यह प्रोटोकॉल एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) की कमी वाले चूहों में एंजियोटेंसिन द्वितीय रिलीज द्वारा पेट महाधमनी धमनीविस्फार को प्रेरित करने के लिए एक आसमाटिक पंप के लगातार आरोपण का वर्णन करता है और बार-बार दवा उपचार के लिए एक गले की नस कैथेटर के साथ एक संवहनी पहुंच बंदरगाह का वर्णन करता है। पृष्ठीय प्रत्यारोपण के बावजूद 3 डी अल्ट्रासाउंड द्वारा धमनीविस्फार विकास की निगरानी प्रभावी ढंग से आयोजित की जाती है।
चूंकि उदर महाधमनी धमनीविस्फार (एएए) के नैदानिक प्रबंधन में दवा उपचार विकल्पों की कमी है, इसलिए पशु मॉडल, विशेष रूप से माउस मॉडल, रोग रोगजनन की समझ को आगे बढ़ाने और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू होते हैं। इन मॉडलों में एएए वृद्धि को अवरुद्ध करने के लिए उपन्यास दवा उम्मीदवारों का परीक्षण आम तौर पर प्रयोग के समय के दौरान बार-बार दवा प्रशासन की आवश्यकता होती है। यहां, हम एएए प्रेरण के लिए एक संकलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, लंबे समय तक चिकित्सा की सुविधा के लिए एक अंतःशिरा कैथेटर का सम्मिलन, और 3 डी अल्ट्रासाउंड द्वारा धारावाहिक एएए निगरानी। एन्यूरिज्म एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) की कमी वाले चूहों में एंजियोटेंसिन द्वितीय रिलीज द्वारा 28 दिनों में आसमाटिक मिनी-पंपों से माउस बैक में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है। इसके बाद, बाहरी गले की नस कैथीटेराइजेशन के लिए सर्जिकल प्रक्रिया एक चमड़े के नीचे संवहनी पहुंच बटन के माध्यम से दैनिक अंतःशिरा दवा उपचार या दोहराया रक्त नमूनाकरण के लिए अनुमति देने के लिए आयोजित की जाती है। दो पृष्ठीय प्रत्यारोपण के बावजूद, एएए विकास की निगरानी को अनुक्रमिक अर्ध-स्वचालित 3 डी अल्ट्रासाउंड विश्लेषण द्वारा आसानी से सुविधाजनक बनाया जाता है, जो महाधमनी व्यास और मात्रा के विस्तार और धमनीविस्फार आकृति विज्ञान पर व्यापक जानकारी देता है, जैसा कि प्रयोगात्मक उदाहरणों द्वारा सचित्र है।
एक पेट महाधमनी धमनीविस्फार (एएए) महाधमनी की दीवार में भड़काऊ और ऊतक-विनाशकारी प्रक्रियाओं के कारण एक पोत का एक रोग फैलाव है जो अंततः टूटना और रोगी की मृत्यु का कारण बन सकता है। सर्जिकल एएए मरम्मत में काफी उपलब्धियों के बावजूद, धमनीविस्फार विस्तार की प्रगति को अवरुद्ध करने और संभावित रूप से टूटने के जोखिम को कम करने के लिए एक रूढ़िवादी दवा उपचार आज तक गायब है। रोग के ट्रिगर्स और मध्यस्थों को स्पष्ट करने और चिकित्सा के लिए उपन्यास दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए पशु मॉडल विकसित किए गए हैं। एएए के माउस मॉडल व्यापक रूप से लागू होते हैं और मानव ऊतक से विभिन्न टिप्पणियों को कवर करते हैं। उनके रोगतंत्रवादी मतभेदों के कारण, अक्सर अणुओं / मार्गों के विशेष कार्य या संभावित चिकित्सीय दवाओं 1,2 की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए एक से अधिक मॉडल लागू किए जाते हैं। एएए प्रेरण के सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले मॉडलों में एंजियोटेंसिन-द्वितीय (एंग-द्वितीय) एपोलिपोप्रोटीन ई की कमी (एपीओई केओ) चूहों3 में प्रशासन है, जिसमें मॉडल की तुलना में अधिक पुरानी तरह रोगजनन है जो महाधमनी दीवार 4,5 के तीव्र अपमान से धमनीविस्फार गठन पर भरोसा करते हैं। इस प्रकार, आंग-द्वितीय मॉडल रोग की प्रगति की निगरानी के लिए विशेष रूप से अनुकूल लगता है और हाल ही में चयापचय और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के संबंध में मानव एएए रोग से मिलता-जुलता दिखाया गया था6. विशेष रूप से, आंग -2 मॉडल में न केवल एएए विकास बल्कि थोरैसिक एन्यूरिज्म गठन, साथ ही इंट्राम्यूरल थ्रोम्बस गठन के साथ महाधमनी विच्छेदन भी शामिल है।
रोग की दीक्षा को रोकने के बजाय पहले से स्थापित एएए की प्रगति को लक्षित करने के उद्देश्य से उपचार में उच्च अनुवाद मूल्य हो सकता है क्योंकि पहले से मौजूद स्थिति वाले रोगियों को उपचार 7,8 की आवश्यकता होती है। एक तुलनीय प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए, रोग के विकास की दहलीज को परिभाषित करने और संभावित रूप से उपचार समूहों में चूहों को स्तरीकृत करने के लिए एएए प्रेरण से पहले और बाद में महाधमनी आकार की निगरानी की जानी चाहिए।
दवा प्रशासन का तरीका संबंधित पदार्थ के उत्थान और स्थिरता पर निर्भर करता है। इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन का उपयोग अक्सर उनके आवेदन में आसानी के कारण किया जाता है, संवेदनाहारी की आवश्यकता नहीं होती है, और इंजेक्शन वॉल्यूम बाधाओं की कमी9. हालांकि, प्रशासन का मार्ग चुनते समय फार्माकोकाइनेटिक्स पर विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि आईपी प्रशासित पदार्थ मुख्य रूप से यकृत पोर्टल परिसंचरण के माध्यम से अवशोषित होते हैं और परिसंचरण तक पहुंचने से पहले यकृत चयापचय से गुजर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पहले पास प्रभाव10 के आधार पर अलग-अलग प्लाज्मा सांद्रता हो सकती है। अंतःशिरा (यानी) इंजेक्शन पदार्थों की उच्चतम जैव उपलब्धता पैदा करता है, और दोहरावदार आईवी पहुंच की चुनौती को दैनिक प्रशासन11,12,13 के लिए कैथेटर और संवहनी पहुंच बंदरगाहों के उपयोग से दरकिनार किया जा सकता है। एएए सेटिंग के संबंध में, परिसंचरण में दवा वितरण परिभाषित सांद्रता पर प्रत्यक्ष धमनीविस्फार जोखिम की सुविधा प्रदान करता है।
यहां, हम एक आसमाटिक पंप के चमड़े के नीचे के आरोपण के माध्यम से आंग -2 माउस मॉडल में एएए को प्रेरित करने के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं, बाहरी गले की नस में डाले गए कैथेटर से जुड़े संवहनी पहुंच बंदरगाह के माध्यम से दैनिक आईवी दवा उपचार के लिए, साथ ही दो पृष्ठीय प्रत्यारोपण की उपस्थिति के बावजूद 3 डी अल्ट्रासाउंड14 के माध्यम से धमनीविस्फार आकार की निगरानी के लिए।
आंग -2 मॉडल एएए के सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले माउस मॉडल में से एक है क्योंकि इसकी कम तकनीकी मांगों और मानव रोग 3,6 जैसी विशेष विशेषताएं हैं। सर्जरी का समय प्रति जानवर लगभग 10 मिनट है, और चमड़े के नीचे पंप प्रत्यारोपण चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है यदि चमड़े के नीचे की जेब पर्याप्त रूप से चौड़ी है और चीरा साइट से दूर जानवर की पीठ पर कम रखी जाती है, ताकि घाव भरने में हस्तक्षेप न हो। जब त्वचा पंप के चारों ओर तंग होती है, तो ऊतक जलन हो सकती है, जो सूजन और स्कैबिंग का कारण बन सकती है और संभावित रूप से आसमाटिक दबाव द्वारा पंप की रिहाई के तंत्र को बाधित कर सकती है। पशु बलि के समय पंप में शेष आंग -2 की मात्रा को मापने से अंतर्दृष्टि मिलती है कि क्या आंग -2 को 28 दिनों में सफलतापूर्वक जारी किया गया था।
आंग-द्वितीय मॉडल को हाल ही में महाधमनी धमनीविस्फार और विच्छेदन प्रगति का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होने का प्रस्ताव दिया गया है क्योंकि यह दोनों6 की मानव विशेषताओं के साथ समानता प्रदर्शित करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि महाधमनी विस्तार को अवरुद्ध करने और रीमॉडेलिंग को प्रभावित करने के लिए दवा उम्मीदवारों का परीक्षण वर्तमान नैदानिक मांग से मेल खाएगा। हमारी प्रयोगात्मक सेटिंग में, एन्यूरिज्म गठन के लिए एक कटऑफ बेसलाइन के संबंध में दिन 8 पर 125% वॉल्यूम वृद्धि के आधार पर उपचार शुरू होने से पहले परिभाषित किया गया था, जो चूहों में पूर्ण महाधमनी आकार में प्राकृतिक भिन्नता के लिए जिम्मेदार है। थ्रेसहोल्ड और टाइम पॉइंट एक प्रारंभिक समय पाठ्यक्रम से प्राप्त किए गए थे जो हिस्टोलॉजी में महाधमनी दीवार विनाश की पुष्टि करता था (डेटा नहीं दिखाया गया था) और इसके परिणामस्वरूप कैथेटर प्रत्यारोपण से पहले 35% टूटना और 56% मनाया गया एएए। जबकि अध्ययन समावेश के लिए स्थापित रोग की न्यूनतम सीमा लागू की गई थी, बाद में यह देखा गया कि प्रारंभिक महाधमनी विस्तार की एक उच्च सीमा भी प्रयोगात्मक प्रयोज्यता को सीमित कर सकती है। धमनीविस्फार जो दिन 8 तक >200% मात्रा में तेजी से आगे बढ़े, 55% मामलों (चित्रा 1 डी) में उस आकार से आगे नहीं बढ़े। प्रयोगात्मक डिजाइन और नमूना आकार गणना के दौरान इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह उपचार के वास्तविक प्रभाव को मुखौटा कर सकता है। इस मॉडल का एक अन्य पहलू लगातार महाधमनी टूटना (वक्ष या पेट) है, जो 20% -40% की दर से होता है और ज्यादातर आंग -2 पंप प्रत्यारोपण 3,18,19 के बाद पहले 10 दिनों के भीतर होता है। इस प्रकार, उपचार की शुरुआत को 9 दिन होने के लिए चुनकर, स्थापित धमनीविस्फार की एक उच्च दर हासिल की गई थी, और जुगुलर नस कैथीटेराइजेशन अनिवार्य रूप से चूहों पर किया गया था जो प्रयोग के अंत तक जीवित रहने की उम्मीद थी (हमारे ऐतिहासिक नियंत्रण समूह में केवल 3/24 चूहों ने दिन 9 के बाद टूट गया), इस प्रकार समय, प्रयास, और लागत।
महाधमनी टूटने के अलावा, जो एक गंभीर स्थिति का गठन करते हैं, संवहनी पहुंच बटन और आसमाटिक पंप के साथ कैथेटर के समवर्ती आरोपण को चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया गया था, सर्जरी से वसूली के बाद गतिशीलता या व्यवहार पर कोई उल्लेखनीय प्रभाव नहीं था। प्रशिक्षित शोधकर्ताओं के लिए गले की नस कैथीटेराइजेशन प्रक्रिया में लगभग 30 मिनट लगने चाहिए। (आइसोफ्लूरेन) संज्ञाहरण के संपर्क की अवधि को कम से कम रखा जाना चाहिए, और श्वास अवसाद को रोकने के लिए पशु श्वास दर की बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए, जिससे हल नहीं होने पर घातक परिणाम हो सकता है20. कैथेटर सम्मिलन के लिए गले की नस को पंचर करने के बाद रक्त की हानि – प्रमुख होने पर जानवरों की मृत्यु के लिए अग्रणी – संभावित रूप से तब हो सकती है जब गले की नस ठीक से बंधी नहीं होती है या पोत के पृथक क्षेत्र में खिलाने वाली एक साइड शाखा बंद नहीं होती है। उस स्थिति में, कपास झाड़ू के साथ दबाव पंचर साइट पर लागू किया जाना चाहिए जब तक कि रक्त रिसाव धीमा या बंद न हो जाए, फिर कैथेटर सम्मिलन और बंधाव जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए; कोलेजन घाव ड्रेसिंग का एक छोटा सा टुकड़ा अस्थायी रूप से हेमोस्टेसिस की सहायता के लिए उपयोग किया जा सकता है।
कैथेटर पेटेंसी सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक है, क्योंकि नस या एक्सेस बटन से कैथेटर डिस्कनेक्शन के परिणामस्वरूप अनुचित दवा वितरण होता है जहां दवा चमड़े के नीचे की जगह में लीक हो जाती है। कैथेटर और धातु कनेक्टर के बीच न्यूनतम 3 मिमी ओवरलैप की निर्माता की सिफारिश के बाद, बटन पक्ष पर कैथेटर वियोग का केवल एक मामला (बटन पर चीरा साइट से लीक होने वाले इंजेक्शन तरल द्वारा इंगित) इस मॉडल (2020-2021, एन = 73) में 3 वर्षों में दर्ज किया गया था, जिसे घाव खोलकर और सर्जरी में कनेक्शन को फिर से स्थापित करके तय किया गया था। इसके अलावा, हमारे ऐतिहासिक पीबीएस नियंत्रण समूह (2/21) में लगभग 10% की कैथेटर पैटेंसी विफलता दर या तो कैथेटर रोड़ा (इंजेक्शन लगाना असंभव बना रही है), नस से कैथेटर वियोग (इंजेक्शन के दौरान गर्दन में स्पष्ट सूजन द्वारा इंगित), या घाव भरने की जटिलताओं के कारण अनुभव किया गया था। ये मुद्दे आत्म-प्रवृत्त चोटों, यानी, माउस खरोंच या काटने से जुड़े हो सकते हैं। विशेष रूप से, घाव भरने में हस्तक्षेप करने वाले दवा उपचार विफलता दर को बढ़ा सकते हैं। पैटेंसी दर में सुधार करने के लिए समस्या निवारण चरणों में नस में डाले गए कैथेटर की लंबाई बढ़ाना, यह सुनिश्चित करना कि लिगेचर कैथेटर और नस के चारों ओर कसकर गाँठदार हैं, और निर्माता की सिफारिश के बाद सकारात्मक दबाव तकनीक को लागू करना, जैसा कि चरण 2.12.10 में वर्णित है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन और दृश्य निरीक्षण द्वारा पशु बलि के समय कैथेटर पैटेंसी को सत्यापित किया जाना चाहिए। ध्यान दें, इंजेक्शन दवा समाधान की दैनिक मात्रा पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। चूंकि प्लाज्मा वॉल्यूम रक्तचाप को नियंत्रित करता है, इंजेक्शन की मात्रा एएए विस्तार को प्रभावित कर सकती है, और इसलिए, नियंत्रण जानवरों को वाहक मात्रा के साथ शम प्रक्रिया प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। हमारे अनुभव (और अप्रकाशित टिप्पणियों) के आधार पर, पीबीएस के 250 μL तक की दैनिक राशि अच्छी तरह से सहन की जाती है। अंत में, पंप प्रत्यारोपण के समान, प्रत्यारोपित संवहनी पहुंच बटन के आसपास त्वचा की जलन हो सकती है। यदि विचलित या परिगलित ऊतक के साथ सूजन देखी जाती है, तो घाव अपघटन को गैर-व्यवहार्य ऊतक को हटाकर किया जाना चाहिए (नेक्रोटिक ऊतक अक्सर घाव से स्वाभाविक रूप से अलग हो जाएगा), और यदि आवश्यक हो तो त्वचा को टांका लगाया जाना चाहिए; यदि सूजन और परिगलन व्यापक हैं, तो जानवर के कल्याण और मानवीय समापन बिंदुओं को दिशानिर्देशों के अनुसार माना जाना चाहिए।
या वीएएस के एकल और दोहरे पृष्ठीय आरोपण ने अल्ट्रासाउंड सिग्नल के साथ हस्तक्षेप नहीं किया और न ही अल्ट्रासाउंड चरण पर उचित स्थिति में माउस को सुरक्षित करने के साथ। वॉल्यूम माप के लिए महाधमनी की 3 डी छवि प्रस्तुत करने के लिए 12 मिमी से अधिक 157 फ्रेम का स्वचालित अधिग्रहण एक सरल और तेज़ प्रक्रिया14 है, जिसके लिए केवल यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता होती है कि महाधमनी ब्याज के क्षेत्र पर हस्तक्षेप से स्पष्ट है। इस संदर्भ में एक नुकसान हस्तक्षेप की छवि को साफ करने का प्रयास करते समय ट्रांसड्यूसर के साथ बहुत अधिक दबाव डाल रहा है, जो स्वचालित माप को बाधित कर सकता है यदि श्वास दर पसलियों के संपीड़न से प्रभावित होती है जब पेट महाधमनी के कपाल अंत की छवियां दर्ज की जाती हैं। व्यास पारंपरिक रूप से अल्ट्रासाउंड विश्लेषण का संचालन करते समय ऑपरेटर द्वारा मैन्युअल रूप से अधिकतम व्यास के क्षेत्र की खोज द्वारा बी-मोड का उपयोग करके अधिग्रहित छवियों में मापा जाता है। बी-मोड छवियों पर एक उन्नति ईकेवी छवियां हैं, जो स्पंदित महाधमनी की उच्च गुणवत्ता वाली, धीमी गति से छवि का उत्पादन करने के लिए छोटे महाधमनी गतियों को हल कर सकती हैं। इसके अलावा, अधिकतम महाधमनी व्यास अधिग्रहित 3 डी फ्रेम से निर्धारित किया जा सकता है, जहां 157 छवियां सिस्टोल (सेट ईसीजी ट्रिगर के कारण) में ली गई महाधमनी का व्यापक अवलोकन प्रदान करती हैं।
अंत में, प्रस्तुत संकलित प्रोटोकॉल आंग-द्वितीय प्रेरित एएए के माउस मॉडल में आईवी दवा प्रशासन के लिए और 3 डी अल्ट्रासाउंड द्वारा महाधमनी आकार की निगरानी के लिए एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो प्रदान करता है। निगरानी और संचालन के समय बिंदुओं को विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है, और गले की नस कैथीटेराइजेशन को किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप के लिए अलग से किया जा सकता है जिसमें आईवी इंजेक्शन के माध्यम से विशिष्ट पदार्थों के वितरण की आवश्यकता होती है। वीएएस का उपयोग वैकल्पिक रूप से बार-बार रक्त नमूने के लिए किया जा सकता है यदि थक्के को रोकने के लिए कैथेटर लॉक समाधान का उपयोग किया जाता है। वर्णित 3 डी अल्ट्रासाउंड प्रक्रिया को इन्फ्रारेनल महाधमनी को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जहां एएए के इलास्टेज या सीएसीएल 2-आधारित माउस मॉडल में तीव्र अपमान पर धमनीविस्फार विकसितहोता है। जबकि 3 डी अल्ट्रासाउंड अधिग्रहण प्रभावित महाधमनी क्षेत्र और धमनीविस्फार आकृति विज्ञान का अवलोकन देने का लाभ रखता है, छवि अधिग्रहण अधिक समय लेने वाला है और इसलिए, अधिक लागत-गहन हो सकता है। प्रोटोकॉल की एक और सीमा जिसे स्वीकार किया जाना चाहिए, जानवरों को अंतःशिरा इंजेक्शन के लिए संक्षेप में संवेदनाहारी करने की आवश्यकता है, जबकि इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन आमतौर पर सचेत चूहों पर किया जाता है।
The authors have nothing to disclose.
हम पशु प्रयोगों में सहायता के लिए प्रोफेसर पोडेसर और प्रोफेसर एल्मियर की टीमों (बायोमेडिकल रिसर्च और कोर फैसिलिटी फॉर लेबोरेटरी एनिमल ब्रीडिंग एंड हसबैंड्री, मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ वियना) को धन्यवाद देना चाहते हैं। एएए ट्राइक्रोम धुंधला कृपया मोनिका वीस और प्रोफेसर पीटर पेटज़ेलबाउर (त्वचाविज्ञान विभाग, मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ वियना) द्वारा किया गया था। इस काम को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष [एसएफबी परियोजना एफ 5409-बी 21] द्वारा समर्थित किया गया था। मार्क बेली व्यक्तिगत रूप से ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन [एफएस / 18/12/33270] द्वारा समर्थित है।
4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
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Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
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Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |