Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель in vitro для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол иллюстрирует анализ трансцитоза эндотелиальных клеток in vitro в качестве модели для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки путем измерения способности микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека транспортировать пероксидазу хрена через клетки в трансклеточных процессах трансклеточного транспорта, опосредованных кавеолами.

Abstract

Дисфункция гемато-сетчаточного барьера (БРБ) способствует патофизиологии ряда сосудистых заболеваний глаз, нередко приводящих к отеку сетчатки и последующей потере зрения. Внутренний гемато-ретинальный барьер (iBRB) в основном состоит из эндотелия сосудов сетчатки с низкой проницаемостью в физиологических условиях. Эта особенность низкой проницаемости жестко регулируется и поддерживается низкими темпами параклеточного транспорта между соседними микрососудистыми эндотелиальными клетками сетчатки, а также трансклеточным транспортом (трансцитозом) через них. Оценка проницаемости трансклеточного барьера сетчатки может дать фундаментальное представление о целостности iBRB в здоровье и болезни. В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза эндотелиальных клеток (EC) в качестве модели in vitro для оценки проницаемости iBRB с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs). Этот анализ оценивает способность HRMECs транспортировать трансферрин и пероксидазу хрена (HRP) в рецептор- и кавеолах-опосредованных трансклеточных транспортных процессах соответственно. Полностью сливающиеся HRMECs, культивируемые на пористой мембране, инкубировали с флуоресцентно-меченым трансферрином (клатринозависимый трансцитоз) или HRP (кавеол-опосредованный трансцитоз) для измерения уровней трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру, что свидетельствует об уровнях трансцитоза в монослое ЕС. Передача сигналов Wnt, известный путь, регулирующий iBRB, модулировали для демонстрации метода анализа трансцитоза на основе HRP, опосредованного кавеолами. Анализ трансцитоза EC, описанный здесь, может обеспечить полезный инструмент для исследования молекулярных регуляторов проницаемости EC и целостности iBRB при сосудистых патологиях и для скрининга систем доставки лекарств.

Introduction

Человеческая сетчатка является одной из самых энергоемких тканей в организме. Правильное функционирование нервной сетчатки требует эффективного снабжения кислородом и питательными веществами наряду с ограниченным потоком других потенциально вредных молекул для защиты среды сетчатки, которая опосредована через гемато-ретинальный барьер (BRB)1. Подобно гематоэнцефалическому барьеру (ГЭБ) в центральной нервной системе, БРБ действует как селективный барьер в глазу, регулируя движение ионов, воды, аминокислот и сахара в сетчатке и из нее. BRB также поддерживает гомеостаз сетчатки и его иммунную привилегию, предотвращая воздействие факторов кровообращения, таких как иммунные клетки, антитела и вредные патогены2. Дисфункция BRB способствует патофизиологии некоторых сосудистых заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), ретинопатия недоношенных (РН), окклюзия вен сетчатки и увеит, что приводит к вазогенному отеку и последующей потере зрения 3,4,5.

BRB состоит из двух отдельных барьеров для двух различных глазных сосудистых сетей, соответственно: сосудистой сетчатки и фенестрированного хориокапилляриса под сетчаткой. Внутренний BRB (iBRB) в основном состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки (RMECs), выстилающих микроциркулятор сетчатки, который питает внутренние нейронные слои сетчатки. С другой стороны, пигментный эпителий сетчатки образует основной компонент наружного BRB, который находится между нейросенсорной сетчаткой и хориокапиллярием2. Для iBRB молекулярный транспорт через RMECs происходит как по параклеточным, так и по трансклеточным путям (рисунок 1). Высокая степень селективности вещества в iBRB зависит от (i) наличия соединительных белковых комплексов, которые ограничивают параклеточный транспорт между соседними эндотелиальными клетками (EC), и (ii) низких уровней экспрессии медиаторов, транспортеров и рецепторов caveolae в эндотелиальных клетках, которые поддерживают низкие скорости трансклеточного транспорта 1,6,7,8 . Соединительные комплексы, регулирующие параклеточный поток, состоят из плотных соединений (клаудины, окклюдины), адгезивных соединений (VE cadherins) и щелевых соединений (коннексины), что позволяет проходить воде и мелким водорастворимым соединениям. В то время как небольшие липофильные молекулы пассивно диффундируют через внутреннюю часть RMECs, движение более крупных липофильных и гидрофильных молекул регулируется АТФ-управляемыми трансэндотелиальными путями, включая везикулярный транспорт и мембранные транспортеры 5,9.

Везикулярный трансцитоз может быть классифицирован как кавеолин-опосредованный кавеолярный трансцитоз, клатринозависимый (и рецептор-опосредованный) трансцитоз и клатрино-независимый макропиноцитоз (рисунок 2). Эти везикулярные транспортные процессы включают везикулы разного размера, причем макропиносомы являются самыми большими (в диапазоне от 200-500 нм), а кавеолы - самыми маленькими (в среднем 50-100 нм), в то время как везикулы, покрытые клатрином, варьируются от 70-150 нм10. Кавеолы представляют собой колбовидные липидные инвагинации плазматической мембраны с белковой оболочкой, в основном состоящей из кавеолина-1, который связывает холестерин липидной мембраны и другие структурные и сигнальные белки через их кавеолин-каркасный домен11. Кавеолины работают вместе с периферически прикрепленным кавином, способствуя стабилизации кавеол на плазматической мембране12. Кавеолярные мембраны также могут нести рецепторы для других молекул, таких как инсулин, альбумин и циркулирующие липопротеины, включая липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП), чтобы помочь их движению через эндотелиальные клетки13. В процессе развития формирование функционального БРБ зависит от подавления ЭК трансцитоза8. Зрелый эндотелий сетчатки, следовательно, имеет относительно низкие уровни кавеол, кавеолин-1 и альбуминовых рецепторов по отношению к другим эндотелиальным клеткам в физиологических условиях, что способствует его барьерным свойствам 4,9.

Поскольку разрушение iBRB является основным признаком многих патологических заболеваний глаз, важно разработать методы оценки проницаемости сосудов сетчатки in vivo и in vitro. Эти методы помогают обеспечить вероятное понимание механизмов нарушения целостности BRB и оценить эффективность потенциальных терапевтических мишеней. Текущая визуализация in vivo или количественные анализы сосудистой утечки обычно используют флуоресцентные (флуоресцеин натрия и декстран), колориметрические (краситель Evans Blue и субстрат пероксидазы хрена [HRP]) или радиоактивные индикаторы14 для обнаружения экстравазации из сосудистой системы в окружающие ткани сетчатки с помощью микроскопической визуализации или в изолированном тканевом лизате. Идеальный индикатор для количественной оценки сосудистой целостности должен быть инертным и достаточно большим, чтобы свободно проникать в скомпрометированные сосуды, находясь в пределах здоровых и неповрежденных капилляров. Методы, использующие флуоресцеин натрия или флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный декстран (FITC-декстран) в флуоресцеиновой ангиографии живого глазного дна (FFA) или изолированных плоских креплениях сетчатки, широко используются для количественной экстравазации сетчатки in vivo или ex vivo. FITC-декстран имеет то преимущество, что он доступен в различных молекулярных массах в диапазоне от 4 до 70 кДа для исследований с выбором размера 15,16,17. FITC-альбумин (~68 кДа) является альтернативным крупногабаритным белковым индикатором, имеющим биологическое значение для исследований сосудистой утечки18. Краситель Evans Blue, вводимый внутрисердечно19, ретроорбитально или через хвостовую вену20, также полагается на его связывание с эндогенным альбумином с образованием большой молекулы, которая может быть количественно определена в основном спектрофотометрическим обнаружением или, реже, флуоресцентной микроскопией в плоских маунтах20,21. Однако эти количественные или световые методологии визуализации часто не отличают параклеточный транспорт от трансэндотелиального транспорта. Для специфического анализа трансцитоза с ультраструктурной визуализацией трансцитозированных везикул индикаторные молекулы, такие как HRP, обычно используются для определения местоположения трансцитозированных везикул в эндотелиальных клетках, которые можно наблюдать под электронным микроскопом 22,23,24 (рисунок 3A-C).

Разработка и использование моделей in vitro iBRB для оценки проницаемости эндотелиальных клеток может обеспечить надежную и высокую оценку пропускной способности, чтобы дополнить эксперименты in vivo и помочь в исследовании молекулярных регуляторов сосудистой утечки. Обычно используемые анализы для оценки параклеточного транспорта и целостности плотных соединений включают трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), меру ионной проводимости (Фиг.4)2,25, и анализ сосудистой утечки in vitro с использованием флуоресцентных индикаторов26 с малой молекулярной массой. Кроме того, анализы трансцитоза на основе трансферрина, моделирующие ГЭБ, были использованы для изучения клатрино-зависимого трансцитоза27. Несмотря на это, анализы для оценки BRB и, более конкретно, кавеолярного трансцитоза EC сетчатки in vitro ограничены.

В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза EC с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) в качестве модели in vitro для определения проницаемости iBRB и трансцитоза EC. Этот анализ опирается на способность HRMECs транспортировать трансферрин или HRP через рецептор-опосредованные или кавеолы-зависимые пути трансцитоза, соответственно (рисунок 2). HRMECs, культивируемые до полного слияния в апикальной камере (т.е. фильтрующей вставке), инкубировали с флуоресцентно-конъюгированным трансферрином (Cy3-Tf) или HRP для измерения интенсивности флуоресценции, соответствующей уровням трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру исключительно посредством трансцитоза EC. Слияние монослоя ячейки может быть подтверждено измерением TEER, указывающим на целостность плотного соединения25. Для демонстрации метода анализа TEER и трансцитоза использовались известные молекулярные модуляторы проницаемости сосудов и трансцитоза EC, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)28 и те, которые находятся в передаче сигналов Wnt (лиганды Wnt: Wnt3a и Norrin)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Бостонской детской больнице для создания световой микроскопии и электромагнитных изображений (рисунок 3). Протоколы исследований in vivo можно получить из Wang et al.24. Все эксперименты с участием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) в Бостонской детской больнице.

1. Подготовка реагентов

  1. Раствор для покрытия тканевой культуры посуды: Готовят 0,1% раствор желатина путем растворения 1 мл раствора желатина (40%-50%) в 500 мл стерильной культуры тканей 1x PBS (рН = 7,4). Процедите раствор через фильтр 0,22 мкм. Хранить 0,1% раствор желатина при температуре 2-8°C. Он может храниться при указанной температуре в течение неопределенного времени в стерильном состоянии.
  2. Питательная среда: Приготовьте 500 мл полной среды роста эндотелиальных клеток (EGM) путем растворения добавок EGM в базальной среде роста эндотелиальных клеток (EBM) в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов). Питательная среда Aliquot в пробирки по 50 мл и храните трубки при 4 °C. Срок годности питательной среды составляет 12 месяцев при 4 °C.
  3. Раствор трипсина: Для 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, аликвота из запасного флакона в пробирки по 50 мл и хранение при 4 °C (до 2 недель) или −20 °C (до 24 месяцев).

2. Культивирование HRMC

  1. Начальная клеточная культура
    1. Покрывать клеточные культуры чашки Петри (диаметром 100 мм х высотой 20 мм) 5 мл 0,1% раствора желатина под ламинарным вытяжкой и держать их нетронутыми в вытяжке в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) для равномерного покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновое покрытие посуды усиливает прикрепление клеток. В качестве альтернативы можно также использовать колбы для культивирования T75 с желатиновым покрытием.
    2. Перед посевом клеток аспирируйте раствор желатина с помощью вакуумного насоса. Вакуумное давление используемого аспиратора составляло до 724 мм рт.ст.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация должна быть выполнена непосредственно перед посевом клеток, чтобы предотвратить высыхание раствора покрытия.
    3. Разморозьте замороженный флакон HRMECs (из хранения в жидком азоте) либо с помощью водяной бани при 37 °C, либо путем добавления теплой питательной среды во флакон. После размораживания перенесут клеточную суспензию в 9 мл питательной среды (при условии, что размороженный флакон HRMECs составляет 1 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HRMEC были получены в коммерческих целях (Таблица материалов). Питательная среда, добавляемая в клетки, всегда должна быть предварительно разогрета до 37 °C перед использованием.
    4. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин при RT и осторожно аспирируйте супернатант, чтобы избежать удаления гранулы клетки.
    5. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл питательной среды и переложите полученную суспензию на чашку Петри, покрытую желатином. Храните клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Как правило, HRMECs на 70%-80% сливаются через 72 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста меняется через день.
  2. Субкультура HRMC на проницаемых мембранных вставках
    1. Подготовьте фильтрующие вставки для клеточных культур (вставки 6,5 мм с поликарбонатной мембраной размером 0,4 мкм, помещенные в 24-луночную пластину) для посева HRMEC путем покрытия каждой вставки (апикальной камеры) 200 мкл 0,1% раствора желатина в течение 30 мин под ламинарной проточной вытяжкой. Убедитесь, что раствор покрывает всю нижнюю поверхность фильтрующей вставки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина имеет апикальную и базолатеральную камеры, разделенные пористой мембраной.
    2. Выньте чашку Петри с культивированными HRMECs (шаг 2.1.5.) из инкубатора и аспирируйте питательную среду. Осторожно промойте клетки 2x с 10 мл 1x PBS под ламинарной проточной капюшоном, чтобы избавиться от потенциальных плавающих / мертвых клеток.
    3. Диссоциируют клетки 0,5-1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и помещают чашку Петри в инкубатор (37 °C и 5% CO2) на 5 мин.
    4. Погасите активность трипсина путем добавления 4,5-9 мл питательной среды и перенесите клеточную суспензию в трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 10 мл.
    5. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин при РТ, осторожно удалите надосадочный материал и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл питательной среды.
    6. Подсчитайте количество ячеек с помощью ручного гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток и посыпайте семена при плотности 4 х 104 ячейки на вставку фильтра (т.е. 1,25 х 105 клеток /см2). Объем клеточной суспензии для каждой вставки составляет 250 мкл.
    7. Аспирировать раствор покрытия из скважин, содержащих проницаемые вставки, и переносить 250 мкл клеточной суспензии на вставку (апикальную камеру). Добавьте только среду (т.е. без ячеек) к одной из вкладышей, которая будет использоваться в качестве "пустого элемента управления" для измерения TEER. Одновременно добавляют также 750 мкл среды на лунку, в базолатеральные камеры.
    8. Держите 24-луночную пластину с проницаемыми вставками в инкубаторе (37 °C и 5% CO2) в течение 7-12 дней до тех пор, пока культивируемые клетки не станут полностью сливающимися и не будет достигнуто желаемое значение TEER ~ 20 Ω ·см2 .
    9. Меняйте питательную среду через день. Во время изменения среды тщательно аспирируйте среду, чтобы свести к минимуму разрушение монослоя клетки, и добавляйте 250 мкл и 750 мкл свежей среды на лунку в апикальную и базолатеральную камеры соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста изменяется как для апикальной, так и для базолатеральной камер скважин.

3. Измерения TEER (рисунок 4)

  1. На 14-й день после посева ячеек (этап 2.2.9.) измерьте TEER для HRMC с использованием системы электрического сопротивления (ER) эпителиального вольтомметра (EVOM) (Таблица материалов) следующим образом.
  2. Предварительно зарядите систему ER и проверьте работоспособность счетчика с помощью тестового электрода STX04. При необходимости выполните калибровку.
  3. Подключите электрод к измерителю и уравновешивайте электрод, сначала замачивая его в 70% этаноле в течение 15-20 мин, а затем ненадолго погружая его в питательную среду EGM клеточной культуры.
  4. В то же время держите ячейку, содержащую 24 скважины пластины, в ламинарной проточной вытяжке на RT в течение 15-20 минут для выравнивания температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На измерения TEER влияет температура, поэтому шаг равновесия имеет важное значение.
  5. Для измерения TEER добавьте свежую питательную среду как в апикальную (250 мкл), так и в базолатеральную (750 мкл) камеры скважин.
  6. Выполните измерение TEER, тщательно погружая электрод таким образом, чтобы более короткий наконечник находился во вставке, а более длинный наконечник касался дна колодца. Сначала измерьте сопротивление на пустом элементе управления. Для каждой вставки измерьте TEER в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для промывки электрода в промежутках между измерениями используют питательные среды. Убедитесь, что электрод удерживается под углом 90° к нижней части вставки для стабильных показаний.
  7. Рассчитать электрическое сопротивление (в Ω·см2) по всему монослою по формуле TEER = чистое сопротивление (Ω) x площадь поверхности фильтрующей вставки (см2); здесь чистое сопротивление — это разница между сопротивлением каждой лунки (питательной среды с клетками) и пустой лунки (только питательной среды).
  8. Проводят дальнейшую обработку клеток только после того, как значение TEER достигнет ~20 Ω·см2. Если желаемый уровень TEER не достигнут, держите пластину в инкубаторе и измеряйте TEER на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние HRMEC также может быть подтверждено морфологическим исследованием формы клеток (под микроскопом) с типичной морфологией булыжника и/или наличием белков клеточного соединения с иммуногистохимическим окрашиванием отдельно.

4. Анализ трансцитоза

  1. Анализ трансцитоза in vitro, опосредованный клатрином, с использованием трансферрина, меченого Cy3 (рисунок 5)
    1. При достижении слияния со значениями TEER около 20 Ω·см2 сыворотка лишает клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2 , используя 0,5% FBS в EBM (сывороточно-восстановленная среда) в обеих камерах (апикальная камера: 250 мкл и базолатеральная камера: 750 мкл) перед лечением лигандом. Сывороточно-восстановленный EBM использовался на протяжении всего анализа.
    2. Инкубируют клетки (используя сывороточно-восстановленную среду на стадии 4.1.1.) в апикальной камере флуоресцентным (цианин 3)-меченым трансферриновым лигандом (Cy3-Tf) (конечная концентрация 40 мкг/мл) в течение 60 мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины, содержащие Cy3-Tf, должны быть защищены от света, чтобы избежать фотоотбеливания Cy3-Tf, завернув в них алюминиевую фольгу и выполнив эксперимент в вытяжке клеточной культуры с выключенным светом.
    3. Через 1 ч поместите пластину на лед и промыть монослой апически и базолатерально 4x (3-5 мин на промывку) с восстановленной в сыворотке средой при RT, чтобы удалить свободный несвязанный Cy3-Tf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима для удаления свободных молекул индикатора и обеспечения точного считывания трансцитоза без потенциальной утечки из параклеточного пути.
    4. Добавьте свежую сывороточную среду (как на этапе 4.1.1.) к тщательно промытым фильтрующим вставкам, содержащим клетки, и переложите вкладыши в свежие колодцы 24-луночной пластины, содержащей предварительно нагретую сывороточную восстановленную среду.
    5. Инкубируют клетки еще 90 мин в инкубаторе (37 °C и 5% CO2), а затем собирают среду из базолатеральной камеры.
    6. Запишите интенсивность флуоресценции раствора из базолатеральной камеры с помощью флуоресцентного детектора. Уровни интенсивности флуоресценции, измеряемые как относительные флуоресцентные единицы (РФС), указывают на количество комплекса Cy3-Tf, трансцитозируемого через монослой HRMEC через клатрин-зависимый трансцитоз.
  2. Анализ трансцитоза in vitro, опосредованный кавеолами, с использованием HRP (рисунок 6)
    1. При достижении полного слияния со значениями TEER около 20 Ω·см2 сыворотка лишает клетки в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2 с использованием 0,5% FBS-содержащей EBM среды (сывороточно-восстановленная среда) перед лечением (как на стадии 4.1.1.). Сывороточно-восстановленная среда EBM использовалась на протяжении всего анализа.
    2. Обработайте клетки в апикальной камере желаемыми методами обработки и контроля транспортного средства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали модуляторы Wnt в качестве примера, чтобы продемонстрировать регуляцию трансцитоза, опосредованного кавеолами, сигнальным путем Wnt в HRMC: человеческий рекомбинантный Норрин и ингибитор Wnt XAV939. В типичном эксперименте клетки обрабатывали в течение 24 ч в инкубаторе (37 °C и 5% CO2) со следующими концентрациями: Норрин (125 нг/мл), Норрин (125 нг/мл) + XAV939 (10 мкМ) и раствор для управления транспортным средством. Кроме того, использовалась среда, кондиционированная Wnt3a (полученная из клеток L Wnt-3A).
    3. Инкубируют клетки в апикальной камере с HRP (5 мг/мл) в течение 15 мин при 37 °C.
    4. После этого поместите 24-луночную плиту на лед и интенсивно промывайте апикальную и базолатеральную камеры 6x с буфером P (10 мМ HEPES pH = 7,4, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ глюкозы, 3 мМ CaCl2, 145 мМ NaCl), чтобы удалить свободную внеклеточную HRP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка необходима для удаления свободных молекул индикатора и обеспечения точного считывания трансцитоза без потенциальной утечки из параклеточного пути.
    5. Добавьте свежую сывороточную среду (как на этапе 4.1.1.) в апикальную камеру и переложите вкладыши в свежий колодец, содержащий предварительно подогретую среду.
    6. Инкубируют монослой в течение дополнительных 90 мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 перед сбором среды из базолатеральной камеры.
    7. К собранной среде добавляют 100 мкл фторогенного пероксидазного субстрата HRP (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя и инкубируют на RT в течение 10 мин до остановки реакции 100 мкл стоп-раствора.
    8. Обнаружение уровней продукта реакции подложки HRP в среде с помощью считывателя флуоресцентных пластин. Измерьте интенсивность флуоресценции на длине волны излучения 420 нм (с возбуждением 325 нм) и в виде относительных флуоресцентных единиц (РФС). Значения указывают на уровень HRP, трансцитозируемого через слой HRMEC через кавеолы-опосредованный трансцитоз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный продукт, используемый здесь (Таблица материалов), не отбеливает. Светозащита от фотоотбеливания не нужна.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ЭМ-изображения эндотелия сосудов сетчатки показывают трансцитотический везикулярный транспорт и кавеолярные везикулы в эндотелиальных клетках in vivo.
EC трансцитоз может быть визуализирован in vivo в поперечных сечениях сетчатки с темно-коричневым осадком, отражающим HRP-содержащие кровеносные сосуды под световым микроскопом (рисунок 3A) и в виде электронно-плотного осадка, указывающего на HRP-содержащие трансцитотические везикулы (рисунок 3B, C) с использованием просвечивающего электронного микроскопа (TEM), тем самым демонстрируя трансцитоз EC через iBRB. Большие везикулы потенциально отражают макропиноцитоз (белый наконечник стрелы; Рисунок 3B), а небольшие везикулы, вероятно, представляют собой кавеолярные везикулы (белые наконечники стрел; Рисунок 3C). Более того, локализация кавеол в кровеносных сосудах сетчатки может рассматриваться как совместное окрашивание антитела к кавеоле маркеру CAV-1 с изолектином (маркером EC) в кровеносном сосуде под флуоресцентным микроскопом (рисунок 3D). CAV-1 положительные кавеолярные везикулы были идентифицированы под TEM с помощью иммунозолотистых антител CAV-1 (черные точки; Рисунок 3E) в эндотелиальных клетках сосудов сетчатки. Протоколы исследований in vivo можно получить из Wang et al.24.

Лечение VEGF увеличивает проницаемость сосудов в HRMECs, измеряемую трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TEER)
Перед выполнением анализов ТРАНСЦИТОЗА ЕС HRMEC следует культивировать до полного слияния, показывая характерную морфологию булыжника, которую можно наблюдать под световым микроскопом. Полное слияние клеток может быть подтверждено путем измерения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) (рисунок 4A), при этом показания достигают ~ 20 Ω·см2 для сливающихся HRMECs30, что свидетельствует о низких уровнях параклеточного транспорта через монослой через плотные или щелевые соединения. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) был использован в качестве примера для демонстрации измерения TEER. Обработка HRMECs с VEGF значительно снижала уровни TEER, отражая повышенную проницаемость HRMEC (рисунок 4B). Снижение значений TEER также наблюдалось в контрольных клетках, потенциально из-за продолжительности культивирования и множественных измерений, проведенных через разные промежутки времени, которые могут нанести ущерб клеткам31.

Транспорт Cy3-трансферрина может быть использован для оценки клатрин-опосредованного EC трансцитоза в HRMECs
Для клатрино-опосредованного EC трансцитоза сливающиеся HRMECs, культивируемые на пористой мембране, инкубировали с флуоресцентным (Cy3)-меченым трансферрином для обнаружения его транспортировки через EC (рисунок 5A). Этот анализ использует тот факт, что транспортировка трансферрина является рецептор-опосредованным процессом трансцитоза. Эндоцитоз Cy3-трансферрина (красный) наблюдался в монослое HRMEC, окрашенном совместно с ядерным пятном, DAPI (синий) (рисунок 5B), подтверждая его поглощение клетками. Интенсивность флуоресценции (Cy3)-меченого трансферрина может быть количественно определена по изображениям для оценки процесса эндоцитоза и/или измерена из среды, собранной из базолатеральной камеры скважин, для количественной оценки уровней клатрино-опосредованного трансцитоза27.

Сигнальный путь Wnt регулирует трансцитоз ЭК, опосредованный кавеолами, через HRMC в анализе на основе HRP
Ранее было обнаружено, что передача Wnt регулирует MFSD2A-зависимый кавеолы-опосредованный трансцитоз через сосудистые ЭК сетчатки для поддержания iBRB24. Эффекты модуляторов Wnt оценивали в анализе трансцитоза in vitro на основе HRP (рисунок 6A). Полностью сливающиеся HRMECs лечили активаторами пути Wnt: Wnt3a-кондиционированной средой (Wnt3a-CM) или человеческим рекомбинантным Норрином, с или без Wnt/β-катенин-сигнальным ингибитором XAV939, и были обнаружены уровни трансцитозированного HRP в HRMC. Лечение Wnt3a-CM или Norrin выявило значительное снижение уровня трансцитозированной HRP, что свидетельствует о снижении кавеолярного трансцитоза. Кроме того, комбинированное лечение сигнальным ингибитором Wnt XAV939 продемонстрировало повышенные уровни трансцитозированной HRP в HRMECs, тем самым уничтожая влияние активаторов Wnt на проницаемость HRMEC (рисунок 6B,C)24.

Figure 1
Рисунок 1: Различные маршруты транспортировки через эндотелий сосудов сетчатки. Схематическая иллюстрация, показывающая различные пути молекулярного потока через микрососудистые эндотелиальные клетки сетчатки (RMECs). Транспорт через эндотелиальные клетки сосудов сетчатки в пределах внутреннего гемато-ретинального барьера происходит по двум основным путям: параклеточным и трансклеточным путям, включая трансцитоз. Эта цифра была адаптирована с разрешения Yemanyi et al.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор трансцитарных везикулярных транспортных путей через эндотелиальные клетки и их соответствующая оценка in vitro . В эндотелиальных клетках (ЭК) трансклетарная транслокация макромолекул происходит через три основных типа везикул: кавеолярные везикулы (50-100 нм), везикулы с клатриновой оболочкой (70-150 нм) или клатрино-независимые макропиносомы (200-500 нм). Кавеолы представляют собой колбовидные, сферические, богатые липидами микродомены в плазматической мембране, состоящие из кавеолина и кавинов. Уровни трансцитоза через эти везикулы могут быть определены с помощью флуоресцентных анализов in vitro в культуре EC с использованием пероксидазы хрена (HRP) в сочетании с флуоресцентным субстратом, флуоресцентным трансферрином (Cy3-Tf) или тетраметилродамином-меченым сывороточным альбумином крупного рогатого скота (TMR-BSA) для трансцитоза, опосредованного каверолами, трансцитоза, опосредованного клатрином, и макропиноцитоза, соответственно, для оценки проницаемости внутреннего гемато-ретинального барьера (iBRB). В то время как каждый путь имеет отличительные особенности и транспортные механизмы, может происходить перекрывающаяся функция и транспорт вещества, особенно между кавеолярным транспортом и макропиноцитозом, оба являются клатрин-независимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Визуализация трансцитоза EC в сетчатке. (A) Изображение светового микроскопа показывает заполненный HRP просвет кровеносного сосуда из 3-месячного участка сетчатки мыши дикого типа (WT), окрашенный 3,3'-диаминобензидином (DAB) (черный). HRP вводили ретроорбитально мышам с последующим выделением глаз и встраиванием тканей. Тонкие участки были окрашены электронно-плотной подложкой DAB для колориметрического обнаружения HRP в виде темно-коричневого осадка и визуализированы под световым микроскопом, чтобы выявить HRP в просвете кровеносных сосудов сетчатки. (В,С) Затем образцы дополнительно обрабатывали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM) ультратонкого сечения для визуализации HRP-содержащих трансцитотических везикул, изображающих трансцитоз EC через iBRB. Изображения TEM показывают участок сетчатки 3-месячной мыши WT с заполненным HRP просветом кровеносных сосудов и HRP-содержащими везикулами в RMECs. (B) Случайный большой пузырьк потенциально отражает макропиносому (наконечник стрелы) в пределах ЕС, с присутствием красных кровяных клеток (звездочка) на просветной стороне. (C) Небольшие везикулы, вероятно, являются кавеолярными везикулами (наконечниками стрел). (D) Иммуногистохимическое совместное окрашивание антитела CAV-1 (зеленый) и изолектина B4 (IB4, красный, маркер EC) демонстрирует локализацию CAV-1 в кровеносных сосудах сетчатки у 3-месячной сетчатки мыши WT (DAPI, синий). (E) изображение ТЕА меченого иммунозолотым CAV-1 (черные точки, стрелки) в ЭК сетчатки; вставка показывает увеличенное изображение CAV-1 положительного кавеолярного пузырька. Сокращения: HRP = пероксидаза хрена; GCL = слой ганглиозных клеток; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = внутренний ядерный слой; OPL = наружный плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; RPE = пигментный эпителий сетчатки; E = эндотелиальная клетка; и L = просвет кровеносных сосудов. Увеличение: (A, D) 20x. Шкала стержней: (A) 50 мкм, (B) 2 мкм, (D) 100 мкм и (C,E) 200 нм. Группа (E) была адаптирована с разрешения Wang et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Валидация полностью сливающихся HRMC и повышенной проницаемости сосудов в HRMC после обработки VEGF. (A) Принципиальная диаграмма, показывающая позиционирование электродов в апикальной и базолатеральной камерах скважин для измерения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) в качестве оценки проницаемости сосудов и целостности монослоя ячейки. (B) График, показывающий записи TEER полностью сливающихся HRMC с предварительным лечением с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и без него. Лечение VEGF через 18 ч (18 Ч) приводит к снижению TEER в полностью слившихся HRMECs31. с≤0.001. Группа (В) была адаптирована с разрешения Tomita et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Схематическая иллюстрация анализа трансцитоза EC, опосредованного клатрином, в HRMC с использованием трансферрина (Tf). (A) HRMECs были выращены до полного слияния на пластинах с желатиновым покрытием и сыворотке голодали в течение ночи при 37 °C перед анализом. Клетки апически инкубировали флуоресцентным Cy3-конъюгированным трансферрином (Cy3-Tf) в течение 60 мин при 37 °C. После инкубации клетки интенсивно промывали свежей средой для удаления несвязанного внеклеточного Cy3-Tf. Затем вставки, содержащие свежую среду, переносили на новую пластину, содержащую теплую среду в базолатеральной камере, и клетки инкубировали при 37 °C в течение дополнительных 90 мин для высвобождения эндоцитоза Cy3-Tf. Среда из базолатеральной камеры может быть собрана, а интенсивность флуоресценции, соответствующая клатринозависимому (Cy3-Tf) EC трансцитозу, может быть измерена с помощью считывателя флуоресцентных пластин. (B) Cy3-трансферрин (красный) наблюдался в HRMC, окрашенных DAPI (синий), подтверждая эндоцитоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Передача сигналов Wnt регулирует трансцитоз HRMEC, опосредованный кавелолами, в анализе in vitro на основе HRP. (A) Схематическая иллюстрация, демонстрирующая анализ на основе HRP для оценки трансцитоза, опосредованного кавеолами. Полностью сливающиеся HRMECs, культивируемые на пластинах с желатиновым покрытием, голодали в течение ночи в 0,5% фетальной бычьей сыворотке (FBS) + среде EBM при 37 °C перед лечением. Монослой ЕС в апикальной камере обрабатывали желаемой обработкой в течение 24 ч при 37 °C. После этого клетки инкубировали с пероксидазой хрена (HRP) при 37 °C в течение 15 мин и интенсивно промывали для удаления свободной внеклеточной HRP. Затем вставки, содержащие свежую среду, переносили на новую пластину, содержащую теплую среду в базолатеральных камерах, и клетки инкубировали в течение дополнительных 90 мин при 37°C. Среду из базолатеральной камеры собирали, а уровни HRP количественно определяли реакцией с фторогенным пероксидазным субстратом. Флуоресценция, соответствующая трансцитозу ЭК, опосредованному кавеолами, измеряли с помощью флуоресцентного пластинчатого считывателя. (В,С) В этом примере клетки обрабатывали модуляторами пути Wnt: Wnt3a-кондиционированной средой (Wnt3a-CM) или ее контролируемой средой (Ctrl-CM), человеческим рекомбинантным Норрином или его управляющим раствором (Ctrl), а также с или без Wnt/β-катенин-сигнального ингибитора (XAV939) или его управления транспортным средством (транспортное средство). Их влияние на кавеолярный трансцитоз HRMEC оценивалось в анализе на основе HRP. После лечения были измерены уровни HRP, перенесенные в базолатеральную камеру, что указывает на уровни трансцитоза ЭК, опосредованные кавеолами, в HRMC. Активаторы Wnt снижали уровни трансцитоза на основе HRP, которые были обращены вспять XAV939. * с≤0.05, ** с≤0.01. Панели (B) и (C) были адаптированы с разрешения Wang et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BRB играет важную роль в здоровье и заболеваниях сетчатки. Методы in vitro , оценивающие проницаемость сосудов, оказались важнейшими инструментами в исследованиях, касающихся развития и функции барьеров (BRB / BBB). Процедура, описанная здесь, может быть использована для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе трансцитоза ЕС, или оценки связанных молекулярных модуляторов, влияющих на проницаемость BRB. In vitro Анализы EC-трансцитоза имеют множество преимуществ по сравнению с анализами in vivo или методами, используемыми для оценки проницаемости сосудов. Они быстро работают с высокой пропускной способностью и могут быть использованы для анализа эффектов многих различных переменных или изолированных молекул конкретных сигнальных путей как с генетической, так и с фармакологической модуляцией. Чистая система культивирования ЕС уничтожает вариации животных, как это часто наблюдается in vivo , а также ограничивает эффекты возможной модификации или эндоцитоза молекул-мишеней другими типами клеток32. Обработка клеток HRMEC проста, требует базового оборудования для культивирования клеток, доступного в большинстве лабораторий, а клеточная культура часто более экономична по сравнению с экспериментами in vivo на животных. Хотя анализы трансцитоза in vitro не полностью воспроизводят физиологические условия in vivo 33, они могут быть ценными инструментами для дополнения исследований in vivo и продвижения наших знаний о контроле BRB.

Несколько важных технических параметров требуют рассмотрения, включая размер пор фильтрующей вставки, тип субстрата и плотность посева клеток. Больший размер пор проницаемых фильтрующих вставок может привести к нежелательной миграции и росту клеток на нижней стороне вставки, что затрудняет результирующее измерение и его интерпретацию. Хотя эта склонность может варьироваться в зависимости от различных типов клеток, диаметр пор ≤1 мкм хорошо подходит для большинства типов клеток, включая EC34. Выбор подходящего субстрата является вторым важным этапом, поскольку некоторые клетки демонстрируют более высокую полярность и большую дифференцировку при выращивании на пористом субстрате и купании в питательной среде с обеих сторон35,36. Обработанные микропористые поликарбонатные фильтры являются лучшей альтернативой для ЕС, поскольку они тоньше и обеспечивают больший доступ реагентов к базолатеральной зоне монослоя с минимальной фоновой флуоресценцией для иммуноанализа35. Наконец, чтобы достичь полностью сливающегося монослоя, плотность посева клеток должна быть оптимизирована на основе конкретного типа клеток. В то время как слишком низкая плотность посева может повлиять на состояние дифференцировки, слишком высокая плотность посева, с другой стороны, может способствовать быстрому присоединению клеток, образующих несколько клеточных слоев вместо монослоя, что в конечном итоге изменяет морфологию клеток и приводит к неточному измерению трансцитоза37.

Формирование и целостность монослоя ЕС имеют решающее значение для этого анализа и могут быть подтверждены путем измерения значений TEER для обеспечения достижения желаемого TEER. Пустой элемент управления, т.е. фильтрующая вставка без ячеек, всегда должен быть включен для измерения базальных уровней сопротивления через проницаемую мембрану, которые должны быть вычтены из клеточных вкладышей. Различные факторы, такие как температура, количество прохождения клеток, состав питательной среды, продолжительность культивирования и изменения длины соединения, могут вызывать незначительные изменения в значениях TEER 25,38,39. На значения TEER также сильно влияют некоторые методы лечения, такие как VEGF. Обнаруженный первоначально как мощный индуктор проницаемости сосудов40, VEGF влияет на проницаемость сосудов, регулируя параклеточный транспорт, то есть путем фосфорилирования белков плотного соединения ZO-1, окклюдина и нарушения плотного соединения белка клаудина-541,42, а также трансклеточного транспорта43 . Дополнительная валидация однослойного образования может быть выполнена при морфологическом исследовании и наличии характерных соединительных белков с окрашиванием. На протяжении всей культуры рекомендуется изменять среды как в апикальной, так и в базолатеральной камерах через равные промежутки времени, чтобы поддерживать клетки в оптимальном состоянии культуры с идеальным диапазоном рН и доступностью питательных веществ.

Исследователи, использующие этот анализ, должны обратить внимание на критическую неотъемлемую особенность мозга и ЭК сетчатки: апикобазальную полярность, которая является клеточной отличительной чертой BBB44 и, аналогично, BRB. Направление трансцитоза определяется относительным распределением интересующих белковых рецепторов-мишеней и связанного с ними механизма трансцитоза в апикальном/просветном и базолатеральном/аблюминальном доменах мембраны EC. ЭК мозга и сетчатки способны высвобождать многие факторы как из апикальных/просветных, так и из базолатеральных/аблюминальных мембран44. Клатрин-зависимый трансцитоз трансферрина, что интересно, по-видимому, происходит в основном однонаправленно со стороны крови к мозгу или сетчатке, поскольку рецепторы трансферрина преимущественно расположены на апикальной/просветной мембране45. Кавеолярный трансцитоз, с другой стороны, происходит двунаправленно и может исходить либо от апикальной/просветной, либо от базолатеральной/аблюминальной мембраны и поперек на другую сторону в зависимости от локализации везикул и их рецепторов46. MFSD2A, трансмембранный липидный рецептор (для омега-3 жирных кислот докозагексаеновой кислоты) и супрессор кавеолярного трансцитоза, также расположен на апикальных/люминальных доменах EC23,47. Выражение MFSD2A транскрипционно регулируется сигнализацией Wnt для опосредования ее влияния на управление BRB, как показано в качестве примера в этомпротоколе 24. Таким образом, описанный здесь метод включает в себя обнаружение молекулы индикатора, помещенной на верхнюю/апикальную камеру после поглощения монослоем ЕС и высвобождения в нижнюю/базолатеральную камеру, имитируя трансцитоз в апикальном/просветном/крови в базолатеральном/аблюминальном/тканевом направлении. Этот протокол может быть модифицирован для обнаружения трансцитоза в противоположном направлении путем размещения молекул индикатора в нижней камере и мониторинга поглощения и высвобождения в апикальную камеру в соответствии с потребностями исследователей. Кроме того, при необходимости дополнительный этап определения внутриклеточного накопления/деградации эндоцитозированной индикаторно-связанной молекулы-мишени даст дальнейшее измерение трансцитотических везикул, оставшихся в цитозоле32.

Описанный анализ имеет много преимуществ и служит важным инструментом в исследованиях, связанных с BRB / BBB, но есть несколько ограничений. Это изолированная система, лишенная взаимодействий с другими типами клеток iBRB, такими как перициты и глиальные клетки, и, следовательно, не может точно имитировать физиологическую среду in-vivo. Значения TEER могут варьироваться между измерениями из-за изменения температуры или позиционирования электродов 25,38. Тем не менее, уравновешивание ячеек от 37 ° C до комнатной температуры перед измерениями, тщательное обращение с электродами и включение пустых элементов управления могут помочь свести к минимуму колебания. Кроме того, даже при достаточной промывке нельзя полностью исключить утечку с параклеточного пути, хотя и в следовом количестве. Также может иметь место перекрытие переноса HRP между различными путями трансцитоза, например, между кавеолярным транспортом и макропиноцитозом, оба из которых являются клатрин-независимыми. При необходимости различие может быть дополнительно исследовано с использованием специфических модуляторов и/или ингибиторов кавеол и микропиноцитоза.

Таким образом, в этой статье описывается анализ трансцитоза in vitro, позволяющий количественно оценить трансцитоз, опосредованный кавеолами или носителями, через BRB / BBB. Анализ in vitro может оказать большую помощь в скрининге различных про-/антиангиогенных молекул31, модуляторов сигнальных путей24 или систем доставки лекарств27,48, относящихся к контролю BRB/BBB. Исследование полярности ЕС и направленного трансцитоза также может извлечь выгоду из этой простой в использовании системы. Учитывая ограниченную доступность моделей in vitro для iBRB и глазных исследований, процедура, описанная здесь, также может быть модифицирована как система кокультур вместе с перицитами, астроцитами и 3-D органотипическими культурами49 или с использованием передовых клеточных моделей, таких как микрофизиологические нейроваскулярные системы50, для дальнейшего изучения клеточных взаимодействий и лучшей имитации физиологических условий in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов или финансовой заинтересованности для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH (R01 EY028100, EY024963 и EY031765) для JC. ZW был поддержан грантом Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Медицина Выпуск 184 Гемато-ретинальный барьер кавеолы эндотелиальные клетки трансцитоз Wnt
Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель <em>in vitro</em> для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F.,… More

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter