Denne protokollen beskriver den påfølgende implantasjonen av en osmotisk pumpe for å indusere abdominal aortaaneurisme ved angiotensin II-frigjøring i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulle mus og av en vaskulær tilgangsport med et jugulært venekateter for gjentatt legemiddelbehandling. Overvåking av aneurismeutvikling ved 3D-ultralyd utføres effektivt til tross for dorsale implantater.
Siden farmasøytiske behandlingsalternativer mangler i den kliniske behandlingen av abdominal aortaaneurisme (AAA), brukes dyremodeller, spesielt musemodeller, for å fremme forståelsen av sykdomspatogenesen og for å identifisere potensielle terapeutiske mål. Testing av nye legemiddelkandidater for å blokkere AAA-vekst i disse modellene krever vanligvis gjentatt legemiddeladministrasjon i løpet av forsøket. Her beskriver vi en kompilert protokoll for AAA-induksjon, innsetting av intravenøst kateter for å muliggjøre langvarig behandling og seriell AAA-monitorering ved 3D-ultralyd. Aneurysmer induseres i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulle mus ved angiotensin II-frigjøring over 28 dager fra osmotiske minipumper implantert subkutant i musen tilbake. Deretter utføres den kirurgiske prosedyren for ekstern jugularvenekateterisering for å muliggjøre daglig intravenøs legemiddelbehandling eller gjentatt blodprøvetaking via en subkutan vaskulær tilgangsknapp. Til tross for de to dorsale implantatene, blir overvåkingen av AAA-utviklingen lett tilrettelagt ved sekvensiell semi-automatisert 3D-ultralydanalyse, som gir omfattende informasjon om utvidelse av aortadiameter og volum og om aneurysmmorfologi, som illustrert ved eksperimentelle eksempler.
En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en patologisk dilatasjon av et fartøy på grunn av inflammatoriske og vevsdestruktive prosesser i aortaveggen som til slutt kan føre til brudd og pasientdød. Til tross for betydelige prestasjoner i kirurgisk AAA-reparasjon, mangler en konservativ medisinbehandling for å blokkere utviklingen av aneurismeutvidelse og potensielt redusere risikoen for brudd til dags dato. Dyremodeller er utviklet for å belyse utløsere og mediatorer av sykdommen og for å teste nye tilnærminger til terapi. Musemodeller av AAA er mye brukt og dekker de forskjellige observasjonene fra menneskelig vev. På grunn av deres pathomechanistiske forskjeller brukes ofte mer enn én modell for å undersøke den spesielle funksjonen til molekyler / veier eller effekten av potensielle terapeutiske legemidler 1,2. Blant de mest brukte modellene av AAA-induksjon er angiotensin-II (Ang-II) administrasjon i apolipoprotein E-mangelfulle (ApoE KO) mus3, som har mer kronisk patogenese i forhold til modeller som er avhengige av aneurysmdannelse fra en akutt fornærmelse mot aortaveggen 4,5. Dermed synes Ang-II-modellen spesielt egnet for å overvåke sykdomsprogresjon og ble nylig vist å ligne menneskelig AAA-sykdom med hensyn til metabolske og inflammatoriske responser6. Spesielt har Ang-II-modellen ikke bare AAA-utvikling, men også thoraxaneurismedannelse, samt aortadisseksjon med intramural trombusdannelse.
Behandlinger som tar sikte på å målrette utviklingen av allerede etablert AAA i stedet for å forhindre initiering av sykdommen, kan ha høyere translasjonsverdi ettersom pasienter presenterer en eksisterende tilstand som krever behandling 7,8. For et sammenlignbart eksperimentelt design må aortastørrelsen overvåkes før og etter AAA-induksjon for å definere en terskel for sykdomsutvikling og potensielt stratifisere mus i behandlingsgrupper.
Modusen for legemiddeladministrasjon avhenger av opptaket og stabiliteten til det respektive stoffet. Intraperitoneale (i.p.) injeksjoner brukes oftest på grunn av deres brukervennlighet, som ikke krever bedøvelse, og mangelen på injeksjonsvolumbegrensninger9. Farmakokinetikk må imidlertid vurderes ved valg av administrasjonsvei, da substanser som administreres intrap. primært absorberes gjennom leverportalsirkulasjonen og kan gjennomgå levermetabolisme før sirkulasjon nås, noe som kan resultere i varierende plasmakonsentrasjoner avhengig av first pass effekt10. Intravenøs (i.v.) injeksjon gir den høyeste biotilgjengeligheten av stoffer, og utfordringen med repeterende intravenøs tilgang kan omgås ved bruk av katetre og vaskulære tilgangsporter for daglig administrasjon11,12,13. Med hensyn til AAA-innstillingen letter legemiddeldistribusjon i omløp direkte aneurismeeksponering ved definerte konsentrasjoner.
Her beskriver vi en arbeidsflyt for å indusere AAA i Ang-II-musemodellen via subkutan implantasjon av en osmotisk pumpe, for daglig intravenøs medikamentell behandling via en vaskulær tilgangsport koblet til et kateter satt inn i den ytre jugulære venen, samt for overvåking av aneurismestørrelse via 3D-ultralyd14 til tross for tilstedeværelsen av to dorsale implantater.
Ang-II-modellen er en av de mest brukte musemodellene til AAA på grunn av dens lave tekniske krav og spesielle egenskaper som ligner menneskelig sykdom 3,6. Operasjonstiden er ca. 10 minutter per dyr, og den subkutane pumpeimplantasjonen tolereres godt av musene hvis den subkutane lommen er tilstrekkelig bred og plassert lavt på dyrets rygg, vekk fra snittstedet, for ikke å forstyrre sårheling. Når huden er stram rundt pumpen, kan vevsirritasjon oppstå, noe som kan forårsake betennelse og scabbing og potensielt forstyrre pumpens frigjøringsmekanisme ved osmotisk trykk. Måling av volumet av Ang-II som er igjen i pumpen på tidspunktet for dyreofring, gir innsikt i om Ang-II ble vellykket utgitt i løpet av de 28 dagene.
Ang-II-modellen har nylig blitt foreslått å være godt egnet til å studere aortaaneurisme og disseksjonsprogresjon, da den viser likhet med menneskelige egenskaper hos begge6. Det er viktig at testing av legemiddelkandidater for å blokkere aortautvidelse og påvirke ombygging vil samsvare med dagens kliniske etterspørsel. I vår eksperimentelle setting ble en cutoff for aneurismedannelse definert før behandlingsstart basert på 125 % volumvekst på dag 8 i forhold til baseline, noe som står for den naturlige variasjonen i absolutt aortastørrelse hos mus. Terskelen og tidspunktet ble avledet fra et innledende tidsforløp som bekreftet ødeleggelse av aortaveggen i histologi (data ikke vist) og resulterte i 35 % rupturer og 56 % observerte AAA før kateterimplantasjon. Mens en minimumsgrense for etablert sykdom ble brukt for studieinkludering, ble det senere observert at en høy grad av initial aortautvidelse også kan begrense eksperimentell anvendelighet. Aneurismer som utviklet seg raskt til >200 % volum ved dag 8, vokste ikke videre utover denne størrelsen i 55 % av tilfellene (figur 1D). Dette må tas i betraktning under eksperimentell design og beregning av prøvestørrelse, da det kan maskere behandlingens sanne effekt. En annen fasett av denne modellen er de hyppige aortabruddene (thorax eller abdominal), som forekommer med hastigheter på 20% -40% og for det meste innen de første 10 dagene etter Ang-II-pumpeimplantasjon 3,18,19. Ved å velge behandlingsstart til dag 9 ble det derfor oppnådd en høy frekvens av etablerte aneurismer, og jugularvenekateteriseringen ble i hovedsak utført på mus som var forventet å overleve til slutten av forsøket (bare 3/24 mus i vår historiske kontrollgruppe sprukket etter dag 9), og dermed spare tid, krefter, og kostnad.
Bortsett fra aortabruddene, som utgjør en alvorlig tilstand, ble den samtidige implantasjonen av kateteret med vaskulær tilgangsknapp og den osmotiske pumpen godt tolerert av musene, uten noen merkbar effekt på mobilitet eller atferd etter utvinning fra kirurgi. Prosedyren for jugularvenekateterisering bør ta ca. 30 minutter for trente forskere. Varigheten av eksponering for (isofluran) anestesi bør holdes på et minimum, og dyrets pustehastighet må overvåkes nøye for å forhindre pustedepresjon, noe som kan føre til dødelig utgang hvis det ikke går over20. Blodtap etter punktering av jugularvenen for kateterinnsetting – noe som fører til dyredød hvis det er stort – kan potensielt oppstå når jugularvenen ikke er riktig ligert kranialt eller en sidegren som fôrer inn i det isolerte området av fartøyet ikke er stengt av. I så fall bør trykk med en bomullspinne påføres punkteringsstedet til blodlekkasjen bremser eller stopper, da bør kateterinnsettingen og ligeringen gjøres så raskt som mulig; Et lite stykke av kollagen sår dressing kan midlertidig benyttes for å hjelpe med hemostase.
Kateterpatency er en av de viktigste faktorene, da kateterkobling fra venen eller tilgangsknappen resulterer i feil legemiddellevering der stoffet lekker inn i det subkutane rommet. Etter produsentens anbefaling om minimum 3 mm overlapping mellom kateteret og metallbinderen, ble det bare registrert ett tilfelle av kateterfrakobling på knappesiden (indikert av den injiserte væsken som lekker fra snittstedet ved knappen) over 3 år i denne modellen (2020-2021, n = 73), som ble løst ved å åpne såret og gjenopprette forbindelsen i kirurgi. I tillegg ble det opplevd en kateterpatenssviktrate på rundt 10 % i vår historiske PBS-kontrollgruppe (2/21) på grunn av enten kateterokklusjon (som gjør det umulig å injisere), kateterfrakobling fra venen (indikert ved tilsynelatende hevelse i nakken under injeksjon) eller komplikasjoner med sårtilheling. Disse problemene kan være knyttet til selvpåførte skader, dvs. mus riper eller biter. Spesielt kan narkotikabehandlinger som forstyrrer sårheling øke feilfrekvensen. Feilsøkingstrinn for å forbedre patencyhastigheten inkluderer å øke lengden på kateteret som settes inn i venen, sikre at ligaturer knyttes tett rundt kateteret og venen, og bruke overtrykksteknikken etter produsentens anbefaling, som beskrevet i trinn 2.12.10., mens du injiserer. Kateterpatency bør i tillegg verifiseres på tidspunktet for dyreofring ved disseksjon og visuell inspeksjon under mikroskopet. Merk at det daglige volumet av injisert legemiddeloppløsning må vurderes nøye. Ettersom plasmavolumet regulerer blodtrykket, kan injeksjonsvolumet påvirke AAA-ekspansjonen, og derfor må kontrolldyr motta humbugprosedyren med bærervolum. Basert på vår erfaring (og upubliserte observasjoner), synes en daglig mengde på opptil 250 μL PBS å være godt tolerert. Til slutt, i likhet med pumpeimplantasjonen, kan hudirritasjon oppstå rundt den implanterte vaskulære tilgangsknappen. Hvis betennelse ledsaget av devitalisert eller nekrotisk vev observeres, bør sårdebridement utføres ved å fjerne ikke-levedyktig vev (nekrotisk vev vil ofte skille seg naturlig fra såret), og huden skal sutureres om nødvendig; Hvis betennelse og nekrose er omfattende, må dyrets velferd og humane endepunkter vurderes i henhold til retningslinjene.
Enkel og dobbel dorsal implantasjon av den osmotiske pumpen og / eller VAS forstyrret ikke ultralydsignalet eller med å sikre musen i en passende posisjon på ultralydstrinnet. Den automatiserte anskaffelsen av 157 bilder over 12 mm for å gjengi et 3D-bilde av aorta for volummåling er en enkel og rask prosedyre14, som bare krever at aorta er fri for forstyrrelser over interesseområdet. En fallgruve i denne sammenhengen er å legge for mye trykk med svingeren mens du prøver å fjerne bildet av interferens, noe som kan forstyrre den automatiserte målingen hvis pustefrekvensen påvirkes av kompresjonen av ribbeina når bilder av kranialenden av abdominal aorta registreres. Diameter måles tradisjonelt i bilder som er oppnådd ved hjelp av B-modus av operatøren som manuelt søker etter området med maksimal diameter mens han utfører ultralydanalysen. Et fremskritt på B-modus-bildene er EKV-bildene, som kan løse små aortabevegelser for å produsere et høykvalitets, redusert bilde av den pulserende aorta. Videre kan den maksimale aortadiameteren bestemmes fra de oppkjøpte 3D-rammene, hvor de 157 bildene gir en omfattende oversikt over aorta tatt ved systole (på grunn av den innstilte EKG-utløseren).
Avslutningsvis gir den presenterte kompilerte protokollen en pålitelig og reproduserbar arbeidsflyt for intravenøs legemiddeladministrasjon i en musemodell av Ang-II-indusert AAA og for overvåking av aortastørrelse ved 3D-ultralyd. Tidspunktene for overvåking og drift kan tilpasses de spesifikke behovene, og jugularvenekateteriseringen kan utføres separat for ethvert eksperimentelt oppsett som krever levering av spesifikke stoffer via intravenøse injeksjoner. VAS kan alternativt brukes til gjentatt blodprøvetaking hvis en kateterlåsløsning brukes for å forhindre koagulering. Den beskrevne 3D-ultralydprosedyren kan tilpasses for å måle infrarenal aorta, hvor aneurismer utvikles ved akutt fornærmelse i elastase eller CaCl2-baserte musemodeller av AAA. Mens 3D-ultralydoppkjøp har fordelen av å gi en oversikt over den berørte aortaregionen og aneurysmmorfologien, er bildeoppkjøpet mer tidkrevende og kan derfor være mer kostnadskrevende. En annen begrensning av protokollen som bør anerkjennes, er behovet for at dyrene skal bedøves kort for intravenøse injeksjoner, mens intraperitoneal administrering vanligvis utføres på bevisste mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke prof. Podesser og prof. Ellmeiers team (Institutt for biomedisinsk forskning og kjernefasilitet for laboratoriedyravl og husdyrhold, Medical University of Vienna) for hjelp i dyreforsøkene. AAA trikromfarging ble vennlig utført av Monika Weiss og prof. Peter Petzelbauer (Institutt for dermatologi, Medical University of Vienna). Dette arbeidet ble støttet av det østerrikske vitenskapsfondet [SFB-prosjekt F 5409-B21]. Marc Bailey er personlig støttet av British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
Hair removal cream | |||
Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
Small electric shaver | |||
Surigcal and microsurgical equipment | |||
Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |