Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol illustrerer et in vitro endotelcelletranscytoseassay som en model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet ved at måle evnen hos humane retinale mikrovaskulære endotelceller til at transportere peberrodsperoxidase på tværs af celler i caveolae-medierede transcellulære transportprocesser.

Abstract

Dysfunktion af blod-retinal barrieren (BRB) bidrager til patofysiologien af flere vaskulære øjenlidelser, hvilket ofte resulterer i retinalt ødem og efterfølgende synstab. Den indre blod-retinale barriere (iBRB) består hovedsageligt af retinal vaskulært endotel med lav permeabilitet under fysiologiske forhold. Denne funktion af lav permeabilitet er tæt reguleret og opretholdes af lave paracellulære transporthastigheder mellem tilstødende retinale mikrovaskulære endotelceller såvel som transcellulær transport (transcytose) gennem dem. Vurderingen af retinal transcellulær barrierepermeabilitet kan give grundlæggende indsigt i iBRB-integritet i sundhed og sygdom. I denne undersøgelse beskriver vi et endotelcelle (EC) transcytoseassay som en in vitro-model til evaluering af iBRB-permeabilitet ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC'er). Dette assay vurderer HRMEC'ers evne til at transportere transferrin og peberrodsperoxidase (HRP) i henholdsvis receptor- og caveolae-medierede transcellulære transportprocesser. Fuldt sammenflydende HRMEC'er dyrket på porøs membran blev inkuberet med fluorescerende mærket transferrin (clathrinafhængig transcytose) eller HRP (caveolae-medieret transcytose) for at måle niveauerne af transferrin eller HRP overført til det nederste kammer, hvilket indikerer transcytoseniveauer på tværs af EF-monolaget. Wnt-signalering, en kendt vej, der regulerer iBRB, blev moduleret for at demonstrere den caveolae-medierede HRP-baserede transcytoseanalysemetode. Det her beskrevne EC-transcytoseassay kan være et nyttigt værktøj til at undersøge de molekylære regulatorer af EC-permeabilitet og iBRB-integritet i vaskulære patologier og til screening af lægemiddelafgivelsessystemer.

Introduction

Den menneskelige nethinde er et af de højeste energikrævende væv i kroppen. Korrekt funktion af den neurale nethinde kræver en effektiv tilførsel af ilt og næringsstoffer sammen med en begrænset flux af andre potentielt skadelige molekyler for at beskytte retinalmiljøet, som medieres via blod-retinal barrieren (BRB)1. I lighed med blod-hjerne-barrieren (BBB) i centralnervesystemet fungerer BRB som en selektiv barriere i øjet, der regulerer bevægelsen af ioner, vand, aminosyrer og sukker ind og ud af nethinden. BRB opretholder også retinal homeostase og dets immunprivilegium ved at forhindre eksponering for kredsløbsfaktorer såsom immunceller, antistoffer og skadelige patogener2. BRB-dysfunktion bidrager til patofysiologien af flere vaskulære øjenlidelser, såsom diabetisk retinopati, aldersrelateret makuladegeneration (AMD), præmatur retinopati (ROP), retinal veneokklusion og uveitis, hvilket resulterer i vasogent ødem og efterfølgende synstab 3,4,5.

BRB består af to separate barrierer for henholdsvis to forskellige okulære vaskulære netværk: retinal vaskulaturen og den fenestrerede choriocapillaris under nethinden. Den indre BRB (iBRB) består primært af retinale mikrovaskulære endotelceller (RMEC'er), der forer retinal mikrovaskulaturen, som nærer de indre retinale neuronale lag. På den anden side udgør retinal pigmentepitel hovedkomponenten i den ydre BRB, som ligger mellem den neurosensoriske nethinde og choriocapillaris2. For iBRB finder molekylær transport på tværs af RMEC'er sted gennem både paracellulære og transcellulære ruter (figur 1). Den høje grad af stofselektivitet på tværs af iBRB er afhængig af (i) tilstedeværelsen af junctionale proteinkomplekser, der begrænser paracellulær transport mellem tilstødende endotelceller (EC'er) og (ii) lave ekspressionsniveauer af caveolae-mediatorer, transportører og receptorer inden for endotelcellerne, der opretholder lave transcellulære transporthastigheder 1,6,7,8 . Junctional komplekser, der regulerer paracellulær flux, består af tætte kryds (claudiner, occludins), klæbende kryds (VE-cadheriner) og mellemrumskryds (forbindelsesforbindelser), der tillader passage af vand og små vandopløselige forbindelser. Mens små lipofile molekyler passivt diffunderer over det indre af RMEC'er, reguleres bevægelsen af større lipofile og hydrofile molekyler af ATP-drevne transendotelveje, herunder vesikulær transport og membrantransportører 5,9.

Vesikulær transcytose kan kategoriseres som caveolin-medieret caveolær transcytose, clathrinafhængig (og receptormedieret) transcytose og clathrin-uafhængig makropinocytose (figur 2). Disse vesikulære transportprocesser involverer blærer af forskellig størrelse, hvor makropinosomer er de største (fra 200-500 nm) og caveolae er den mindste (i gennemsnit 50-100 nm), mens clathrin-belagte vesikler spænder fra 70-150 nm10. Caveolae er kolbeformede lipidrige plasmamembraninvaginationer med en proteincoat, primært sammensat af caveolin-1, der binder lipidmembrankolesterol og andre strukturelle og signalproteiner via deres caveolin-stilladsdomæne11. Caveolins arbejder sammen med perifert fastgjort cavin for at fremme caveolae stabilisering ved plasmamembranen12. Caveolar membraner kan også bære receptorer for andre molekyler såsom insulin, albumin og cirkulerende lipoproteiner, herunder high-density lipoprotein (HDL) og low-density lipoprotein (LDL) for at hjælpe deres bevægelse på tværs af endotelceller13. Under udviklingen afhænger dannelsen af funktionel BRB af undertrykkelsen af EC transcytose8. Modent retinalt endotel har derfor relativt lave niveauer af caveolae-, caveolin-1- og albuminreceptorer i forhold til andre endotelceller under fysiologiske forhold, hvilket bidrager til dets barriereegenskaber 4,9.

Fordi iBRB-nedbrydning er et vigtigt kendetegn for mange patologiske øjenlidelser, er det vigtigt at udvikle metoder til vurdering af retinal vaskulær permeabilitet in vivo og in vitro. Disse metoder hjælper med at give sandsynlig indsigt i mekanismerne for kompromitteret BRB-integritet og vurdere effekten af potentielle terapeutiske mål. Nuværende in vivo-billeddannelse eller kvantitative vaskulære lækageassays anvender typisk fluorescerende (natriumfluorescein og dextran), kolorimetrisk (Evans Blue-farvestof og peberrodsperoxidase [HRP] substrat) eller radioaktive sporstoffer14 til påvisning af ekstravasation fra vaskulaturen til omgivende retinale væv med mikroskopbilleddannelse eller i isoleret vævslamsat. Et ideelt sporstof til kvantificering af vaskulær integritet bør være inert og stort nok til frit at gennemtrænge kompromitterede kar, mens det er begrænset i sunde og intakte kapillærer. Metoder, der anvender natriumfluorescein eller fluoresceinisothiocyanatkonjugeret dextran (FITC-dextran) i levende fundus fluorescein-angiografi (FFA) eller isolerede retinale flade monteringer, anvendes i vid udstrækning til kvantificering af retinal ekstravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har den fordel, at den er tilgængelig i forskellige molekylvægte fra 4-70 kDa til størrelsesselektive undersøgelser15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) er et alternativt stort proteinsporstof af biologisk relevans for vaskulære lækageundersøgelser18. Evans Blue-farvestof, injiceret intrakardialt19, retro-orbitalt eller gennem halevenen 20, er også afhængig af dets binding med endogent albumin for at danne et stort molekyle, der kan kvantificeres ved for det meste spektrofotometrisk detektion eller, mindre almindeligt, fluorescensmikroskopi i flade monteringer20,21. Disse kvantitative eller lette billeddannelsesmetoder skelner imidlertid ofte ikke paracellulær transport fra trans-endoteltransport. Til specifik analyse af transcytose med ultrastrukturel visualisering af transcytosede vesikler anvendes spormolekyler såsom HRP typisk til at lokalisere transcytosede vesikler i endotelceller, der kan observeres under et elektronmikroskop22,23,24 (figur 3A-C).

Udviklingen og anvendelsen af in vitro iBRB-modeller til evaluering af endotelcellepermeabiliteten kan give en robust vurdering med høj kapacitet som supplement til in vivo-eksperimenter og støtte undersøgelsen af molekylære regulatorer af vaskulær lækage. Almindeligt anvendte assays til vurdering af paracellulær transport og integritet af tætte kryds inkluderer trans-endotel elektrisk modstand (TEER), et mål for ionisk konduktans (figur 4) 2,25 og in vitro vaskulær lækageassay ved hjælp af små molekylvægt fluorescerende sporstoffer 26. Derudover er transferrinbaserede transcytoseassays modellering af BBB blevet brugt til at udforske clathrinafhængig transcytose27. På trods af dette er assays til evaluering af BRB og mere specifikt retinal EC caveolar transcytose in vitro begrænset.

I denne undersøgelse beskriver vi et EC-transcytoseassay ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC'er) som en in vitro-model til bestemmelse af iBRB-permeabilitet og EC-transcytose. Dette assay er baseret på HRMEC'ers evne til at transportere transferrin eller HRP via henholdsvis de receptormedierede eller caveolaeafhængige transcytoseveje (figur 2). HRMEC'er dyrket til fuld konfluens i det apikale kammer (dvs. filterindsats) blev inkuberet med fluorescerende konjugeret transferrin (Cy3-Tf) eller HRP for at måle fluorescensintensiteten svarende til niveauerne af transferrin eller HRP overført til bundkammeret udelukkende gennem EC-transcytose. Sammenløbet af cellemonolaget kan bekræftes ved at måle TEER, hvilket indikerer den stramme krydsintegritet25. For at demonstrere TEER- og transcytoseassay-teknikken blev der anvendt kendte molekylære modulatorer af vaskulær permeabilitet og EC-transcytose, herunder vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)28 og dem i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a og Norrin)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Boston Children's Hospital til generering af lysmikroskopi og EM-billeder (figur 3). Protokoller for in vivo-undersøgelserne kan fås ved henvendelse til Wang et al.24. Alle eksperimenter, der involverede humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC'er), blev godkendt af Institutional Biosafety Committee (IBC) på Boston Children's Hospital.

1. Fremstilling af reagenser

  1. Opløsning til belægning af vævskulturskål: Der fremstilles 0,1% gelatineopløsning ved opløsning af 1 ml gelatinestamopløsning (40%-50%) i 500 ml steril vævskulturklasse 1x PBS (pH = 7,4). Opløsningen filtreres gennem et filter på 0,22 μm. Opbevares 0,1% gelatineopløsning ved 2-8 °C. Det kan opbevares ved den nævnte temperatur på ubestemt tid i steril tilstand.
  2. Vækstmedium: Forbered 500 ml endotelcellevækst komplet medium (EGM) ved at opløse EGM-kosttilskud i endotelcellevækstbasalmediet (EBM) i henhold til producentens anvisninger (materialetabel). Aliquot vækstmedium i 50 ml rør og opbevare rørene ved 4 °C. Vækstmediets holdbarhed er 12 måneder ved 4 °C.
  3. Trypsinopløsning: For 0,25% trypsin-EDTA-opløsning aliquot fra hætteglasset med stammateriale i 50 ml rør og opbevares ved 4 °C (op til 2 uger) eller -20 °C (op til 24 måneder).

2. Dyrkning af HRMEC'er

  1. Indledende cellekultur
    1. Belægningscellekultur Petriskåle (100 mm diameter x 20 mm højde) med 5 ml 0,1% gelatineopløsning under en laminær flowhætte og opbevar dem uforstyrret i emhætten i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) for ensartet belægning.
      BEMÆRK: Gelatinebelægning af tallerkener forbedrer cellefastgørelsen. Alternativt kan gelatinebelagte T75-kulturkolber også bruges.
    2. Før podning af cellerne aspireres gelatineopløsningen ved hjælp af en vakuumpumpe. Vakuumtrykket på den anvendte aspirator var op til 724 mmHg.
      BEMÆRK: Aspiration skal ske umiddelbart før såning af celler for at forhindre udtørring af belægningsopløsningen.
    3. Optø et frossent hætteglas med HRMEC'er (fra opbevaring i flydende nitrogen) enten ved hjælp af et vandbad ved 37 °C eller ved at tilsætte et varmt vækstmedium i hætteglasset. Når den er optøet, overføres cellesuspensionen til 9 ml vækstmedium (forudsat at optøet hætteglas med HRMEC'er er 1 ml).
      BEMÆRK: HRMEC'erne blev kommercielt fremstillet (materialetabel). Det vækstmedium, der tilsættes cellerne, skal altid forvarmes til 37 °C før brug.
    4. Drej cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved RT og opsug forsigtigt supernatanten for at undgå at fjerne cellepellet.
    5. Resuspender cellepelleten i 10 ml vækstmedium, og overfør den resulterende suspension til en gelatinebelagt petriskål. Cellerne opbevares i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Typisk er HRMEC'er 70% -80% sammenflydende efter 72 timer.
      OBS: Vækstmediet skiftes hver anden dag.
  2. Subkultur af HRMEC'er på permeable membranindsatser
    1. Forbered cellekulturfilterindsatser (6,5 mm indsatser med 0,4 μm polycarbonatmembran i porestørrelse, anbragt i en 24-brøndsplade) til såning af HRMEC'er ved at belægge hver indsats (apikalt kammer) med 200 μL 0,1% gelatineopløsning i 30 minutter under en laminær strømningshætte. Sørg for, at løsningen dækker hele filterindsatsens bundflade.
      BEMÆRK: Hver brønd har et apikalt og basolateralt kammer adskilt af en porøs membran.
    2. Tag petriskålen med kultiverede HRMEC'er (trin 2.1.5.) ud af inkubatoren og aspirer vækstmediet. Skyl forsigtigt cellerne 2x med 10 ml 1x PBS under en laminær strømningshætte for at slippe af med potentielle flydende / døde celler.
    3. Dissocier cellerne med 0,5-1 ml 0,25% trypsin-EDTA-opløsning og læg petriskålen i inkubatoren (37 °C og 5% CO2) i 5 min.
    4. Sluk trypsinaktiviteten ved at tilføje 4,5-9 ml vækstmedier og overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør ved hjælp af en 10 ml pipette.
    5. Drej cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved RT, fjern forsigtigt supernatanten, og suspender pelleten i 3 ml vækstmedier.
    6. Antallet af celler tælles ved hjælp af et manuelt hæmocytometer eller en automatiseret celletæller og frø med en tæthed på 4 x 104 celler pr. filterindsats (dvs. 1,25 x 105 celler / cm2). Volumenet af cellesuspension for hver indsats er 250 μL.
    7. Overfladebehandlingsopløsningen aspireres fra brøndene indeholdende permeable skær, og der overføres 250 μL cellesuspensionen pr. indsats (apikalt kammer). Tilføj kun medium (dvs. uden celler) til en af indsatserne, som vil blive brugt som en "tom kontrol" til TEER-måling. Samtidig tilsættes også 750 μL medium pr. Brønd i de basolaterale kamre.
    8. Opbevar 24-brøndspladen med permeable indsatser i inkubatoren (37 °C og 5% CO2) i 7-12 dage, indtil de dyrkede celler bliver fuldt sammenflydende, og den ønskede TEER-værdi på ~20 Ω·cm2 er opnået.
    9. Skift vækstmediet hver anden dag. Under medieskift skal du forsigtigt opsuge mediet for at minimere forstyrrelsen af cellemonolaget og tilføje 250 μL og 750 μL friske medier pr. Brønd til henholdsvis de apikale og basolaterale kamre.
      BEMÆRK: Vækstmedium ændres for både brøndenes apikale og basolaterale kamre.

3. TEER-målinger (figur 4)

  1. På dag 14 efter cellesåning (trin 2.2.9.) måles TEER for HRMEC'er ved hjælp af et epitelvolt-ohm meter (EVOM) elektrisk modstandssystem (ER) (materialetabel) som følger.
  2. Oplad ER-systemet, og kontroller målerens funktionalitet ved hjælp af STX04-testelektroden. Kalibrer, hvis det er nødvendigt.
  3. Tilslut elektroden til måleren og ligevægt elektroden ved først at lægge den i blød i 70% ethanol i 15-20 minutter og derefter nedsænke den kort i cellekulturens EGM-vækstmedium.
  4. I mellemtiden skal du opbevare den celleholdige 24-brøndplade i den laminære strømningshætte ved RT i 15-20 minutter for temperaturækvilibrering.
    BEMÆRK: TEER-målinger påvirkes af temperaturen, så ækvilibreringstrinnet er afgørende.
  5. Til TEER-måling tilsættes frisk vækstmedium til både de apikale (250 μL) og basolaterale (750 μL) kamre i brøndene.
  6. Udfør TEER-måling ved omhyggeligt at nedsænke elektroden, så den kortere spids er i indsatsen, og den længere spids berører bunden af brønden. Mål modstanden over den tomme kontrol først. For hver indsats måles TEER i tre eksemplarer.
    BEMÆRK: Til skylning af elektroden mellem målingerne anvendes kulturmedier. Sørg for, at elektroden holdes i en vinkel på 90° i bunden af indsatsen for stabile aflæsninger.
  7. Beregn elektrisk modstand (i Ω·cm 2) over monolaget ved hjælp af formlen TEER = nettomodstand (Ω) x overfladeareal af filterindsats (cm2); Her er nettomodstand forskellen mellem modstanden af hver brønd (vækstmedium med celler) og den tomme brønd (kun vækstmedium).
  8. Udfør kun yderligere behandling af cellerne, når TEER-værdien når ~ 20 Ω · cm2. Hvis det ønskede TEER-niveau ikke nås, skal du holde pladen i inkubatoren og måle TEER den følgende dag.
    BEMÆRK: HRMEC-konfluens kan også valideres ved morfologisk undersøgelse af celleform (under et mikroskop) med typisk brostensmorfologi og / eller ved tilstedeværelsen af celleforbindelsesproteiner med immunohistokemifarvning separat.

4. Transcytose assay

  1. Clathrin-medieret in vitro transcytose assay ved hjælp af Cy3-mærket transferrin (figur 5)
    1. Efter at have nået sammenfald med TEER-værdier omkring 20 Ω · cm 2, fratager serum cellerne i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 ved anvendelse af 0,5% FBS i EBM (serumreduceret medium) i begge kamre (apikalt kammer: 250 μL og basolateralt kammer: 750 μL) før behandling med liganden. Serumreduceret EBM blev anvendt under hele analysen.
    2. Cellerne inkuberes (ved hjælp af det serumreducerede medium i trin 4.1.1.) i det apikale kammer med fluorescerende (cyanin 3)-mærket transferrin ligand (Cy3-Tf) (slutkoncentration på 40 μg/ml) i 60 minutter ved 37 °C.
      BEMÆRK: Plader indeholdende Cy3-Tf bør beskyttes mod lys for at undgå fotoblegning af Cy3-Tf ved at pakke aluminiumsfolie ind i dem og udføre eksperimentet i en cellekulturhætte med lysene slukket.
    3. Efter 1 time lægges pladen på is og monolaget vaskes apikalt og basolateralt 4x (3-5 min pr. vask) med det serumreducerede medium ved RT for at fjerne den frie ubundne Cy3-Tf.
      BEMÆRK: Vask er afgørende for at fjerne frie spormolekyler og muliggøre nøjagtig aflæsning af transcytose uden potentiel lækage fra den paracellulære vej.
    4. Der tilsættes frisk serumreduceret substrat (som i trin 4.1.1.) til de gennemvaskede filterindsatser, der indeholder celler, og indsatserne overføres til friske brønde på 24-brøndspladen indeholdende forvarmet serumreduceret medium.
    5. Inkuber cellerne i yderligere 90 minutter i inkubatoren (37 °C og 5% CO2), og opsamling derefter mediet fra det basolaterale kammer.
    6. Opløsningens fluorescensintensitet registreres fra det basolaterale kammer ved hjælp af en fluorescensdetektor. Niveauerne af fluorescensintensitet, målt som relative fluorescerende enheder (RFU), angiver mængden af Cy3-Tf kompleks transcytosed over HRMEC monolaget via clathrinafhængig transcytose.
  2. Caveolae-medieret in vitro transcytose assay ved hjælp af HRP (figur 6)
    1. Efter at have nået fuld konfluens med TEER-værdier omkring 20 Ω · cm 2, fratager serum cellerne i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 ved hjælp af 0,5% FBS-indeholdende EBM-medium (serumreduceret medium) før behandling (som i trin 4.1.1.). Serumreduceret EBM-medium blev anvendt gennem hele analysen.
    2. Behandl cellerne i det apikale kammer med de ønskede behandlinger og køretøjskontroller.
      BEMÆRK: Her har vi brugt Wnt-modulatorer som et eksempel til at demonstrere reguleringen af caveolae-medieret transcytose ved Wnt-signalvejen i HRMEC'er: human rekombinant Norrin og Wnt-hæmmer XAV939. I et typisk forsøg blev celler behandlet i 24 timer i en inkubator (37 °C og 5 % CO2) med følgende koncentrationer: Norrin (125 ng/ml), Norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) og køretøjskontrolopløsning. Derudover blev Wnt3a-konditioneret medium (fremstillet af L Wnt-3A-celler) også anvendt.
    3. Inkubere cellerne i det apikale kammer med HRP (5 mg/ml) i 15 minutter ved 37 °C.
    4. Derefter placeres 24-brøndspladen på is og vaskes de apikale og basolaterale kamre intensivt 6x med P-buffer (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM glucose, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) for at fjerne den frie ekstracellulære HRP.
      BEMÆRK: Vask er afgørende for at fjerne frie spormolekyler og muliggøre nøjagtig aflæsning af transcytose uden potentiel lækage fra den paracellulære vej.
    5. Der tilsættes frisk serumreduceret substrat (som i trin 4.1.1.) til det apikale kammer, og indsatserne overføres til en frisk brønd, der indeholder forvarmede medier.
    6. Monolaget inkuberes i yderligere 90 minutter i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 , før substratet opsamles fra det basolaterale kammer.
    7. Til det opsamlede medium tilsættes 100 μL HRP fluorogent peroxidasesubstrat (materialetabel) i henhold til producentens anvisninger og inkuberes ved RT i 10 minutter, før reaktionen stoppes med 100 μL Stop-opløsning.
    8. Detekter niveauerne af HRP-substratreaktionsprodukt i mediet ved hjælp af en fluorescenspladelæser. Fluorescensintensiteten måles ved 420 nm emissionsbølgelængde (med 325 nm excitation) og som relative fluorescerende enheder (RFU). Værdierne angiver niveauet af HRP-transcytosed over HRMEC-laget gennem caveolae-medieret transcytose.
      BEMÆRK: Det fluorescerende produkt, der anvendes her (materialetabel), fotobleger ikke. Lysbeskyttelse mod fotoblegning er ikke nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EM-billeder af retinal vaskulært endotel viser transcytotisk vesikulær transport og caveolære vesikler i endotelceller in vivo.
EC-transcytose kan visualiseres in vivo inden for retinale tværsnit med mørkebrunt bundfald, der afspejler HRP-holdige blodkar under et lysmikroskop (figur 3A) og som elektrontæt bundfald, der indikerer HRP-holdige transcytotiske vesikler (figur 3B, C) ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM), hvilket viser EC-transcytose over iBRB. Store vesikler afspejler potentielt makropinocytose (hvid pilespids; Figur 3B) og små vesikler repræsenterer sandsynligvis caveolar vesikler (hvide pilespidser; Figur 3C). Desuden kan lokaliseringen af caveolae i retinale blodkar ses som co-farvning af caveolae markør CAV-1 antistof med isolectin (EC markør) i blodkarret under et fluorescens mikroskop (figur 3D). CAV-1-positive caveolære vesikler blev identificeret under TEM ved immunogold-mærkede CAV-1-antistoffer (sorte prikker; Figur 3E) inden for de retinale vaskulære endotelceller. Protokoller for in vivo-undersøgelserne kan fås ved henvendelse til Wang et al.24.

VEGF-behandling øger vaskulær permeabilitet i HRMEC'er målt ved trans-endotel elektrisk modstand (TEER)
Før der udføres EC-transcytoseassays, skal HRMEC'er dyrkes til fuld sammenløb, hvilket viser karakteristisk brostensmorfologi, som kan observeres under et lysmikroskop. Fuldcellekonfluens kan valideres ved måling af transendotelelektrisk modstand (TEER) (figur 4A), hvor aflæsninger når ~ 20 Ω · cm2 for sammenflydende HRMEC'er30, hvilket tyder på lave niveauer af paracellulær transport over monolaget gennem stramme eller mellemrumskryds. Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) blev brugt som et eksempel til at demonstrere TEER-måling. Behandling af HRMEC'er med VEGF reducerede signifikant TEER-niveauer, hvilket afspejler øget HRMEC-permeabilitet (figur 4B). Der blev også observeret en reduktion i TEER-værdier i kontrolceller, potentielt på grund af varigheden af dyrkning og flere målinger foretaget med forskellige tidsintervaller, der kan være skadelige for celler31.

Transport af Cy3-transferrin kan anvendes til at vurdere clathrinmedieret EC-transcytose i HRMEC'er
For clathrinmedieret EC-transcytose blev sammenflydende HRMEC'er dyrket på porøs membran inkuberet med fluorescerende (Cy3)-mærket transferrin for at detektere dets transport på tværs af EC'er (figur 5A). Dette assay udnytter det faktum, at transport af transferrin er en receptormedieret transcytoseproces. Cy3-transferrinendocytose (rød) blev observeret i HRMEC monolayer co-farvet med nuklear plet, DAPI (blå) (figur 5B), hvilket bekræfter dets optagelse i cellerne. Fluorescensintensiteten af (Cy3)-mærket transferrin kan kvantificeres fra billeder for at vurdere endocytoseprocessen og/eller måles fra mediet indsamlet fra brøndenes basolaterale kammer for at kvantificere niveauerne af clathrinmedieret transcytose27.

Wnt-signalvej regulerer caveolae-medieret EC-transcytose på tværs af HRMEC'er i et HRP-baseret assay
Tidligere har det vist sig, at Wnt-signalering regulerer MFSD2A-afhængig caveolae-medieret transcytose på tværs af retinale vaskulære EC'er for at opretholde iBRB24. Virkningerne af Wnt-modulatorer blev evalueret i et HRP-baseret in vitro-transcytoseassay (figur 6A). Fuldt sammenflydende HRMEC'er blev behandlet med Wnt-vejaktivatorer: Wnt3a-konditioneret medium (Wnt3a-CM) eller human rekombinant Norrin, med eller uden Wnt/β-catenin-signalhæmmer XAV939, og niveauerne af transcytosed HRP på tværs af HRMEC'er blev detekteret. Behandling med Wnt3a-CM eller Norrin afslørede signifikant nedsatte niveauer af transcytosed HRP, hvilket tyder på reduceret caveolar transcytose. Derudover viste kombineret behandling med Wnt-signalhæmmeren XAV939 opregulerede niveauer af transcytosed HRP i HRMEC'er, hvorved Wnt-aktivatorers virkninger på HRMEC-permeabilitet (figur 6B, C)24 blev udslettet.

Figure 1
Figur 1: Forskellige transportruter på tværs af retinal vaskulært endotel. Skematisk illustration, der viser forskellige ruter for molekylær flux på tværs af retinale mikrovaskulære endotelceller (RMEC'er). Transport over retinale vaskulære endotelceller inden for den indre blod-retinale barriere finder sted via to hovedveje: paracellulære og transcellulære veje, herunder transcytose. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Yemanyi et al.5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over transcytotiske vesikulære transportveje på tværs af endotelceller og deres respektive in vitro-vurdering . I endotelceller (EC'er) forekommer transcellulær translokation af makromolekyler gennem tre hovedtyper af vesikler: caveolar vesikler (50-100 nm), clathrinbelagte vesikler (70-150 nm) eller clathrinuafhængige makropinosomer (200-500 nm). Caveolae er kolbeformede, sfæriske, lipidrige mikrodomæner i plasmamembranen, der består af caveolin og cavins. Niveauer af transcytose gennem disse vesikler kan bestemmes ved fluorescensbaserede in vitro-assays i EF-kultur ved anvendelse af peberrodperoxidase (HRP) kombineret med fluorescerende substrat, fluorescerende mærket transferrin (Cy3-Tf) eller tetramethylrhodaminmærket bovinserumalbumin (TMR-BSA) til henholdsvis caveolae-medieret transcytose, clathrin-medieret transcytose og makropinocytose for at evaluere indre blod-retinal barriere (iBRB) permeabilitet. Mens hver vej har forskellige træk og transportmekanismer, kan overlappende funktion og stoftransport forekomme, især mellem caveolar transport og makropinocytose, begge er clathrin-uafhængige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Visualisering af EC transcytose i nethinden. (A) Lysmikroskopbillede viser et HRP-fyldt blodkarlumen fra en 3 måneder gammel vildtype (WT) muse retinal sektion, farvet med 3,3'-diaminobenzidin (DAB) (sort). HRP blev retro-orbitalt injiceret i WT-mus efterfulgt af øjenisolering og vævsindlejring. Tynde sektioner blev farvet med elektrontæt DAB-substrat til kolorimetrisk påvisning af HRP som mørkebrunt bundfald og afbildet under et lysmikroskop for at afsløre HRP i nethinden blodkar lumen. (B,C) Prøver blev derefter yderligere behandlet med transmissionselektronmikroskop (TEM) ultratynd sektionering for at visualisere HRP-holdige transcytotiske vesikler, der skildrer EC-transcytose på tværs af iBRB. TEM-billeder viser en retinal sektion af en 3 måneder gammel WT-mus med HRP-fyldt blodkar lumen og HRP-holdige vesikler i RMEC'er. (B) En lejlighedsvis stor vesikel afspejler potentielt makropinosomet (pilespids) inden for EC'er med tilstedeværelsen af røde blodlegemer (stjerne) på den lysende side. (C) Små vesikler er sandsynligvis caveolar vesikler (pilespidser). (D) Immunohistokemi co-farvning af CAV-1 antistof (grøn) og isolectin B 4 (IB4, rød, EC markør) demonstrerer lokalisering af CAV-1 i retinale blodkar i 3 måneder gamle WT musenethinden (DAPI, blå). (E) TEM-billede af immunogold-mærket CAV-1 (sorte prikker, pile) inden for nethinden EC'er; indsat viser et forstørret billede af en CAV-1 positiv caveolar vesikel. Forkortelser: HRP = peberrodsperoxidase; GCL = ganglioncellelag; IPL = indre plexiformlag; INL = indre nukleart lag; OPL = ydre plexiformlag; ONL = ydre nukleare lag; RPE = retinal pigmentepitel; E = endotelcelle; og L = lumen i blodkarret. Forstørrelse: (A, D) 20x. Skalastænger: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm og (C,E) 200 nm. Panel (E) blev tilpasset med tilladelse fra Wang et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Validering af fuldt sammenflydende HRMEC'er og øget vaskulær permeabilitet i HRMEC'er efter VEGF-behandling. (A) Skematisk diagram, der viser placeringen af elektroder i brøndenes apikale og basolaterale kamre til måling af transendotelelektrisk modstand (TEER) som en vurdering af vaskulær permeabilitet og integritet af cellemonolaget. (B) Graf, der viser TEER-registreringer af fuldt sammenflydende HRMEC'er med og uden forudgående behandling med vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF). Behandling med VEGF efter 18 timer (18 timer) resulterer i reduceret TEER i fuldt sammenflydende HRMEC'er31. s≤0,001. Panel (B) blev tilpasset med tilladelse fra Tomita et al.31. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: En skematisk illustration af clathrinmedieret EC-transcytoseassay i HRMEC'er ved hjælp af transferrin (Tf). (A) HRMEC'er blev dyrket til fuld konfluens på gelatinebelagte indsatser og serum sultet natten over ved 37 °C før analyse. Cellerne blev apikalt inkuberet med fluorescerende Cy3-konjugeret transferrin (Cy3-Tf) i 60 minutter ved 37 °C. Efter inkubation blev cellerne vasket intensivt med et frisk medium for at fjerne ubundet ekstracellulær Cy3-Tf. Indsatserne indeholdende frisk medium blev derefter overført til en ny plade indeholdende varmt medium i det basolaterale kammer, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 90 minutter for at frigive endocytosed Cy3-Tf. Mediet fra det basolaterale kammer kan opsamles, og fluorescensintensiteten svarende til clathrinafhængig (Cy3-Tf) EC-transcytose kan måles ved hjælp af en fluorescenspladelæser. (B) Cy3-transferrin (rød) blev observeret i HRMEC'er farvet med DAPI (blå), hvilket bekræfter endocytose. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Wnt-signalering regulerer caveolae-medieret HRMEC-transcytose i et in vitro HRP-baseret assay. (A) Skematisk illustration, der viser det HRP-baserede assay til vurdering af caveolae-medieret transcytose. Fuldt sammenflydende HRMEC'er dyrket på gelatinebelagte indsatser blev serumsultet natten over i 0,5% føtalt bovint serum (FBS) + EBM-medium ved 37 °C før behandling. EF-monolaget i det apikale kammer blev behandlet med den ønskede behandling i 24 timer ved 37 °C. Derefter blev cellerne inkuberet med peberrodperoxidase (HRP) ved 37 ° C i 15 minutter og vasket intensivt for at fjerne fri ekstracellulær HRP. Indsatser indeholdende frisk medium blev derefter overført til en ny plade indeholdende varmt medium i basolaterale kamre, og cellerne blev inkuberet i yderligere 90 minutter ved 37 ° C. Mediet fra det basolaterale kammer blev opsamlet, og HRP-niveauerne blev kvantificeret ved reaktion med fluorogent peroxidasesubstrat. Fluorescens svarende til caveolae-medieret EC-transcytose blev målt ved hjælp af en fluorescenspladelæser. (B,C) I dette eksempel blev celler behandlet med Wnt-vejmodulatorer: Wnt3a-konditioneret medium (Wnt3a-CM) eller dets kontrolkonditionerede medium (Ctrl-CM), humant rekombinant Norrin eller dets kontrolopløsning (Ctrl) og med eller uden Wnt/β-catenin-signalhæmmer (XAV939) eller dets køretøjskontrol (køretøj). Deres virkninger på HRMEC caveolar transcytose blev evalueret i det HRP-baserede assay. Efter behandling blev niveauerne af HRP overført til det basolaterale kammer målt, hvilket indikerer caveolae-medierede EC-transcytoseniveauer på tværs af HRMEC'er. Wnt-aktivatorer reducerede niveauerne af den HRP-baserede transcytose, som blev vendt af XAV939. * s≤0,05, ** s≤0,01. Paneler (B) og (C) blev tilpasset med tilladelse fra Wang et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BRB spiller en væsentlig rolle i retinal sundhed og sygdom. In vitro-teknikker, der vurderer vaskulær permeabilitet, har vist sig at være afgørende værktøjer i undersøgelser vedrørende barriere (BRB / BBB) udvikling og funktion. Den her beskrevne procedure kan anvendes til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for EC-transcytose eller evaluere relaterede molekylære modulatorer, der påvirker BRB-permeabiliteten. In vitro EC transcytose assays har flere fordele i forhold til in vivo assays eller teknikker, der anvendes til evaluering af vaskulær permeabilitet. De er hurtige til at udføre med høj gennemstrømning og kan bruges til at analysere virkningerne af mange forskellige variabler eller isolerede molekyler af specifikke signalveje med både genetisk og farmakologisk modulering. Det rene EF-kultursystem udsletter dyrevariation, som det ofte observeres in vivo, og begrænser også virkningerne af mulig modifikation eller endocytose af målmolekylerne af andre celletyper32. Håndtering af HRMEC-celler er let og kræver grundlæggende cellekulturudstyr, der er tilgængeligt i de fleste laboratorier, og cellekultur er ofte mere omkostningseffektiv sammenlignet med in vivo-dyreforsøg. Selvom in vitro-transcytoseassays ikke fuldt ud replikerer de in vivo fysiologiske tilstande33, kan de være værdifulde værktøjer til at supplere in vivo-undersøgelser og fremme vores viden om BRB-kontrol.

Flere vigtige tekniske parametre kræver overvejelse, herunder filterindsatsens porestørrelse, typen af underlag og cellesåtætheden. En større porestørrelse af de permeable filterindsatser kan resultere i uønsket migration og vækst af celler på undersiden af indsatsen, hvilket forvirrer den resulterende måling og dens fortolkning. Mens denne tilbøjelighed kan variere med de forskellige celletyper, tjener porediametre ≤1 μm godt for de fleste celletyper, inklusive EC'er34. Valget af et passende underlag er et andet afgørende skridt, fordi nogle celler viser højere polaritet og større differentiering, når de dyrkes på porøst underlag og bades i et kulturmedium på begge sider35,36. Behandlede mikroporøse polycarbonatfiltre er et bedre alternativ til EC'er, fordi de er tyndere og giver større adgang for reagenserne til monolagets basolaterale zone med minimal baggrundsfluorescens for immunoassays35. Endelig skal cellesåtætheden optimeres baseret på den specifikke celletype for at opnå et fuldt sammenflydende monolag. Mens for lav såtæthed kan påvirke differentieringstilstanden, kan for høj såtæthed på den anden side favorisere hurtigt fastgørende celler, der danner flere cellelag i stedet for et monolag, hvilket til sidst ændrer den cellulære morfologi og resulterer i unøjagtig transcytosemåling37.

Dannelsen og integriteten af EF-monolaget er afgørende for dette assay og kan valideres ved at måle TEER-værdier for at sikre opnåelsen af den ønskede TEER. En blindkontrol, dvs. en filterindsats uden celler, skal altid inkluderes for at måle de basale modstandsniveauer over den permeable membran, der skal trækkes fra dem fra celleindsatser. Forskellige faktorer såsom temperatur, cellepassagenummer, sammensætningen af kulturmedium, kulturvarighed og krydslængdeændringer kan alle forårsage mindre variationer i TEER-værdier 25,38,39. TEER-værdier påvirkes også i høj grad af visse behandlinger, såsom VEGF. VEGF blev oprindeligt opdaget som en potent inducer af karpermeabilitet40 og påvirker vaskulær permeabilitet ved at regulere paracellulær transport, dvs. gennem fosforylering af tætte krydsproteiner ZO-1, occludin og forstyrrelse af tæt krydsprotein claudin-5 41,42 såvel som transcellulær transport 43 . Yderligere validering af monolagsdannelse kan udføres med morfologisk undersøgelse og tilstedeværelsen af karakteristiske krydsproteiner med farvning. I hele kulturen anbefales det at skifte medier i både de apikale og basolaterale kamre med jævne mellemrum for at holde cellerne i den optimale kulturtilstand med det ideelle pH-område og næringsstoftilgængelighed.

Forskere, der bruger dette assay, bør være opmærksomme på et kritisk iboende træk ved hjerne- og retinale EC'er: apicobasal polaritet, som er et cellulært kendetegn ved BBB44 og tilsvarende BRB. Transcytoseretningen bestemmes af den relative fordeling af proteinmålreceptorer af interesse og det tilhørende transcytosemaskineri i de apikale / luminale vs. basolaterale / abluminale domæner i EC-membranen. Hjerne- og retinale EC'er er i stand til at frigive mange faktorer fra både apikale / luminale og basolaterale / abluminale membraner44. Clathrinafhængig transcytose af transferrin synes interessant nok at forekomme for det meste ensrettet fra blodsiden til hjernen eller nethinden, da transferrinreceptorer overvejende er placeret på den apikale / luminale membran45. Caveolar transcytose forekommer derimod tovejs og kan stamme fra enten den apikale / luminale eller basolaterale / abluminale membran og over til den anden side afhængigt af lokaliseringen af vesikellast og deres receptorer46. MFSD2A, en transmembranlipidreceptor (til omega-3 fedtsyre docosahexaensyre) og suppressor af caveolar transcytose, er også placeret på de apikale / luminale domæner af ECs23,47. Udtrykket af MFSD2A reguleres transkriptionelt af Wnt-signalering for at mægle dets indvirkning på BRB-kontrol, som illustreret som et eksempel i denne protokol24. Den teknik, der er beskrevet her, involverer derfor påvisning af et spormolekyle placeret på det øvre / apikale kammer efter optagelse af EC-monolaget og frigivelse i bunden / basolateralt kammer, der efterligner transcytose i den apikale / luminale / blod til basolateral / abluminal / vævsretning. Denne protokol kan ændres til at detektere transcytose i den modsatte retning ved at placere spormolekyler i det nederste kammer og overvåge optagelse og frigivelse i det apikale kammer, så det passer til efterforskernes behov. Desuden vil et yderligere trin til bestemmelse af intracellulær akkumulering / nedbrydning af det endocytoserede sporstofbundne målmolekyle om nødvendigt give yderligere måling af transcytotiske vesikler, der forbliver i cytosolen32.

Det beskrevne assay har mange fordele og fungerer som et vigtigt redskab i BRB / BBB-relaterede undersøgelser, men der er et par begrænsninger. Det er et isoleret system uden interaktioner fra andre celletyper af iBRB, såsom pericytter og gliaceller, og kunne derfor ikke ligefrem efterligne det fysiologiske in vivo-miljø. TEER-værdier kan variere mellem målinger på grund af en temperaturændring eller placering af elektroderne 25,38. Men at ligevægte cellerne fra 37 °C til stuetemperatur før målinger, omhyggelig håndtering af elektroderne og inkludering af blanke kontroller kan hjælpe med at minimere udsvingene. Derudover, selv med tilstrækkelig vask, kan lækage fra den paracellulære rute, selvom det er i en spormængde, ikke udelukkes fuldstændigt. Overlapning af HRP-transport mellem forskellige transcytoseruter, for eksempel mellem caveolar transport og makropinocytose, begge er clathrin-uafhængige, kan også forekomme. Efter behov kan sondringen undersøges yderligere ved hjælp af specifikke modulatorer og / eller hæmmere af caveolae og mikropinocytose.

Sammenfattende beskriver dette papir et in vitro-transcytoseassay, der muliggør kvantificering af caveolae- eller bærermedieret transcytose på tværs af BRB / BBB. In vitro-analysen kan være til stor hjælp ved screening af forskellige pro-/anti-angiogene molekyler31, signalvejsmodulatorer24 eller lægemiddelafgivelsessystemer27,48 vedrørende BRB/BBB-kontrol. Undersøgelse af EC-polaritet og retningstranscytose kan også drage fordel af dette brugervenlige system. I betragtning af den begrænsede tilgængelighed af in vitro-modeller til iBRB- og okulær forskning kan den procedure, der er skitseret her, også ændres som et samkultursystem sammen med pericytter, astrocytter og 3-D organotypiske kulturer49 eller ved hjælp af avancerede cellebaserede modeller som mikrofysiologiske neurovaskulære systemer50 for yderligere at undersøge cellulære interaktioner og bedre efterligne fysiologiske tilstande in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter eller økonomiske interesser at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud (R01 EY028100, EY024963 og EY031765) til JC. ZW blev støttet af et Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Medicin udgave 184 Blod-retinal barriere caveolae endotelceller transcytose Wnt
Endotelcelletranscytoseanalyse som en <em>in vitro-model</em> til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F.,… More

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter