Summary
Ici, un protocole étape par étape optimisé est fourni pour la fixation, l’immunocoloration et la coupe des embryons afin de détecter des filopodes de signalisation spécialisés appelés cytonèmes dans le développement de tissus de souris.
Abstract
La structure des tissus développementaux et l’homéostasie des tissus postdéveloppementaux dépendent de la livraison contrôlée de signaux cellulaires appelés morphogènes. Les morphogènes agissent de manière dépendante de la concentration et du temps pour spécifier des programmes transcriptionnels distincts qui instruisent et renforcent le destin cellulaire. Un mécanisme par lequel des seuils de signalisation morphogène appropriés sont assurés est la livraison des protéines de signalisation par des filopodes spécialisés appelés cytonèmes. Les cytonèmes sont très minces (≤200 nm de diamètre) et peuvent atteindre des longueurs de plusieurs centaines de microns, ce qui rend leur préservation pour l’analyse d’images fixes difficile. Cet article décrit une méthode raffinée de manipulation délicate d’embryons de souris pour la fixation, l’immunocoloration et la section épaisse afin de permettre la visualisation de cytonèmes à l’aide de la microscopie confocale standard. Ce protocole a été utilisé avec succès pour visualiser des cytonèmes qui relient des compartiments de signalisation cellulaire distincts pendant le développement du tube neural de la souris. La technique peut également être adaptée pour détecter les cytonèmes à travers les types de tissus afin de faciliter l’interrogation de la signalisation développementale à une résolution sans précédent.
Introduction
Le développement embryonnaire est orchestré par l’activation coordonnée des voies de signalisation morphogène. Les morphogènes sont de petites protéines sécrétées qui sont classées dans les familles Sonic Hedgehog (SHH), transformant le facteur de croissance β (TGF-β) / protéine morphogénique osseuse (BMP), le site d’intégration lié sans ailes (WNT) et les fibroblastes et facteurs de croissance épidermique (FGF / EGF). Les morphogènes sont produits et libérés par les centres d’organisation cellulaire au cours du développement tissulaire et établissent des gradients de signalisation à travers les champs d’organisation des cellules pour informer la morphogenèse tissulaire 1,2,3,4,5. Une représentation des gradients morphogènes se trouve dans le système nerveux en développement, où le système nerveux central présumé est modelé par l’activation de la voie morphogène. Ce tissu, appelé tube neural, est composé de gradients opposés de SHH sécrétés par la notochorde et la plaque de plancher les plus ventrales, et de TWN / BMP sécrétés par la plaque de toit dorsale, pour modeler des régions progénitrices neurales distinctes6. Le tube neural est couramment utilisé pour interroger l’intégrité du gradient morphogène dans la recherche sur le développement.
La formation du gradient morphogène repose sur une régulation stricte de la dispersion du signal7. Un mécanisme cellulaire par lequel cela se produit est la formation de longs filopodes de signalisation appelés cytonèmes qui facilitent l’administration directe de morphogènes des cellules productrices de signaux à des populations cellulaires cibles spécifiques. On a observé que les cytonèmes s’étendent sur des centaines de micromètres pour déposer des morphogènes sur les membranes cellulaires réceptricesde signaux 8,9. La perturbation du transport des morphogènes médié par les cytonèmes entraîne des anomalies du développement chez les mouches et les vertébrés, soulignant leur importance lors de la modélisation tissulaire 10,11,12,13,14.
À ce jour, les cytonèmes ont été documentés dans des modèles de drosophiles, de poussins et de poissons-zèbres, mais l’imagerie des structures dans le développement d’embryons de mammifères reste difficile 8,9,15. Un obstacle à l’imagerie efficace des cytonèmes dans les tissus complexes des mammifères in situ est leur nature mince et fragile, ce qui les rend sensibles aux dommages causés par les méthodes de fixation conventionnelles8. Nous avions précédemment développé et optimisé des protocoles pour un fixateur de microscopie électronique modifié (MEM-fix) afin de préserver les cytonèmes dans les cellules cultivées et de permettre leur étude en utilisant la microscopie confocale16,17.
L’utilisation de la technique MEM-fix a permis d’identifier certaines des molécules impliquées dans la formation et la fonction 11,16,17 des cytonèmes induits par la SHH. Cependant, la confirmation de ces résultats dans le contexte physiologiquement pertinent de la formation de tubes neuronaux a nécessité le développement de nouvelles techniques pour fixer et imager le tissu embryonnaire de la souris. Un protocole visant à fixer les embryons de souris d’une manière qui préserve l’intégrité des cytonèmes et permet l’immunocoloration et la section ultérieure du tissu embryonnaire pour l’analyse confocale est décrit ici. Ce protocole a été développé à l’aide d’une protéine fluorescente verte (GFP) attachée à la membrane pour marquer les extensions membranaires des cellules productrices de SHH dans le tube neural en développement. La mise en œuvre de ce protocole répondra aux questions sans réponse concernant la prévalence et l’importance des cytonèmes dans le développement des systèmes mammifères.
Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices approuvées en matière de soins aux animaux du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et de l’Hôpital de recherche pour enfants St. Jude. Toutes les souches ont été rétrocroisées cinq générations à la souche C57BL/6J.
1. Isolement embryonnaire et coloration de montage entier
- Élevez des femelles de 6 semaines et surveillez la présence de bouchon vaginal.
- Euthanasier la mère enceinte par inhalation de CO2 dans une chambre au CO2 suivie d’une luxation cervicale selon les directives AVMA18. Faites une incision en Y dans la cavité péritonéale à l’aide de ciseaux et de pinces à disséquer. Exciser l’utérus contenant les embryons E9.5 conformément aux directives institutionnelles approuvées.
- Disséquer les embryons dans un milieu de croissance complet (milieu Eagle modifié de Dulbecco, complété par des acides aminés non essentiels, du Na-pyruvate, de la L-glutamine et 10% de sérum bovin fœtal). Utilisez une pince pour enlever le sac vitellin, le placenta et les membranes environnantes.
REMARQUE: Si nécessaire, conservez chaque sac vitellin pour le génotypage embryonnaire. - Rincez les embryons isolés dans la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank pour éliminer tout tissu amniotique résiduel et le sang.
- Préparez le fixateur. Ajouter le paraformaldéhyde (PFA) à l’HBSS pour obtenir une concentration de travail finale de 4 % de PFA.
ATTENTION : Le PFA est un produit chimique toxique, il faut donc éviter l’inhalation ou l’exposition directe de la peau. La préparation de la solution fixatrice est effectuée sous une hotte avec l’équipement de protection individuelle approprié de gants et d’une blouse de laboratoire. - Ajouter 1 mL de fixateur à chaque puits d’une plaque de 24 puits et placer chaque embryon dans un puits individuel. Incuber les embryons en fixateur pendant 45 min avec une légère agitation sur une bascule.
REMARQUE: Critique: Tous les lavages et incubations doivent être effectués avec une agitation douce (maximum 20 RPM) sur un basculeur ou un shaker circulaire, car une manipulation ou un mouvement brusque des embryons détruira les cytonèmes fixes. Utilisez une pipette pour retirer doucement toutes les solutions. - Retirez le fixateur et lavez les embryons 3 x 30 min dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Du Ca2+ et du Mg2+ avec 0,1% de Triton ajouté.
- Après le lavage, incuber les embryons dans une solution bloquante (PBS avec Ca2+ et Mg2+, 0,1% de Triton et 5% de sérum de chèvre) avec une agitation douce. Bloc 2 x 1 h. Après la deuxième incubation bloquante, effectuez un rinçage rapide des embryons à l’aide d’une solution de blocage fraîche.
- Au cours de la deuxième étape de blocage, préparez la solution d’anticorps primaire11. Diluer les anticorps à la concentration optimisée dans le PBS avec du Ca2+ et du Mg2+, 0,1 % de Tween-20 et 5 % de sérum de chèvre.
REMARQUE: Pour une visualisation améliorée de la GFP membranaire, l’anti-GFP de poulet (1:250) peut être utilisé. - Retirer la solution bloquante et ajouter 1 mL de solution d’anticorps primaires à chaque puits. Incuber à 4 °C avec une rotation douce pendant 3 jours.
- Après l’incubation primaire des anticorps, laver les embryons 5 x 1 h à 20 tr/min sur une bascule dans du PBS avec du Ca2+ et du Mg2+, du sérum de chèvre à 0,1 % de Tween-20 et 5 %.
- Préparer la solution d’anticorps secondaires à l’aide de fragments secondaires F(ab')2 à une dilution de 1:1 000 dans du PBS avec du Ca2+ et du Mg2+, du sérum de chèvre à 0,1 % de Tween-20 et à 5 %.
REMARQUE: L’utilisation de fragments de F(ab')2 améliore considérablement la pénétration des anticorps dans l’échantillon. - Ajouter 1 mL de solution d’anticorps secondaires à chaque puits. Incuber avec un léger balancement à 4 °C dans l’obscurité pendant 3 jours.
REMARQUE: Important: À partir de ce moment, minimisez l’exposition des embryons à la lumière directe. Facultatif : Pour prévenir la croissance bactérienne, ajoutez 0,2 % d’azoture de sodium à la solution d’anticorps secondaire. - Retirer la solution d’anticorps secondaire et laver les embryons 3 x 30 min dans du PBS avec du Ca2+ et du Mg2+, du sérum de chèvre à 0,1 % de Tween-20 et à 5 %. Si vous n’effectuez pas de coloration à l’actine avec de la phalloïdine ou d’autres colorants à base d’actine, après le premier lavage, ajouter le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) au PBS avec du Ca2+ et du Mg2+, du sérum de Tween-20 à 0,1 % et du sérum de chèvre à 5 % et incuber pendant 1 h, suivi de 3 lavages de 3 min comme décrit ci-dessus.
REMARQUE: À ce stade, les embryons peuvent être stockés pendant la nuit à 4 ° C dans PBS ou HBSS dans l’obscurité jusqu’à l’étape d’intégration le lendemain. Cependant, il est recommandé que les embryons soient incorporés et sectionnés immédiatement.
2. Intégration, sectionnement et montage d’embryons
- Préparer une solution d’agarose à 4 % p/v à faible point de fusion (LMP) dissoute dans hbss ou PBS avec du Ca2+ et du Mg2+ jusqu’à un volume final d’environ 3 mL par embryon. Ajouter le poids approprié d’agarose LMP à HBSS ou PBS avec Ca2+ et Mg2+ et micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose LMP soit dissoute.
REMARQUE: Une fois l’agarose LMP dissoute, stocker la solution dans un bain de perles, un incubateur ou un bain-marie réglé à 55 ° C pour empêcher la solution d’agarose LMP de se solidifier. - Utilisez une plaque de 12 puits comme moule d’intégration pour les embryons. Placez la plaque à 12 puits dans le bain de perles à 55 °C. Ajouter 2,5 à 3 mL d’agarose LMP à 4 % à chaque puits qui contiendra un embryon.
REMARQUE: Bien que d’autres moules puissent être utilisés, les volumes de plaques à 12 puits sont optimaux pour préparer le bloc d’agarose à des stades ultérieurs pour le sectionnement. - À l’aide d’une cuillère perforée, transférer les embryons dans des puits individuels contenant une solution d’agarose LMP à 4 % (figure 1A).
- Transférez la plaque de 12 puits du bain de perles sur une paillasse. Utilisez des embouts de pipette pour ancrer et orienter doucement l’embryon afin qu’il soit centré dans la solution. Une fois les embryons orientés, placez la plaque à -20 °C pendant 10 min pour permettre une solidification rapide du bloc.
CRITIQUE: Assurez-vous que l’embryon est positionné au centre du bloc. Les embryons qui s’enfoncent au fond ou qui sont trop près du bord de la moisissure seront probablement délogés du bloc d’agarose lors de la section.
- Transférez la plaque de 12 puits du bain de perles sur une paillasse. Utilisez des embouts de pipette pour ancrer et orienter doucement l’embryon afin qu’il soit centré dans la solution. Une fois les embryons orientés, placez la plaque à -20 °C pendant 10 min pour permettre une solidification rapide du bloc.
- Retirez tout le bloc d’agarose du puits à l’aide d’un scalpel et coupez un bloc rectangulaire autour de l’embryon en laissant environ 0,3 cm de bloc de chaque côté. Prévoyez une longueur supplémentaire le long de l’extrémité caudale de l’embryon. Lorsqu’il est monté sur le vibratome, orientez l’embryon en position verticale dans la partie supérieure du bloc (Figure 1B).
- Appliquez une bande de ruban adhésif sur le porte-échantillon du vibratome et supercollez le bloc d’agarose sur le ruban, orienté de sorte que la lame génère des sections axiales de l’embryon dans une séquence antérieure (crânienne) à postérieure.
- Remplissez la chambre vibratoire avec du HBSS froid pour vous assurer que l’échantillon est complètement immergé, puis entourez la chambre de glace.
- Réglez la vitesse du vibratome à 0,2 mm/s et la fréquence entre 5 et 7 (50-70 Hz) avec une épaisseur de coupe réglée sur 100 μm. Effectuer une coupe axiale en série de l’embryon.
REMARQUE: Utilisez une vitesse lente pour le sectionnement. Si la vitesse de coupe est augmentée au-dessus de 0,25 mm/s, la section peut déchirer l’embryon ou déloger l’embryon du bloc.- Pendant la série de sectionnement, utilisez des pinces pour transférer doucement les sections individuelles dans un plat séparé de 60 mm rempli de HBSS. Utilisez des pinces pour saisir le bloc, pas le tissu, afin d’éviter les dommages tissulaires et la destruction des cytonèmes.
REMARQUE: Les sections de tissus doivent rester dans le bloc d’agarose. Si le tissu tombe du bloc dans la chambre vibratomique, transférez doucement en soulevant la section. Ne saisissez pas ou ne pincez pas le tissu. CRITIQUE: Tout repliement de sections de tissus ou manipulation brusque détruira les cytonèmes fixes dans les sections de tissus.
- Pendant la série de sectionnement, utilisez des pinces pour transférer doucement les sections individuelles dans un plat séparé de 60 mm rempli de HBSS. Utilisez des pinces pour saisir le bloc, pas le tissu, afin d’éviter les dommages tissulaires et la destruction des cytonèmes.
- Si vous n’effectuez pas de coloration à la F-actine, passez à l’étape 2.10.
- Pour effectuer la coloration à la F-actine, retirez hbSS et incubez des sections pendant 40 minutes avec du rouge d’actine et une solution de DAPI diluée dans du PBS avec du Ca2+ et du Mg2+, du sérum de chèvre à 0,1% de Tween-20 et 5% à température ambiante.
- Laver les sections 3 x 20 min dans PBS avec Ca2+ et Mg2+ et 0,1% Tween-20.
- À l’aide d’un stylo marqueur hydrophobe, dessinez une barrière hydrophobe autour des bords d’une lame de microscope chargée et ajoutez un petit volume de HBSS pour remplir la zone.
- Utilisez une pince ou une cuillère perforée pour transférer des sections sur la glissière.
REMARQUE: Toutes les sections de tissu qui ne sont pas enfermées dans de l’agarose peuvent être transférées via une pipette de transfert. - Enlevez l’excès de bloc d’agarose à l’aide d’une pince.
- Une fois que toutes les sections ont été transférées sur la glissière, retirez l’excès de liquide par pipetage et le coin d’une serviette absorbante, puis ajoutez plusieurs gouttes de support de montage à la glissière. Utilisez suffisamment de support de montage pour couvrir toute la zone de glissement du couvercle lorsqu’il est durci. Montez le couvercle en le plaçant doucement sur la glissière.
REMARQUE: Évitez d’appliquer une pression ou de déranger le couvercle jusqu’à ce que le support de montage ait durci.
3. Imagerie
- Effectuer l’imagerie de coupes de tissus sur n’importe quel microscope confocal ou à résolution supérieure11. Analyser un minimum de trois embryons par génotype.
REMARQUE: Des images de coupes de tissus ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal TCS SP8 STED 3x, suivi d’une déconvolution LIGHTNING.
Representative Results
L’utilisation d’un moule plus grand d’une plaque de 12 puits avec 2,5 à 3 mL de solution d’agarose par puits était idéale pour l’incorporation et la suspension de plusieurs embryons sur une courte période de temps (Figure 1A). La surface excédentaire permet une orientation correcte lors de la coupe du bloc d’agarose pour le sectionnement. Lors de la coupe du bloc d’agarose, il est important de maintenir l’excès d’agarose le long du fond du bloc où il sera collé au ruban adhésif sur le support de l’objet. L’embryon doit se trouver dans la moitié supérieure du bloc (figure 1B). Cependant, la section inférieure ne doit pas être trop grande car l’excès de bloc augmente les chances de modifier l’angle de coupe lorsque la lame pousse dans le bloc pendant la section. Des exemples de sections correctement orientées sont présentés (Figure 1C,D).
Lors du développement de ce protocole, la section du vibratome a été comparée à la section du cryostat. La section cryostatique du tissu a rarement préservé les extensions cellulaires (Figure 2 cryostat et Figure 3A,B vibratome). Les sections de cryostat ont permis de détecter certains fragments de membrane GFP positifs entre les cellules de la notochorde et du tube neural (figure 2A pointe de flèche) et entre les cellules du tube neural adjacentes (figure 2B, pointes de flèche B). Cependant, la coloration à la F-actine des extensions cellulaires dans les cellules mésenchymateuses hautement filamenteuses entourant le tube neural a été altérée dans les sections de cryostat (Figure 2C, flèche C ', vs Figure 3C, D). Ces résultats de cryostat indiquent qu’il ne reste que quelques traces d’extensions cellulaires brisées en suivant cette méthode. Ainsi, la section vibratome est préférée pour préserver efficacement ces extensions délicates pour une analyse ultérieure.
Une perturbation minimale de l’embryon entier et des sections de tissus individuelles est essentielle pour une imagerie de haute qualité des extensions cellulaires. Les coupes tissulaires qui ont subi un pliage ou un flambage seront évidentes par l’absence de la notochorde ou d’une grande séparation (>30 μm) entre la notochorde et la plaque de plancher ventral du tube neural (figure 3B). Cela s’accompagne généralement d’une perte de cellules mésenchymateuses qui entourent normalement le tube neural (Figure 3A, flèche). Les sections endommagées entraîneront également une perte d’extensions de membrane cellulaire visibles migrant entre les cellules épithéliales (figure 3B par rapport à la figure 3A, pointes de flèche). Même des distorsions mineures des sections peuvent entraîner une fragmentation des extensions à base d’actine et la formation de grands espaces entre les cellules (figure 3D, pointes de flèche, par rapport à la figure 3C bien conservée), soulignant la nécessité d’une manipulation délicate à toutes les étapes.
Figure 1 : Exemple de E9.5 Shh-Cre ; Rosa26 mTmG embryon coloré, incorporé et sectionné. (A) Un seul embryon dans une plaque de 12 puits, incorporé dans 4 % d’agarose PMT. (B) Exemple d’embryon correctement orienté dans le bloc d’agarose coupé à la taille pour le montage du vibratome. L’excès de bloc d’agarose est présent le long du fond. (C) Image en champ lumineux d’une section embryonnaire de 100 μm d’épaisseur incorporée dans l’agarose PMT. (D) Imagerie par immunofluorescence d’une section après élimination de l’agarose. La mGFP anti-GFP colorée (vert) représente les cellules exprimant Shh dans le tissu, avec d’autres lignées cellulaires exprimant la membrane Tomato (rouge), DAPI en bleu. Le tube neural (support) et la notochorde mGFP-positive (flèche) sont clairement visibles. Barres d’échelle = 1 cm (A), 5 mm (B) et 100 μm (C,D). Abréviations: LMP = point de fusion bas; mGFP = protéine fluorescente verte membranaire; Shh = Hérisson sonique; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemple de plaque de plancher de tube neural sectionnée par cryostat et de notochorde avec extensions de membrane fragmentées. (A) 20 μm d’épaisseur E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 19,20,21 section colorée pour GFP (vert), F-actine (rouge) et DAPI (bleu). Les ponctuations mGFP sont visibles entre la notochorde et la plaque de plancher (pointe de flèche) et (B,B') migrant entre les cellules adjacentes du tube neural. (C,C') La coloration à la F-actine ne permet pas de détecter les cytonèmes clairs sur les cellules mésenchymateuses entourant le tube neural (flèche). Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : mGFP = protéine fluorescente verte membranaire ; Shh = Hérisson sonique; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Exemples de coupes optimales et sous-optimales de tissu vibratome et de coloration de la plaque de plancher du tube neural, de la notochorde et des cellules environnantes. Exemples de sections délicatement manipulées (A, C), comparées à (B) une section de tissu pliée et (D) une section mal manipulée d’un Shh-Cre; Rosa26 mTmG et un embryon ShhGFP/+ 19,20,21. Les sections manipulées de manière optimale permettent la détection de cytonèmes entre les cellules épithéliales neurales de la plaque de plancher adjacentement localisées (A, pointes de flèche). Les cellules notochordes adjacentes du tube neural (A, exprimant la mGFP) et mésenchymateuses (A, flèche) doivent être visibles. (C,D) Les sections colorées à la F-actine et au DAPI doivent avoir un espacement constant des cellules mésenchymateuses et des cytonèmes (flèches) à base de F-actine entourant le tube neural et la notochorde (C). Tout pliage mineur ou perturbation des sections peut causer des lacunes et des fragments de F-actine cassés (D, pointes de flèche). Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : mGFP = protéine fluorescente verte membranaire ; Shh = Hérisson sonique; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce protocole a été développé pour la préservation de cytonèmes délicats dans des coupes de tissus embryonnaires pour la microscopie à fluorescence à haute résolution. À ce jour, la visualisation des cytonèmes dans les tissus de divers organismes modèles repose en grande partie sur l’expression ectopique de protéines marquées par fluorescence à l’aide de l’imagerie tissulaire vivante. Malheureusement, l’utilisation de l’imagerie vivante marquée par fluorescence est rarement propice à l’analyse de protéines exprimées de manière endogène, peut introduire des contraintes de temps et nécessite des étapes d’imagerie et des microscopes spécialisés. La méthode de coloration et de sectionnement décrite ici préserve les cytonèmes et autres extensions cellulaires pour permettre l’immunohistochimie pour la détection éventuelle de protéines exprimées de manière endogène. Cette technologie facilitera de nouvelles connaissances sur la façon dont les morphogènes sont transportés à travers différents tissus in vivo et élargira la portée des systèmes modèles où les cytonèmes peuvent être étudiés.
Ce protocole utilise la coloration à montage entier et la section épaisse du vibratome, ce qui évite l’utilisation de solutions d’équilibrage telles que le glycérol ou de solutions cryoprotectrices telles que le saccharose. Il vise à minimiser la manipulation des tissus sectionnés pour permettre la préservation maximale des extensions cellulaires. La réduction de la manipulation du tissu après le sectionnement a fourni de meilleurs résultats constants dans la préservation globale des cytonèmes. Ainsi, la section de l’embryon est l’une des dernières étapes avant l’imagerie.
MEM-fix, une technique de fixation développée pour la préservation des cytonèmes des cellules cultivées, consiste en une combinaison de glutaraldéhyde et de PFA qui permet une meilleure préservation 3D de l’architecture cellulaire innée comparable à leurs dimensions vivantes16,17. Malheureusement, MEM-fix n’était pas utile pour la fixation des embryons car le glutaraldéhyde peut s’autofluorer et limite considérablement la pénétration des anticorps et la liaison à l’épitope dans les cellules en raison de l’activité élevée de réticulation des protéines22,23. Ainsi, les protocoles de sectionnement après les conditions de fixation du PFA ont été optimisés pour permettre la préservation des extensions cellulaires dans les tissus embryonnaires. Bien que le PFA puisse préserver des extensions de type cytonème dans les tissus embryonnaires, l’analyse d’image doit être effectuée avec prudence. Le PFA peut provoquer une déshydratation partielle des cellules et des tissus individuels, entraînant une réduction mineure du volume et la formation de petits espaces extracellulaires dans le tissu fixe.
Ce protocole évite les étapes supplémentaires de la résaturation du saccharose pour la cryoprotection et l’élimination des tissus car les solutions de saccharose ou de glycérol peuvent provoquer une résaturation mineure du tissu24. L’enflure mineure qui en résulte peut détruire les extensions cellulaires fixes et les cytonèmes qui migrent entre les cellules et à travers les tissus. Cela était évident lorsque l’on comparait le vibratome à section épaisse aux sections de cryostat. Bien que l’augmentation de l’épaisseur des tissus ait amélioré la préservation des cytonèmes intacts, les sections de cryostat résaturés au saccharose présentaient systématiquement une incidence plus faible de cytonèmes détectables.
L’optimisation de ce protocole a révélé que des sections de 100 μm d’épaisseur étaient les meilleures pour assurer la préservation des cytonèmes intacts. Les sections plus minces sont généralement utilisées pour l’imagerie, car la plupart des microscopes confocaux ne sont capables d’imager qu’à une résolution suffisante pour visualiser les extensions cellulaires à une profondeur d’environ 20 à 40 μm sans effacer25. Cependant, les forces mécaniques et la distorsion appliquées aux cellules embryonnaires à partir de la lame lors de la coupe de sections minces détruisent les cytonèmes. Les sections plus épaisses permettent une plus grande profondeur dans la section tout en préservant les extensions intactes dans le tissu. De plus, l’utilisation de sections plus épaisses permet une manipulation facile pour éviter un pliage excessif ou un flambement des sections de tissus.
Ce protocole a été optimisé pour la préservation maximale des cytonèmes dans les tissus des embryons de souris E8-10.5. Une manipulation minimale du tissu après la coupe a permis d’améliorer constamment la conservation globale des cytonèmes. Il est probable qu’une optimisation supplémentaire sera nécessaire pour adapter la technique aux stades de développement ultérieurs et aux coupes de tissus adultes en raison de l’augmentation de la taille et de la complexité des tissus. Cela nécessitera une section suivie d’une coloration par immunofluorescence. Un tel tissu peut nécessiter des étapes de nettoyage supplémentaires et une adaptation de la manipulation des tissus pendant la section pour préserver les extensions de type cytonème. Ces étapes supplémentaires devront être envisagées et traitées pour les applications futures de ce protocole.
Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.
Acknowledgments
Les images ont été acquises à l’aide de microscopes entretenus par le noyau d’imagerie de biologie cellulaire et moléculaire de l’Hôpital de recherche pour enfants St. Jude. Des souches de souris ont été obtenues à partir de JAX. Ce travail a été soutenu par la subvention R35GM122546 (SKO) des National Institutes of Health et par l’ALSAC de l’hôpital de recherche pour enfants St. Jude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F.
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
