이 프로토콜은 반복적인 약물 치료를 위해 경정맥 카테터를 갖는 혈관 접근 포트의 아포리포단백질 E(ApoE) 결핍 마우스에서 안지오텐신 II 방출에 의해 복부 대동맥류를 유도하기 위한 삼투압 펌프의 연속 이식을 기술한다. 3D 초음파에 의한 동맥류 발달 모니터링은 등쪽 임플란트에도 불구하고 효과적으로 수행됩니다.
제약 치료 옵션이 복부 대동맥류 (AAA)의 임상 관리에서 부족하기 때문에, 동물 모델, 특히 마우스 모델은 질병 병인에 대한 이해를 증진시키고 잠재적 인 치료 표적을 식별하기 위해 적용됩니다. 이들 모델에서 AAA 성장을 차단하기 위한 신규한 약물 후보를 시험하는 것은 일반적으로 실험의 시간 과정 동안 반복적인 약물 투여를 필요로 한다. 여기에서는 AAA 유도, 장기간 치료를 용이하게하는 정맥 내 카테터의 삽입 및 3D 초음파에 의한 직렬 AAA 모니터링을위한 컴파일 된 프로토콜을 설명합니다. 동맥류는 아포리포단백질 E(ApoE) 결핍 마우스에서 안지오텐신 II 방출에 의해 유도되며, 28일에 걸쳐 삼투압 미니펌프로부터 다시 마우스 내로 피하로 이식된다. 그 후, 외부 경정맥 카테터 삽입을위한 외과 적 절차가 매일 정맥 내 약물 치료 또는 피하 혈관 액세스 버튼을 통한 반복 혈액 샘플링을 허용하기 위해 수행됩니다. 두 개의 등쪽 임플란트에도 불구하고, AAA 개발의 모니터링은 순차적 인 반자동 3D 초음파 분석에 의해 쉽게 촉진되며, 이는 실험예에 의해 설명 된 바와 같이 대동맥류 직경과 부피의 확장 및 동맥류 형태학에 대한 포괄적 인 정보를 제공합니다.
복부 대동맥류 (AAA)는 궁극적으로 파열과 환자 사망으로 이어질 수있는 대동맥벽의 염증 및 조직 파괴 과정으로 인한 혈관의 병리학 적 팽창입니다. 외과 적 AAA 수리에서 상당한 업적에도 불구하고, 동맥류 확장의 진행을 차단하고 잠재적으로 파열의 위험을 낮추는 보수적 인 약물 치료는 현재까지 누락되었습니다. 동물 모델은 질병의 유발 요인과 중재자를 밝히고 치료에 대한 새로운 접근법을 테스트하기 위해 개발되었습니다. AAA의 마우스 모델은 널리 적용되고 인간 조직으로부터의 상이한 관찰을 포괄한다. 그들의 pathomechanistic 차이로 인해, 종종 분자 / 경로의 특정 기능 또는 잠재적 인 치료 약물 1,2의 효능을 조사하기 위해 하나 이상의 모델이 적용됩니다. AAA 유도의 가장 일반적으로 사용되는 모델 중에는 아포리포단백질 E 결핍(ApoE KO) 마우스3에서의 안지오텐신-II(Ang-II) 투여가 있는데, 이는 급성 모욕으로부터 대동맥벽 4,5에 이르는 동맥류 형성에 의존하는 모델에 비해 더 만성-유사 병인을 갖는다. 따라서, Ang-II 모델은 질환 진행을 모니터링하는데 특히 적합한 것으로 보이며, 최근에는 대사 및 염증 반응과 관련하여 인간 AAA 질환과 매우 유사한 것으로 나타났다6. 특히, Ang-II 모델은 AAA 발달뿐만 아니라 흉부 동맥류 형성뿐만 아니라 교내 혈전 형성을 통한 대동맥 박리를 특징으로합니다.
질병의 개시를 막기보다는 이미 확립된 AAA의 진행을 표적으로 하는 것을 목표로 하는 치료법은 치료(7,8)를 필요로 하는 기존 병태를 갖는 환자로서 더 높은 번역 가치를 가질 수 있다. 비교 가능한 실험 설계의 경우, AAA 유도 전후에 대동맥 크기를 모니터링하여 질병 발생의 역치를 정의하고 잠재적으로 마우스를 치료 그룹으로 계층화해야합니다.
약물 투여 방식은 각 물질의 흡수 및 안정성에 달려 있습니다. 복강내(i.p.) 주사는 적용의 용이성, 마취제를 필요로 하지 않으며, 주사 부피의 제약의 부족으로 인해 가장 자주 이용된다(9). 그러나 약동학은 투여 경로를 선택할 때 i.p.가 주로 간 문맥 순환을 통해 흡수되고 순환에 도달하기 전에 간 대사를 겪을 수 있기 때문에 첫 번째 통과 효과10에 따라 혈장 농도가 달라질 수 있으므로 고려해야합니다. 정맥 내 (i.v.) 주사는 물질의 가장 높은 생체 이용률을 산출하고, 반복적 인 i.v. 접근의 도전은 매일 투여를위한 카테터 및 혈관 접근 포트의 사용에 의해 회피 될 수있다 11,12,13. AAA 설정과 관련하여, 순환에서의 약물 분포는 정의된 농도에서 직접적인 동맥류 노출을 용이하게 한다.
여기에서는 삼투압 펌프의 피하 이식을 통해 Ang-II 마우스 모델에서 AAA를 유도하기 위한 워크플로우를 설명하고, 외부 경정맥에 삽입된 카테터에 연결된 혈관 액세스 포트를 통한 일일 i.v. 약물 치료뿐만 아니라 두 개의 등쪽 임플란트가 있음에도 불구하고 3D 초음파(14 )를 통한 동맥류 크기의 모니터링을 위해 설명합니다.
Ang-II 모델은 낮은 기술적 요구와 인간 질병 3,6과 유사한 특정 기능으로 인해 AAA의 가장 일반적으로 사용되는 마우스 모델 중 하나입니다. 수술 시간은 동물 당 약 10 분이며, 피하 주머니가 충분히 넓고 절개 부위에서 멀리 떨어진 동물의 등에 낮게 배치되어 상처 치유를 방해하지 않도록 피하 펌프 이식은 마우스에 의해 잘 견뎌냅니다. 펌프 주위의 피부가 꽉 조이면 조직 자극이 발생하여 염증과 딱지가 생기고 삼투압에 의한 펌프의 방출 메커니즘을 방해 할 수 있습니다. 동물 희생 시에 펌프에 남아있는 Ang-II의 부피를 측정하면 Ang-II가 28일 동안 성공적으로 방출되었는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Ang-II 모델은 최근 대동맥류 및 해부 진행을 연구하는 데 적합하도록 제안되었으며, 이는둘 다 6의 인간 특징과 유사함을 나타내기 때문입니다. 중요한 것은 대동맥 확장을 차단하고 리모델링에 영향을 미치기 위해 약물 후보를 테스트하는 것이 현재의 임상 수요와 일치한다는 것입니다. 우리의 실험 환경에서, 동맥류 형성에 대한 컷오프는 마우스에서 절대 대동맥 크기의 자연적인 변화를 설명하는 기준선과 관련하여 8 일째에 125 % 부피 성장을 기준으로 치료 시작 전에 정의되었습니다. 역치 및 시점은 조직학에서 대동맥 벽 파괴를 확인한 초기 시간 과정 (데이터는 나타내지 않음)에서 파생되었으며 카테터 이식 전에 35 % 파열 및 56 % 관찰 된 AAA를 초래했습니다. 확립 된 질병의 최소 역치가 연구 포함을 위해 적용되었지만, 높은 수준의 초기 대동맥 확장이 또한 실험 적용성을 제한 할 수 있다는 것이 나중에 관찰되었습니다. 8일째까지 >200% 부피로 급속히 진행된 동맥류는 55%의 사례에서 그 크기를 넘어 더 이상 성장하지 않았다(그림 1D). 이것은 실험적 설계 및 샘플 크기 계산 중에 고려되어야하며, 이는 치료의 실제 효과를 가릴 수 있기 때문입니다. 이 모델의 또 다른 측면은 빈번한 대동맥 파열 (흉부 또는 복부)으로, 20 % -40 %의 비율로 발생하며 대부분 Ang-II 펌프 이식 후 처음 10 일 이내에발생합니다 3,18,19. 따라서 치료 시작을 9 일째로 선택함으로써 확립 된 동맥류의 높은 비율이 달성되었고, 경정맥 카테터 삽입은 본질적으로 실험이 끝날 때까지 생존 할 것으로 예상되는 쥐 (역사적인 대조군의 3/24 마우스 만 9 일째에 파열됨)에 대해 수행되어 시간과 노력을 절약하고, 및 비용.
심한 상태를 구성하는 대동맥 파열 외에도 혈관 접근 버튼과 삼투 펌프가있는 카테터의 동시 이식은 마우스에 의해 잘 견뎌 냈으며 수술에서 회복 된 후 이동성이나 행동에 눈에 띄는 영향을 미치지 않았습니다. 경정맥 카테터 삽입 절차는 훈련 된 연구원에게 약 30 분이 소요됩니다. (이소플루란) 마취에 노출되는 지속 기간은 최소한으로 유지되어야하며, 호흡 억제를 예방하기 위해 동물 호흡 속도를 면밀히 모니터링해야하며, 이는 해결되지 않으면 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다20. 카테터 삽입을 위해 경정맥에 구멍을 뚫은 후 혈액 손실은 – 중요한 경우 동물 사망으로 이어짐 – 경정맥이 두개골로 적절하게 결찰되지 않거나 혈관의 고립 된 영역으로 먹이는 측면 가지가 닫히지 않을 때 잠재적으로 발생할 수 있습니다. 이 경우 혈액 누출이 느려지거나 멈출 때까지 면봉으로 압력을 가한 다음 카테터 삽입 및 결찰을 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 콜라겐 상처 드레싱의 작은 조각은 지혈을 돕기 위해 일시적으로 활용 될 수 있습니다.
카테터 개통성은 카테터가 정맥이나 접근 버튼에서 분리되어 약물이 피하 공간으로 누출되는 부적절한 약물 전달을 초래하기 때문에 가장 중요한 요소 중 하나입니다. 카테터와 금속 연결기 사이의 최소 3mm 겹침에 대한 제조업체의 권고에 따라, 버튼 측에서 카테터 분리의 한 사례 (버튼의 절개 부위에서 누출 된 주입 된 액체로 표시됨)만이 3 년 동안 기록되었으며,이 모델 (2020-2021, n = 73)은 상처를 열고 수술시 연결을 다시 확립하여 고정되었습니다. 또한, 우리의 역사적인 PBS 대조군 (2/21)에서 약 10 %의 카테터 개통 실패율은 카테터 폐색 (주입을 불가능하게 함), 정맥으로부터의 카테터 분리 (주사 중 목에 명백한 붓기로 나타남) 또는 상처 치유 합병증으로 인해 경험되었습니다. 이러한 문제는 자해 부상, 즉 마우스 긁힘 또는 물기와 관련이있을 수 있습니다. 특히, 상처 치유를 방해하는 약물 치료는 실패율을 높일 수 있습니다. 개통률을 향상시키기 위한 문제 해결 단계에는 정맥에 삽입된 카테터의 길이를 늘리고, 합자가 카테터와 정맥 주위에 단단히 매듭지도록 보장하고, 주입하는 동안 단계 2.12.10.에 설명된 대로 제조업체의 권고에 따라 양압 기술을 적용하는 것이 포함됩니다. 카테터 개통성은 또한 동물 희생시에 현미경으로 해부 및 육안 검사를 통해 검증되어야합니다. 참고로, 주입 된 약물 용액의 일일 부피는 신중하게 고려되어야합니다. 혈장 부피가 혈압을 조절하기 때문에 주사량은 AAA 확장에 영향을 미칠 수 있으므로 통제 동물은 담체 부피로 가짜 절차를 받아야합니다. 우리의 경험 (및 공개되지 않은 관찰)에 기초하여, PBS의 일일 최대 250 μL의 양은 잘 용인되는 것으로 보인다. 마지막으로, 펌프 이식과 유사하게, 이식된 혈관 접근 버튼 주위에 피부 자극이 발생할 수 있다. 탈생 또는 괴사 성 조직을 동반 한 염증이 관찰되면 생존 할 수없는 조직을 제거하여 상처 탈지가 수행되어야하며 (괴사 조직은 종종 상처에서 자연적으로 분리됩니다), 필요한 경우 피부를 봉합해야합니다. 염증과 괴사가 광범위하다면 동물의 복지와 인도적 종점은 지침에 따라 고려되어야합니다.
삼투압 펌프 및/또는 VAS의 단일 및 이중 등쪽 이식은 초음파 신호를 방해하거나 초음파 단계에서 적절한 위치에 마우스를 고정시키는 것을 방해하지 않았습니다. 부피 측정을 위해 대동맥의 3D 이미지를 렌더링하기 위해 12mm 이상의 157 프레임을 자동으로 획득하는 것은 간단하고 빠른 절차(14)이며, 이는 대동맥이 관심 영역에 대한 간섭을 방지하도록 보장하기만 하면 된다. 이러한 맥락에서 한 가지 함정은 간섭의 이미지를 지우려고 시도하는 동안 변환기에 너무 많은 압력을 가하는 것인데, 이는 복부 대동맥의 두개골 끝의 이미지가 기록 될 때 호흡 속도가 갈비뼈의 압축에 의해 영향을받는 경우 자동화 된 측정을 방해 할 수 있습니다. 직경은 전통적으로 작업자가 초음파 분석을 수행하는 동안 최대 직경의 영역을 수동으로 검색하는 B 모드를 사용하여 획득 한 이미지에서 측정됩니다. B 모드 이미지의 발전은 EKV 이미지로, 작은 대동맥 동작을 해결하여 맥동하는 대동맥의 고품질, 느려진 이미지를 생성 할 수 있습니다. 또한, 최대 대동맥 직경은 획득 된 3D 프레임에서 결정될 수 있으며, 157 개의 이미지는 수축기에서 찍은 대동맥에 대한 포괄적 인 개요를 제공합니다 (ECG 트리거 설정으로 인해).
결론적으로, 제시된 컴파일된 프로토콜은 Ang-II 유도 AAA의 마우스 모델에서 i.v. 약물 투여를 위한 안정적이고 재현 가능한 워크플로우를 제공하고 3D 초음파에 의한 대동맥 크기를 모니터링한다. 모니터링 및 수술의 시점은 특정 요구에 맞게 조정할 수 있으며, 경정맥 카테터 삽입은 i.v. 주사를 통해 특정 물질의 전달을 요구하는 모든 실험 설정에 대해 별도로 수행 할 수 있습니다. VAS는 카테터 잠금 용액이 응고를 방지하기 위해 사용되는 경우 반복 혈액 샘플링에 선택적으로 사용될 수 있습니다. 기술된 3D 초음파 절차는 AAA의 엘라스타제 또는CaCl2-기반 마우스 모델에서 급성 모욕시 동맥류가 발생하는 infrarenal 대동맥을 측정하도록 적응될 수 있다. 3D 초음파 수집은 영향을받는 대동맥 영역과 동맥류 형태에 대한 개요를 제공하는 이점을 가지고 있지만, 이미지 수집은 더 많은 시간이 걸리고 따라서 비용 집약적 일 수 있습니다. 인정되어야 하는 프로토콜의 또 다른 한계는 동물이 정맥내 주사를 위해 간략하게 마취될 필요가 있는 반면, 복강내 투여는 일반적으로 의식이 있는 마우스에 대해 수행되어야 한다는 것이다.
The authors have nothing to disclose.
동물 실험에 도움을 주신 Podesser교수님과 Ellmeier 교수님의 팀(비엔나 의과대학 의과대학 생물의학 연구 및 실험실 동물 사육 및 축산을 위한 핵심 시설)에 감사드립니다. AAA 삼색 염색은 Monika Weiss와 Peter Petzelbauer 교수 (비엔나 의과 대학 피부과 학과)가 친절하게 수행했습니다. 이 연구는 오스트리아 과학 기금 [SFB 프로젝트 F 5409-B21]의 지원을 받았습니다. Marc Bailey는 British Heart Foundation [FS/18/12/33270]의 지원을 개인적으로 받고 있습니다.
4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
Hair removal cream | |||
Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
Small electric shaver | |||
Surigcal and microsurgical equipment | |||
Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |