Summary
このプロトコルは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を、シンプルなラボスケールのベンチトップ設定で分離する方法を示しています。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、sEVマーカー、および形態は、それぞれナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡によって特徴付けられます。
Abstract
超遠心分離ベースのプロセスは、小さな細胞外小胞(sEV)単離の一般的な方法と考えられています。ただし、この分離方法からの収率は比較的低く、これらの方法はsEVサブタイプの分離に非効率的です。この研究は、ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を分離するための簡単なベンチトップろ過方法を示し、hUC-MSCの馴化培地から限外ろ過によって分離することに成功しました。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、エキソソームマーカー(CD9、CD81、TSG101)、および形態を、ナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡でそれぞれ特徴付けました。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズは30-200 nmで、粒子濃度は7.75 ×10 10 粒子/mL、タンパク質濃度は80 μg/mLでした。エキソソームマーカーCD9、CD81、およびTSG101の陽性バンドが観察された。この研究は、hUC-MSC-sEVがhUC-MSCs馴化培地から首尾よく単離されることを示し、特性評価は、単離された製品が細胞外小胞の研究のための最小情報2018(MISEV 2018)で言及された基準を満たすことを示しました。
Introduction
MISEV 2018によると、sEVは、機能性核が存在しない非複製脂質二重層粒子であり、サイズは30〜200 nm1です。MSC由来のsEVには、マイクロRNA、サイトカイン、タンパク質など、組織再生に重要な役割を果たす重要なシグナル伝達分子が含まれています。それらはますます再生医療と無細胞治療の研究「ホットスポット」になっています。多くの研究により、MSC由来のsEVは、免疫調節2,3,4,5、骨形成の増強6、糖尿病7,8、血管再生9,10などのさまざまな状態の治療においてMSCと同じくらい効果的であることが示されています。初期段階の試験が進むにつれて、MSC-EVの臨床翻訳に関連する3つの主要な重要な問題が強調されています:EVの収量、EVの純度(細胞破片やタンパク質やサイトカインなどの他の生物学的汚染物質を含まない)、および分離後のEVのリン脂質二重膜の完全性。
sEV11の密度、形状、サイズ、および表面タンパク質を利用して、sEVを分離するためのさまざまな方法が開発されています。sEVの分離で最も一般的な2つの方法は、超遠心分離ベースと限外ろ過ベースの技術です。
超遠心分離ベースの方法は、EV分離におけるゴールドスタンダードの方法と見なされています。通常採用される2種類の超遠心分離技術は、示差超遠心分離および密度勾配超遠心分離である。しかし、超遠心分離法は収率が低く、高速超遠心分離機(100,000〜200,000 × g)には高価な装置を必要とすることがよくあります11。さらに、超遠心分離技術だけでは、EVサブタイプ(sEVおよび大型EV)を分離するのに非効率的であり、不純な堆積物層11をもたらす。最後に、密度勾配超遠心分離も時間がかかり、加速および減速ステップ12中のグラジエント損傷を抑制するためにスクロースバッファー添加などの追加の予防ステップを必要とする可能性があります。したがって、超遠心分離は通常、比較的低い収率をもたらし、EVの異なる集団を区別することができず13、大規模なEV調製への適用を制限する11。
EV単離の2番目の方法は、サイズろ過に基づく限外ろ過によるものです。限外ろ過は、高価な装置や長い処理時間を必要としないため、超遠心分離と比較して比較的時間と費用効果が高いです14。したがって、限外ろ過は、前述の両方の超遠心分離方法よりも効果的な単離技術であるように思われます。単離された生成物は、細孔サイズおよびより高い収率に基づいてより具体的にすることができる15。しかしながら、濾過プロセス中に発生する追加の力は、EV16の変形または噴火をもたらす可能性がある。
本論文では、MSC由来のsEVをダウンストリーム分析および治療目的で単離するための費用対効果と時間効率の高いベンチトッププロトコルを提案しました。この論文に記載されている方法は、単純なろ過方法とベンチトップ遠心分離を組み合わせて、粒子サイズ分析、バイオマーカーアッセイ、電子顕微鏡イメージングなどのダウンストリーム分析のために、hUC-MSCから高収率で高品質のEVを分離しました。
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Protocol
注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. ヒト臍帯間葉系幹細胞及び培養
- hUC-MSCをDMEM中で5 × 103/cm2 の播種密度で培養し、8%のヒト血小板ライセートと1%のペンストレプトを添加しました。細胞を5%CO2中で37°Cでインキュベートする。適切な細胞増殖を確実にするために、3日ごとに細胞培養培地を交換してください。
- 細胞をT175フラスコの継代5に展開して、sEV分離を行います。
注:高収量のsEVを収穫するには、多くのフラスコが必要です(収量は細胞数とともに増加します)。
2. hUC - MSCからの細胞外小胞の低単離
- 培養液が継代5で70%〜80%のコンフルエントに達したら、培養液を1%ペンストレプト[コンディショニング培地(CM)]を添加した新鮮なフェノールレッドフリーDMEMと交換します。
注意: 基礎メディアのみを使用してください。外部sEVによる汚染を避けるために、FBSおよびヒト血小板ライセートサプリメントは避けてください。 - 24時間後、CMを200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞破片を除去しました。上清を集めて0.22 μmのフィルターでろ過し、220 nmを超える粒子を除去します。
- 遠心フィルターユニットに、0.2 μmフィルターでろ過した30 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を満たします。遠心フィルターユニットを3,500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- ろ過したCMを遠心フィルターユニットに充填します(各ユニットの最大容量は70mLです)。CMを4°Cで3,500 × g で遠心分離します。
注意: 溶液がフィルターの表面に到達するまで、遠心分離の持続時間は時々監視する必要があります。 - ろ液溶液カップに溶液を捨てる。濃縮液回収カップでサンプルフィルターカップを1,000 x g、4°Cで2分間逆遠心分離します。
- 濃縮されたCMを遠心フィルターユニットに戻します。30 mLのろ過PBSを遠心フィルターユニットに加え、4°Cで3,500 × gでユニットを遠心分離します。
- ろ液溶液カップに溶液を捨てる。フィルターユニットに濃縮回収カップを取り付け、1,000 × g で4°Cで2分間逆遠心し、精製されたsEVを得ました。
- 0.22 μmのシリンジフィルターでsEVをろ過します。
- サンプルを新しいチューブに移し、さらに分析するために-80°Cで保管します。
3. hUC-MSC-sEVの特性評価
- ナノ粒子追跡解析
- 分離されたhUC-MSC-sEVをろ過されたPBSで20〜100粒子/フレームに希釈します。
- 1 mLの使い捨てシリンジを使用して、1 mLの希釈サンプルをNTAチャンバーに入れます。
- それに応じて測定設定を設定します:カメラレベルをレベル14に調整し、10〜100個の赤い十字がカウントされ、青い十字の数が5つに制限されるという制限で、できるだけ多くの粒子を含むように検出しきい値を決定します。
- 測定ごとに、5つの1分間ビデオを録画し、検出しきい値を5のNanoSightソフトウェアを使用して分析します。
- 各サンプルについて3回に分けて測定します。
- ウェスタンブロッティング分析
- hUC-MSC-sEVを氷冷放射免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーで溶解し、4°Cで30分間インキュベートし、200 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を集める。
- ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質を定量します。それに応じてゲル電気泳動セットを組み立て、タンパク質がスタッキングゲルの末端に達するまで90 Vでゲル電気泳動を実行します。電圧を200 Vに変更して、分解ゲルが終了するまでタンパク質を分離します。
- セミドライ転写を行い、タンパク質をゲルからポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に15 Vで1時間転写します。
- PVDFメンブレンを3%ウシ血清アルブミン(BSA)/トリス緩衝生理食塩水-0.1%v/v Tween 20(TBS-T)で室温のシェーカーで1時間ブロックします。PVDFメンブレンを一次抗体とともにインキュベートします:マウス抗CD9モノクローナル抗体(1:500)、マウス抗CD81モノクローナル抗体(1:500)、マウス抗GRP 94モノクローナルマウス抗TSG 101モノクローナル抗体(1:500)を4°Cで一晩、絶えず振とうします。
- 翌日、PVDFメンブレンをTBS-Tで5 x 5分間洗浄し、さらに二次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウスIgGカッパ結合タンパク質(m-IgGκ BP-HRP)(1:5,000)とともに室温で攪拌しながら1時間インキュベートします。
- 再度、PVDFメンブレンをTBS-Tで5回洗浄し、化学発光検出試薬を用いて電荷結合(CCD)イメージャーでメンブレンを可視化します。ImageJソフトウェアを使用してタンパク質の発現レベルを分析します。まず、ImageJで画像ファイルを開きます(ファイル|開く...)。明るさとコントラストを調整して画像の品質を向上させます(画像|調整 |明るさ/コントラスト)。しみがはっきりと見えるまで画像を調整し、[ 適用 ]ボタンをクリックしてから、画像をTIFF形式で保存します(ファイル|名前を付けて保存 |ティフ...)。
- 透過型電子顕微鏡
- hUC-MSC-sEVサンプル1部を4部のろ過PBSで希釈して総容量10 μLにし、炭素被覆銅グリッド上で15分間インキュベートします。
- 実験室用ワイプを使用して余分なサンプルを取り除き、3分間風乾させます。
- 10 μLの1%リンタングステン酸(PTA)溶液をインキュベートし、サンプルを3分間染色します。
- 実験室用ワイプを使用して余分な1%PTA溶液を取り除き、3分間風乾させます。
- 透過型電子顕微鏡イメージングに使用します。
注: 概略実験手順の概要については、 図 1 を参照してください。
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Representative Results
図2 は、hUC-MSC-sEVが53 nmで粒径モードを持っているのに対し、他の有意な粒径ピークは96 nmと115 nmであることを示しています。NTAによって測定されたhUC-MSC-sEVの濃度は、7.75 × 1010 粒子/ mLでした。BCAアッセイで測定したhUC-MSC-sEVのタンパク質濃度は約80 μg/mLでした。
ウェスタンブロッティング解析では、hUC-MSC-sEVはエキソソームマーカーCD9、CD81、およびTSG101で陽性のバンドを示しましたが、GRP94では陰性でした(図3)。GRP94は、sEVのネガティブマーカーとして一般的に使用される小胞体マーカーです。単離されたhUC-MSC-sEVをTEMで可視化し、サイズと形態を決定しました。hUC-MSCs-sEVは~100 nmの大きさで、カップ状の二分子膜構造を示しました(図4)。
図1:sEVの絶縁、クリーニング、および特性評価の作業回路図 馴化培地をMSC培養液から回収し、0.22 μmのフィルターでろ過して大きな粒子を除去しました。ろ過された媒体は遠心フィルターユニットに移されてsEVを濃縮し、逆遠心分離して濃縮されたsEVを回収しました。次に、濃縮されたsEVを冷たくろ過したPBSで再懸濁し、洗浄ステップのために遠心フィルターユニットでステップを繰り返しました。最後に、sEVを0.22μmのろ過で滅菌してから、ナノ粒子追跡分析、ウェスタンブロッティング分析、および透過型電子顕微鏡を使用して特性評価しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単離されたhUC-MSC-sEVのナノ粒子追跡分析。 hUC-MSC-sEVは、清澄化PBSで100〜1,000倍希釈し、CMOSカメラ、20倍対物レンズ、青色レーザーモジュール(488 nm)、およびNTAソフトウェアを搭載したNanosight NS300を使用して測定しました。この図は、NTAを三重に表したものです。略語:hUC-MSC-sEV =ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞;NTA = ナノ粒子追跡分析;CMOS = 相補型金属酸化膜半導体。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:hUC-MSC-sEVのバイオマーカー発現 。 (a)CD9エキソソーム陽性マーカーのウェスタンブロット解析。(B)CD81エキソソーム陽性マーカーのウェスタンブロット解析。(C)TSG101エキソソーム陽性マーカーのウェスタンブロット解析。(D)GRP94陰性マーカーのウェスタンブロット解析。4つのマーカー全てを、対照として細胞ライセートと比較した。左から右へ、ラダー、細胞ライセート、hUC-MSC-sEV(A、B);ラダー、hUC-MSC-sEV、細胞ライセート、hUC-MSC-sEV、細胞ライセート(C);ラダー、細胞ライセート、hUC-MSC-sEV(D)。細胞ライセート対は2回の反復からのものであり、これらの画像は3連で行われた実験からの代表的な画像である。略称:hUC-MSC-sEVs = ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:透過型電子顕微鏡下での単一hUC-MSC-sEVの形態。 hUC-MSC-sEVを炭素被覆銅グリッド上でインキュベートし、1%リンタングステン酸で染色してから透過型電子顕微鏡で観察した。約100 nmのhUC-MSC-sEVは、カップ状の二分子膜構造を示した。スケールバー= 100 nm。この画像は、3つの独立したキャプチャの代表です。略称:hUC-MSC-sEVs = ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
EVは、MSCのセクレトームの重要なサブセットの1つであり、正常および病理学的プロセス中に重要な役割を果たします。しかし、サイズ範囲が30〜200nmのsEVは、過去10年間で無細胞治療の潜在的なツールとして台頭しています。MSCからsEVを分離するために、さまざまな技術が開発されました。しかしながら、示差超遠心、限外濾過、ポリマーベースの沈殿、免疫親和性捕捉、およびマイクロ流体ベースの沈殿は、異なる長所と短所を有する17。これらの単離技術のいずれも、高い回収率および特異性を達成することはできません。したがって、研究者は、高い回収率または高い特異性に基づいて、好みに応じて適切な方法を選択する必要があります。
間葉系幹細胞のsEVを単離する前に、MSCは、前述のようにフローサイトメトリーによって陽性表面マーカー(CD90、CD105、CD73)および陰性マーカー(CD34、CD11b、CD19、CD45、およびHLA-DR)について評価されました18。このsEV研究の技術的利点は、現在の状況に対する解決策を提供する可能性があります。実験室に基本的なベンチトップを設置するだけで、ハイエンド機器を使用してsEVを隔離することを回避できます。MSCは、血清を添加することなく、記載されたプロトコルの培地で飢餓状態にしました。これは、血清補給に起因するEVの汚染を防ぐために重要です。しかし、血清サプリメントが避けられない場合があることを考慮すると、完全な培地を処方する際には、エキソソーム枯渇血清サプリメントを検討することができます。さらに、フェノールレッドフリー培地は、この一般的なpHインジケータが比色測定に問題を引き起こす可能性があるため、標準的な培地の代わりに使用できます15。プロトコルは、220nmを超える粒子の除去中に、従来のシリンジフィルターの代わりに0.22μmポンプフィルターを使用することで改善できます。sEVの歩留まりを向上させるために予防措置を講じる必要があります。遠心フィルターユニットを介したCMの最後の遠心分離では、フィルターからsEVを溶出するのに十分な量の溶液があることを確認するために、長時間の遠心分離を避ける必要があります。これを見落とすと、逆遠心分離ステップ中に収集されたsEVの歩留まりが低下する可能性があります。
このプロトコルは実験室規模に限定されているため、産業界での大規模な分離には適さない場合があります。これは、遠心フィルターユニットの1回限りの使用のコストが高いためであり、これは一般に最大数千リットルのCMの容量を伴う大規模な分離には実行不可能である。要約すると、MSCに由来するsEVを分離するためのシンプルなベンチトップスケールのろ過プロトコルを提供します。このプロトコルは、さらなるダウンストリーム分析のために単離されたsEVを精製するのにも適しています。このプロトコルはMSC由来のsEV用に特別に設計されていますが、記載されたプロトコルの一部を使用して、体液、細胞株、またはその他の液体タイプの供給源などのさまざまなソースからsEVを分離できます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
このビデオの公開は、My CytoHealth Sdn. Bhdによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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