضيء. (ج) من المحتمل أن تكون الحويصلات الصغيرة حويصلات كهفية (رؤوس سهام). (د) الكيمياء النسيجية المناعية المشتركة للأجسام المضادة CAV-1 (الأخضر) والأيزوليكتين B 4 (IB4 ، الأحمر ، علامة EC) يوضح توطين CAV-1 في الأوعية الدموية الشبكية في شبكية العين الفأر WT البالغة من العمر 3 أشهر (DAPI ، الأزرق). (ه) صورة TEM ل CAV-1 الموسوم بالذهب المناعي (النقاط السوداء والأسهم) داخل ECs الشبكية ؛ يظهر الجزء الداخلي صورة مكبرة لحويصلة كهفية إيجابية CAV-1. الاختصارات: HRP = بيروكسيديز الفجل. GCL = طبقة الخلايا العقدية; IPL = طبقة الشكل الضفيري الداخلية ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية; OPL = طبقة الشكل الضفيري الخارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية; RPE = ظهارة صبغة الشبكية. E = خلية بطانية; و L = تجويف الأوعية الدموية. التكبير: (A، D) 20x. أشرطة المقياس: (A) 50 ميكرومتر ، (B) 2 ميكرومتر ، (D) 100 ميكرومتر ، و (C ، E) 200 نانومتر. وتم تكييف الفريق (هاء) بإذن من وانغ وآخرين(24). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحقق من صحة مراكز إدارة الموارد البشرية المتقاربة بالكامل وزيادة نفاذية الأوعية الدموية في مراكز إدارة الموارد البشرية بعد معالجة VEGF . (أ) رسم تخطيطي يوضح موضع الأقطاب الكهربائية في الغرف القمية والقاعدية للآبار لقياس المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) كتقييم لنفاذية الأوعية الدموية وسلامة الطبقة الأحادية الخلية. (ب) رسم بياني يوضح تسجيلات TEER ل HRMECs المتقاربة بالكامل مع وبدون علاج مسبق مع عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF). يؤدي العلاج باستخدام VEGF بعد 18 ساعة (18 ساعة) إلى تقليل TEER في HRMECs31 المتقاربة بالكامل. ص≤0.001. () تم تكييف الفريق (باء) بإذن من توميتا وآخرين.31. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: رسم توضيحي تخطيطي لفحص ترانسسيتوسيس EC بوساطة الكلاثرين في HRMECs باستخدام الترانسفيرين (Tf. (A) نمت HRMECs إلى التقاء كامل على الإدخالات المغلفة بالجيلاتين والمصل المتعطش بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية قبل الفحص. تم احتضان الخلايا بشكل قمي مع الترانسفيرين الفلوري Cy3-conjugated (Cy3-Tf) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، تم غسل الخلايا بشكل مكثف بوسط جديد لإزالة Cy3-Tf خارج الخلية غير المقيدة. ثم تم نقل الإدخالات التي تحتوي على وسط طازج إلى صفيحة جديدة تحتوي على وسط دافئ في الغرفة القاعدية ، وتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة إضافية لإطلاق Cy3-Tf المصابة بالخلايا الداخلية. يمكن جمع الوسط من الغرفة القاعدية الجانبية، ويمكن قياس شدة التألق المقابلة لانتقال الخلايا EC المعتمد على الكلاثرين (Cy3-Tf) باستخدام قارئ لوحة التألق. (ب) لوحظ أن Cy3-transferrin (أحمر) في مراكز إدارة الموارد البشرية ملطخة ب DAPI (أزرق) ، مما يؤكد الإصابة بالخلايا الداخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تنظم إشارات Wnt عملية تحويل الخلايا HRMEC بوساطة الكهف في فحص قائم على HRP في المختبر. (A) رسم توضيحي تخطيطي يوضح الفحص القائم على HRP لتقييم ترانسكيتوسيس بوساطة الكهف. تم تجويع HRMECs المتقاربة بالكامل المستزرعة على الإدخالات المغلفة بالجيلاتين بين عشية وضحاها في مصل البقر الجنيني (FBS) بنسبة 0.5٪ + وسط EBM عند 37 درجة مئوية قبل العلاج. تمت معالجة الطبقة الأحادية EC في الغرفة القمية بالعلاج المطلوب لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم احتضان الخلايا ببيروكسيديز الفجل (HRP) عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وغسلها بشكل مكثف لإزالة HRP خارج الخلية الحرة. ثم تم نقل الإدخالات التي تحتوي على وسط طازج إلى صفيحة جديدة تحتوي على وسط دافئ في غرف بازوجانبية ، وتم تحضين الخلايا لمدة 90 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية. تم جمع الوسط من الغرفة القاعدية ، وتم تحديد مستويات HRP كميا عن طريق التفاعل مع ركيزة البيروكسيديز الفلوروجينية. تم قياس التألق المقابل لانتقال الخلايا EC بوساطة الكهف باستخدام قارئ لوحة التألق. (ب، ج) في هذا المثال، عولجت الخلايا بمعدلات مسار Wnt: الوسط المشروط Wnt3a (Wnt3a-CM) أو الوسط المشروط بالتحكم (Ctrl-CM)، أو Norrin المؤتلف البشري أو محلول التحكم الخاص به (Ctrl)، ومع أو بدون مثبط إشارات Wnt/β-catenin (XAV939) أو التحكم في السيارة (المركبة). تم تقييم آثارها على ترانسسيتوسيس كهف HRMEC في الفحص القائم على HRP. بعد العلاج ، تم قياس مستويات HRP المنقولة إلى الغرفة القاعدية ، مما يشير إلى مستويات transcytosis EC بوساطة الكهف عبر HRMECs. خفضت منشطات Wnt مستويات ترانسكيتوسيس القائم على HRP ، والتي تم عكسها بواسطة XAV939. * ص≤0.05، ** ص≤0.01. وتم تكييف الفريقين (باء) و(جيم) بإذن من وانغ وآخرين(24). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يلعب BRB دورا أساسيا في صحة الشبكية ومرضها. أثبتت التقنيات المخبرية التي تقيم نفاذية الأوعية الدموية أنها أدوات حاسمة في الدراسات المتعلقة بتطوير الحاجز (BRB / BBB) ووظيفته. يمكن استخدام الإجراء الموصوف هنا لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء ترانسسيتوزيس EC أو تقييم المعدلات الجزيئية ذات الصلة التي تؤثر على نفاذية BRB. في المختبر تتمتع فحوصات EC transcytosis بمزايا متعددة مقارنة بالمقايسات أو التقنيات المستخدمة لتقييم نفاذية الأوعية الدموية. فهي سريعة الأداء مع إنتاجية عالية ويمكن استخدامها لتحليل آثار العديد من المتغيرات المختلفة أو الجزيئات المعزولة لمسارات إشارات محددة مع كل من التعديل الجيني والدوائي. يعمل نظام زراعة EC النقي على طمس التباين الحيواني كما لوحظ غالبا في الجسم الحي ويحد أيضا من آثار التعديل المحتمل أو كثرة الخلايا الداخلية للجزيئات المستهدفة بواسطة أنواع الخلايا الأخرى32. إن التعامل مع خلايا HRMEC أمر سهل ، حيث يتطلب معدات أساسية لزراعة الخلايا متوفرة في معظم المختبرات ، وغالبا ما تكون زراعة الخلايا أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة بالتجارب على الحيوانات في الجسم الحي. على الرغم من أن فحوصات نقل الخلايا في المختبر لا تكرر تماما الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي33 ، إلا أنها يمكن أن تكون أدوات قيمة لاستكمال الدراسات في الجسم الحي وتعزيز معرفتنا حول التحكم في BRB.

تتطلب العديد من المعلمات التقنية المهمة النظر فيها ، بما في ذلك حجم المسام لإدراج المرشح ، ونوع الطبقة التحتية ، وكثافة بذر الخلية. يمكن أن يؤدي حجم المسام الأكبر لإدخالات المرشح القابلة للنفاذ إلى هجرة غير مرغوب فيها ونمو الخلايا على الجانب السفلي من الإدراج ، مما يربك القياس الناتج وتفسيره. في حين أن هذا الميل قد يختلف باختلاف أنواع الخلايا ، فإن أقطار المسام ≤1 ميكرومتر تخدم بشكل جيد لمعظم أنواع الخلايا ، بما في ذلك ECs34. يعد اختيار الركيزة المناسبة خطوة حاسمة ثانية لأن بعض الخلايا تظهر قطبية أعلى وتمايز أكبر عند زراعتها على الركيزة المسامية واستحمامها في وسط استزراع على كلا الجانبين35,36. تعد مرشحات البولي كربونات المسامية الدقيقة المعالجة بديلا أفضل ل ECs لأنها أرق وتوفر وصولا أكبر للكواشف إلى المنطقة القاعدية الجانبية للطبقة الأحادية مع الحد الأدنى من التألق الخلفي للمقايسات المناعية35. أخيرا ، من أجل تحقيق طبقة أحادية متقاربة بالكامل ، يجب تحسين كثافة بذر الخلية بناء على نوع الخلية المحدد. في حين أن كثافة البذر المنخفضة جدا يمكن أن تؤثر على حالة التمايز ، فإن كثافة البذر العالية جدا ، من ناحية أخرى ، قد تفضل ربط الخلايا بسرعة لتشكيل طبقات خلايا متعددة بدلا من طبقة واحدة ، مما يؤدي في النهاية إلى تغيير المورفولوجيا الخلوية ويؤدي إلى قياس غير دقيق ل transcytosis37.

يعد تكوين وسلامة الطبقة الأحادية EC أمرا بالغ الأهمية لهذا الفحص ويمكن التحقق من صحته من خلال قياس قيم TEER لضمان تحقيق TEER المطلوب. يجب دائما تضمين عنصر تحكم فارغ ، أي إدراج مرشح بدون خلايا ، لقياس المستويات القاعدية للمقاومة عبر الغشاء القابل للنفاذ ليتم طرحه من تلك الموجودة في إدراج الخلايا. قد تتسبب عوامل مختلفة مثل درجة الحرارة ورقم مرور الخلية وتكوين وسط الاستزراع ومدة الاستزراع وتغيرات طول التقاطع في اختلافات طفيفة في قيم TEER 25,38,39. تتأثر قيم TEER أيضا بشكل كبير ببعض العلاجات ، مثل VEGF. اكتشف VEGF في البداية كمحفز قوي لنفاذية الأوعية40 ، ويؤثر على نفاذية الأوعية الدموية من خلال تنظيم النقل شبه الخلوي ، أي من خلال فسفرة بروتينات الوصلة الضيقة ZO-1 ، occludin، وتعطيل بروتين التقاطع الضيق claudin-5 41,42 وكذلك النقل عبر الخلوي 43 . يمكن إجراء التحقق الإضافي من تكوين الطبقة الأحادية من خلال الفحص المورفولوجي ووجود بروتينات تقاطع مميزة مع تلطيخ. في جميع أنحاء الثقافة ، يوصى بتغيير الوسائط في كل من الغرف القمية والقاعدية الجانبية على فترات منتظمة للحفاظ على الخلايا في حالة الثقافة المثلى مع نطاق الأس الهيدروجيني المثالي وتوافر المغذيات.

يجب على الباحثين الذين يستخدمون هذا الفحص الانتباه إلى سمة متأصلة حاسمة في ECs في الدماغ والشبكية: القطبية apicobasal ، وهي سمة خلوية مميزة ل BBB44 ، وبالمثل ، BRB. يتم تحديد اتجاه transcytosis من خلال التوزيع النسبي لمستقبلات البروتين المستهدفة ذات الأهمية وآلية transcytosis المرتبطة بها في المجالات القمية / المضيئة مقابل المجالات القاعدية / اللامعة لغشاء EC. الدماغ والشبكية ECs قادرة على إطلاق العديد من العوامل من كل من الأغشية القمية / المضيئة والأغشية القاعدية / المضيئة44. ومن المثير للاهتمام أن ترانسكسيتوسيس ترانسفيرين المعتمد على الكلاثرين يحدث في الغالب في اتجاه واحد من جانب الدم إلى الدماغ أو شبكية العين ، لأن مستقبلات الترانسفيرين تقع في الغالب على الغشاء القمي / اللمعاني45. من ناحية أخرى ، يحدث ترانسكليت الخلايا الكهفية ثنائي الاتجاه ويمكن أن ينشأ إما من الغشاء القمي / اللمعان أو القاعدي / اللمعي وعبر إلى الجانب الآخر اعتمادا على توطين حمولة الحويصلة ومستقبلاتها46. MFSD2A ، وهو مستقبل دهني عبر الغشاء (لحمض أوميغا 3 الدهني حمض الدوكوساهيكسانويك) ومثبط ترانسكويتوسيس الكهفي ، يقع أيضا على المجالات القمية / المضيئة من ECs23,47. يتم تنظيم التعبير عن MFSD2A نسخيا بواسطة إشارات Wnt للتوسط في تأثيرها على التحكم BRB ، كما هو موضح كمثال في هذا البروتوكول24. وبالتالي ، فإن التقنية الموصوفة هنا تنطوي على اكتشاف جزيء تتبع يوضع على الغرفة العلوية / القمية بعد امتصاصه من قبل الطبقة الأحادية EC وإطلاقه في الغرفة السفلية / القاعدية الجانبية ، مما يحاكي انتقال الخلايا في الجزء القمي / اللمعاني / الدم إلى الاتجاه القاعدي / الألماني / الأنسجة. يمكن تعديل هذا البروتوكول للكشف عن انتقال الخلايا في الاتجاه المعاكس عن طريق وضع جزيئات التتبع في الغرفة السفلية ومراقبة الامتصاص والإطلاق في الغرفة القمية لتناسب حاجة المحققين. وعلاوة على ذلك، إذا لزم الأمر، فإن اتخاذ خطوة إضافية لتحديد تراكم/تدهور الجزيء المستهدف المرتبط بالتتبع داخل الخلايا من شأنه أن يؤدي إلى مزيد من القياس للحويصلات العابرة للخلايا المتبقية في السيتوسول32.

الفحص الموصوف له العديد من المزايا ويعمل كأداة أساسية في الدراسات المتعلقة ب BRB / BBB ، ولكن هناك بعض القيود. إنه نظام معزول خال من التفاعلات من أنواع الخلايا الأخرى من iBRB ، مثل الخلايا المحيطة والخلايا الدبقية ، وبالتالي لا يمكن أن يحاكي بالضبط البيئة الفسيولوجية داخل الجسم الحي. يمكن أن تختلف قيم TEER بين القياسات بسبب التغير في درجة الحرارة أو وضع الأقطاب الكهربائية25,38. ومع ذلك ، فإن توازن الخلايا من 37 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة قبل القياسات ، والتعامل الدقيق مع الأقطاب الكهربائية ، بما في ذلك عناصر التحكم الفارغة يمكن أن يساعد في تقليل التقلبات. بالإضافة إلى ذلك ، حتى مع الغسيل الكافي ، لا يمكن استبعاد التسرب من الطريق شبه الخلوي ، وإن كان بكمية ضئيلة ، تماما. قد يحدث أيضا تداخل في نقل HRP بين طرق نقل الخلايا المختلفة ، على سبيل المثال ، بين النقل الكهفي و macropinocytosis ، وكلاهما مستقل عن الكلاثرين. حسب الحاجة ، يمكن إجراء مزيد من التحقيق في التمييز باستخدام معدلات محددة و / أو مثبطات للكهف و micropinocytosis.

باختصار ، تصف هذه الورقة مقايسة transcytosis في المختبر تسمح بتحديد كمية من transcytosis بوساطة الكهف أو الناقل عبر BRB / BBB. يمكن أن يكون الفحص في المختبر مفيدا للغاية في فحص مختلف الجزيئات المؤيدة / المضادة للأوعية الدموية31 ، أو معدلات مسار الإشارات24 ، أو أنظمة توصيل الأدوية 27,48 المتعلقة بالتحكم في BRB / BBB. يمكن أن يستفيد التحقيق في قطبية EC و transcytosis الاتجاهي أيضا من هذا النظام سهل الاستخدام. بالنظر إلى التوافر المحدود للنماذج المختبرية ل iBRB وأبحاث العين ، يمكن أيضا تعديل الإجراء الموضح هنا كنظام زراعة مشتركة مع الخلايا المحيطة والخلايا النجمية وثقافات النمط العضوي 3-D49 ، أو باستخدام نماذج متقدمة قائمة على الخلايا مثل أنظمة الأوعية الدموية العصبية الفسيولوجية الدقيقة50 ، من أجل مواصلة التحقيق في التفاعلات الخلوية ومحاكاة الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي بشكل أفضل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح أو مصلحة مالية للإفصاح عنها.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY028100 و EY024963 و EY031765) إلى JC. تم دعم ZW من قبل مؤسسة Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

الطب، العدد 184، حاجز الدم والشبكية، الكهف، الخلايا البطانية، ترانسكيليتوسيس، Wnt
فحص نقل الخلايا البطانية كنموذج <em>في المختبر</em> لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الشبكي الداخلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F.,… More

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter