Billeddannelse af CD19 ⁺ B-celler i en eksperimentel autoimmun encephalomyelitis musemodel ved hjælp af positronemissionstomografi

Summary

Dette papir beskriver metodologi til radioaktiv mærkning af et menneskespecifikt anti-CD19 monoklonalt antistof, og hvordan man bruger det til at kvantificere B-celler i centralnervesystemet og perifere væv i en musemodel af multipel sklerose ved hjælp af in vivo PET-billeddannelse, ex vivo gammatælling og autoradiografiske tilgange.

Abstract

Multipel sklerose (MS) er den mest almindelige demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet (CNS), der rammer unge voksne, hvilket ofte resulterer i neurologiske underskud og handicap, efterhånden som sygdommen skrider frem. B-lymfocytter spiller en kompleks og kritisk rolle i MS-patologi og er målet for flere behandlinger i kliniske forsøg. I øjeblikket er der ingen måde at nøjagtigt vælge patienter til specifikke anti-B-celleterapier eller ikke-invasivt kvantificere virkningerne af disse behandlinger på B-cellebelastning i CNS og perifere organer. Positronemissionstomografi (PET) billeddannelse har et enormt potentiale til at give meget specifik, kvantitativ information om in vivo spatiotemporal fordeling og byrde af B-celler i levende forsøgspersoner.

Dette papir rapporterer metoder til at syntetisere og anvende et PET-sporstof, der er specifikt for humane CD19 ⁺ B-celler i en veletableret B-celledrevet musemodel af MS, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), som induceres med humant rekombinant myelinoligodendrocytglycoprotein 1-125. Her beskrives optimerede teknikker til at detektere og kvantificere CD19⁺ B-celler i hjernen og rygmarven ved hjælp af in vivo PET-billeddannelse. Derudover rapporterer dette papir strømlinede metoder til ex vivo gammatælling af sygdomsrelevante organer, herunder knoglemarv, rygmarv og milt, sammen med højopløsnings autoradiografi af CD19-sporbindingen i CNS-væv.

Introduction

MS er en immunmedieret neurologisk lidelse; Den unikke præsentation i hver patient kan gøre ledelsen udfordrende for både patienter og klinikere¹. Selve sygdommen er karakteriseret ved tilstedeværelsen af demyeliniserende læsioner og immuncelleinfiltration i hjernen og rygmarven, hvilket resulterer i fysisk og kognitiv svækkelse². Det traditionelle paradigme om, at MS er en T-cellemedieret sygdom, blev først udfordret i et skelsættende fase II klinisk forsøg med rituximab³, en terapi rettet mod CD20⁺ delmængden af B-celler. Yderligere B-celleterapier er siden blevet udviklet, der er målrettet CD19⁴, en pan B-cellebiomarkør, der udtrykkes på et bredere udvalg af B-celler, hvilket kan være både diagnostisk og terapeutisk fordelagtigt. Desuden giver eksisterende metoder til vurdering af behandlingseffektivitet (dvs. overvågning af antallet af tilbagefald og magnetisk resonansbilleddannelse [MR] aktivitet) ikke tidlige mål for respons - hvilket placerer patienter i betydelig risiko for CNS-skade på grund af suboptimal behandlingsvalg og optimering. Derfor er der et kritisk behov for strategier til overvågning af specifikke immunceller, såsom CD19⁺ B-celler, i realtid i CNS og periferien af MS-patienter.

PET-billeddannelse er en robust billeddannelsesteknik, der tillader in vivo , helkropsvisualisering af et givet mål af interesse, såsom CD19. Mens blod trækker, optegnelser over tilbagefaldshastigheder og læsionsovervågning via MR giver øjebliksbilleder af behandlingseffektiviteten, kan PET-billeddannelse give forskere og klinikere mulighed for at overvåge effektiviteten af en terapi på tværs af hele kroppen. Denne proaktive tilgang til terapeutisk overvågning gør det muligt for klinikere at vurdere medicineffektiviteten i realtid, hvilket muliggør hurtige justeringer efter behov. Overvågning af placeringen og tætheden af cellepopulationer, der er forbundet med sygdom, muliggør også langsgående vurdering af sværhedsgraden ved hjælp af patientspecifik anatomisk information. Det er derfor vigtigt at etablere reproducerbare analysemetoder for pålideligt at udnytte PET-billeddannelsens fulde potentiale i kliniske og prækliniske omgivelser.

Dette papir beskriver metoder (figur 1) til at udføre PET-billeddannelse, ex vivo gammatælling og autoradiografi (ARG) af CD19 ⁺ B-celler med et 64 Cu-mærket anti-humant CD19 monoklonalt antistof (mAb), kendt som 16C4-TM (⁶⁴Cu-hCD19-mAb), i den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) musemodel af MS induceret i transgene mus, der udtrykker human CD19 (hCD19) ved anvendelse af humant rekombinant myelin oligodendrocytglycoprotein 1-125 (MOG_1-125). Vi leverer også metoder til at vurdere radiosporbindingen nøjagtigt og reproducerbart i hjernen og rygmarven, begge kritiske steder for patogenese, der ofte er hårdt ramt i denne og andre neurodegenerative modeller. Disse teknikker muliggør ikke-invasiv undersøgelse af B-cellers rolle i sygdomspatologi og har potentiale til at blive klinisk oversat for at vurdere effekten af anti-B-celleterapier i MS.

Protocol

Figur 1: Undersøgelsens udformning. En oversigt over nøgleteknikker i denne artikel. (A) Placering af musene i scanningslejet på ryggen reducerer bevægelse i rygsøjlen. B) PET/CT-billeddannelse af musene. (C) Lav et snit ned langs dyrets dorsale side for at afsløre rygsøjlen. (D) Rygsøjlen gennemskæres i cervikale/thorax- og lændehvirveldele, og sektionerne fjernes efter de fem angivne snit. (E) Brug en sprøjte til at fjerne rygmarven fra rygsøjlen ved at forsegle sprøjten og rygsøjlen og skylle fra rygsøjlens kraniale og kaudale ender som vist. F) Isolerede segmenter af cervikal/thorax og lændehvirvelsøjlen. Forkortelse: PET/CT = Positronemissionstomografi/computertomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) ved Stanford University, et program akkrediteret af Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Mus blev akklimatiseret til vivarium i mindst 7 dage før studiestart for at minimere stress på musene, da stress kan påvirke EAE-induktion.

1. EAE-induktion i kvindelige humaniserede CD19-mus

1. Inducer humaniserede CD19 C57BL/6J hunmus i alderen 9-13 uger med EAE som tidligere beskrevet⁵ ved hjælp af MOG_1-125.

2. Dyrepleje og scoring i EAE-musemodel

1. Score sygdomsprogression og pleje af musene som tidligere beskrevet⁵. Kort fortalt skal du score denne model på en skala fra 1-5 som følger: 1 er halesvaghed / halthed, 2 er svækket bagben, 3 er lammelse af bagben, 4 er lammelse af bagben med svaghed i forbenene, 5 er døende.

3. mAb-konjugering, radioaktiv mærkning og karakterisering

1. Den bifunktionelle chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyremono-N-hydroxysuccinimidester (DOTA-NHS-ester) konjugeres til hCD19-mAb til radioaktivt mærke med ⁶⁴Cu.
   1. Brug en afsaltningskolonne til at udskifte hCD19-mAb-opbevaringsbufferen med HEPES-buffer (pH 8,5-9): konditioner afsaltningskolonnen/-kolonnerne med HEPES. Beregn antallet af nødvendige kolonner baseret på afsaltningskolonneprøvevolumenkapacitet og krævet volumen mAb: 0,5 ml rør: 30-130 μL prøvevolumen, 300 μL vask; 2 ml rør: 200-700 μL prøvevolumen, 1 ml vask.
   2. Centrifugen afkøles til 4 °C med henblik på bufferudskiftning via afsaltningskolonnen.
   3. Tag afsaltningskolonnen ud af køleskabet. Fjern bunden af afsaltningssøjlen, løsn hætten, og læg søjlen i et opsamlingsrør.
   4. Der centrifugeres ved 1.500 × g i 2 minutter for at fjerne opbevaringsopløsningen; Kassér gennemstrømningen, der indeholder opbevaringsopløsningen, og genbrug opsamlingsrøret. Marker en linje på søjlen, hvor det højeste punkt på den afsaltende komprimerede harpiks skråner opad.
   5. Tilsæt HEPES-buffer til undersiden af afsaltningskolonnen. Afsaltningskolonnen anbringes i centrifugen med ledningen vendt udad; Drej ved 1.500 × g i 2 min. Kassér gennemstrømningen, og genbrug opsamlingsrøret.
   6. Gentag trin 3.1.4 og 3.1.5 2x med det samme opsamlingsrør, og gennemløb mellem trin kasseres.
   7. Den konditionerede afsaltningssøjle anbringes i et nyt opsamlingsrør og en ny etiket. dette rør vil indeholde hCD19-mAb.
   8. Der tilsættes hCD19-mAb øverst i de(n) konditionerede afsaltningskolonne(r), og brug HEPES-buffer til at skylle det tomme mAb-hætteglas; Tilføj dette øverst i afsaltningskolonnen (samlet volumen i henhold til producentens anbefaling). Spin ved 1.500 × g i 2 minutter for at eluere hCD19-mAb. Hold gennemstrømningen, der indeholder hCD19-mAb.
   9. Mål koncentrationen af hCD19-mAb ved hjælp af et UV/Vis-spektrofotometer, og juster om nødvendigt til 0,5 μg/μL med HEPES-buffer.
   10. Til hCD19-mAb-opløsningen tilsættes 1/50^th volumenet af mAb-opløsningen på 0,5 M EDTA for at opnå den endelige koncentration af EDTA 0,01 M i hCD19-mAb-opløsningen. Lad hCD19-mAb-EDTA-opløsningen stå ved stuetemperatur i 15 min.
   11. Fjern DOTA-NHS-esteren fra fryseren og lad den komme til stuetemperatur (10-15 min). Beregn volumenet af DMSO, der skal føjes til DOTA-NHS-esteren for at lave en DOTA-koncentration, der tillader tilsætning af det ønskede DOTA/mAb-molære forhold (som typisk er i størrelsesordenen 1-2 DOTA/mAb).
       BEMÆRK: Mængden af DMSO-DOTA-NHS-ester, der føjes til hCD19-mAb, må ikke overstige 10 % af mAb-volumenet. Dette skal gøres ved hjælp af et regneark, så det kan gøres hurtigt og gentagne gange.
   12. Baseret på det ønskede forhold mellem DOTA og hCD19-mAb beregnes mængden af DOTA-NHS-ester, der skal føjes til hCD19-mAb.
       nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → ml DMSO → fortyndingsfaktor for DOTA/DMSO-opløsning
   13. Der afvejes 1-2 mg DOTA-NHS-ester, og det korrekte rumfang (beregnet i trin 3.1.11) DMSO tilsættes forsigtigt til DOTA-NHS-esteren. Bland og drej ned.
   14. Det beregnede volumen af DOTA-NHS-ester-opløsningen (trin 3.1.12) pipetteres ind i hCD19-mAb-opløsningen; Tør ydersiden af pipettespidsen af inden tilsætning for at sikre, at der ikke tilsættes ekstra DOTA-NHS-ester (uden at ændre mængden i pipetten). Bland forsigtigt og drej ned.
   15. Anbring i køleskabet (4 °C) for at reagere natten over (12-16 timer).
2. Oprensning og koncentration
   1. Centrifugen afkøles til 4 °C for centrifugalkoncentratorbufferens udskiftningstrin; læg en PCR-rørblok af metal på tøris til snapfrysning af konjugatet.
   2. Fjern DOTA-hCD19-mAb-reaktionen fra køleskabet og sluk ved at tilføje TRIS-buffer af biologisk kvalitet: 10% af det samlede reaktionsvolumen. Der fjernes 10-20 μg af prøven til massespektrometrianalyse.
   3. Afsaltningskolonnen/-kolonnerne konditioneres som beskrevet ovenfor (trin 3.1.1-3.1.5) med 0,1 M ammoniumacetatbuffer, pH 5,5.
   4. Bufferudskiftning af DOTA-hCD19-mAb-opløsningen med ammoniumacetat (trin 3.1.1-3.1.8).
   5. Koncentrer DOTA-hCD19-mAb-opløsningen: Tilsæt opløsningen til en 50 kDa molekylvægt afskåret centrifugalkoncentrator efter producentens volumenanbefalinger. Centrifuger ved 4.000 × g i 10 minutter (eller indtil volumenet er reduceret med 80% -90%); Kassér gennemstrømningen.
   6. Gentag ni gange mere (10 i alt): Tilsæt nok ammoniumacetat til at bringe lydstyrken tilbage til det maksimale anbefalede volumen.
      BEMÆRK: Det samlede antal skal være det, der oprindeligt blev tilføjet, inklusive det, der er tilbage i kolonnen, normalt 400-450 μL for en centrifugalkoncentrator med kapacitet på 500 μL.
      1. Hætteglasset med reaktion skylles med ammoniumacetatbuffer for at udtage eventuelle resterende DOTA-hCD19-mAb; Tilsæt vasken til centrifugalkoncentratoren.
      2. Der centrifugeres ved 4.000 × g i 10 min.
         BEMÆRK: Centrifugeringstiden kan reduceres på efterfølgende spins, hvis lydstyrken reduceres til 80% -90% på kortere tid.
   7. Proteinopløsningen fjernes fra centrifugalkoncentratoren. Bemærk den samlede diskenhed af DOTA-hCD19-mAb.
      1. I centrifugalkoncentrator 2 tilsættes tilstrækkelig ammoniumacetatbuffer til et samlet volumen på 100 μL og pipette til blanding. Centrifugalkoncentratorsøjlen lukkes og vendes om. Drej ved 4.000 × g i 2 minutter for at opsamle opløsningen. Overfør til et nyt rør.
      2. I centrifugalkoncentrator 500 anvendes en pipette til at opsamle mAb-opløsningen fra centrifugalkoncentratoren. Føj til et nyt rør.
   8. Mål koncentrationen ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer. Hvis koncentrationen er over 2 mg/ml, fortyndes med ammoniumacetat til 2 mg/ml.
   9. Alikvote 100 μg pr. PCR-rør (ca. 50 μL); mærke rørene med DOTA-hCD19-mAb, dato, masse og koncentration. Drej hætteglassene ned.
   10. Snap-frys DOTA-hCD19-mAb på den afkølede PCR-blok på tøris (eller frys på tøris). Når alle prøverne er frosne, anbringes de i en fryser til -80 °C.
   11. Mål antallet af DOTA pr. hCD19-mAb ved massespektrometri. Opbevar en prøve af ukonjugeret (rent) antistof fra hver konjugering for at beregne forholdet. Brug ligning (1) angivet nedenfor; molekylvægt forkortes MW.
       (1)
3. Mærkning af radioaktive stoffer
   BEMÆRK: Brug passende personlige værnemidler (PPE) til håndtering af radioaktivitet, herunder en laboratoriefrakke, handsker og en personlig krop og ringdosimetre, i henhold til institutionelle regler. Undersøg og skift handsker regelmæssigt for at forhindre radioaktiv kontaminering. Brug blyafskærmning og øg afstanden fra den radioaktive kilde ved at håndtere med tang, når det er muligt.
   1. Overfør radioaktivitet fra hætteglasset til et nyt hætteglas ved hjælp af en pipette. Mål radioaktiviteten.
   2. Fjern en prøve til den første radioaktive mærkningsreaktion. Der tilsættes 50 μL ammoniumacetat (pH 5,5)_{pr. 1} mCi ⁶⁴Cu-CuCl3. Mål pH-værdien ved at pipettere 1 μL på en pH-strimmel med et område, der fanger 5,5 med tilstrækkelig opløsning til at skelne mellem 5 og 6.
   3. Hvis pH-værdien ikke er 4-5,5, ændres den med 1 M NaOH eller 0,1 M HCI. Der tilsættes små mængder, 1-5 μL, af 1 M NaOH, hvis pH er mindre end 4 eller 0,1 M HCl, hvis pH er større end 5,5, indtil den korrekte pH er nået. Med hver tilsætning blandes grundigt, centrifugeres ned og måles pH som beskrevet ovenfor. Bemærk hver tilsætning og fjernelse af enhver opløsning (herunder for at kontrollere pH), så det endelige volumen kan beregnes.
   4. Når den optimale pH er opnået, tilsættes 10 μg DOTA-hCD19-mAb pr. 1 mCi ⁶⁴Cu-CuCl3. Bland forsigtigt og drej kort ned.
   5. Hætteglasset med reaktion anbringes på en termomixer, der er indstillet til 37 °C og 400 omdrejninger pr. minut (rpm).
   6. Efter 30 minutter slukkes reaktionen: divider det totale reaktionsvolumen med 50, og tilsæt det volumen på 0,5 M EDTA til reaktionsblandingen.
   7. Bestem mærkningseffektiviteten ved hjælp af øjeblikkelig tyndtlagskromatografi (ITLC) for at måle procentdelen af bundet og frit kobber i opløsningen.
      1. Klip 1 cm brede strimler TLC-papir. Marker 1 cm fra toppen og bunden af strimlen og forbered et rør (50 ml konisk kolbe) med mobil fase mindre end 1 cm 0,1 M citronsyre (niveauet af mobil fase skal være under 1 cm mærket på strimlen, når den placeres i røret).
      2. Pipette 1 μL af reaktionsopløsningen på strimlen ved det nederste 1 cm mærke (opløsningsmiddelfront) og anbring strimlen i røret. Se, indtil opløsningsmiddelfronten når det øverste 1 cm-mærke, fjern strimlen og pakk den ind i et stykke plastfolie.
      3. Placer strimlen på platformen og kør den gennem en radio-TLC-billedscanner. Se efter den radioaktivt mærkede mAb ved oprindelsen og fri ⁶⁴Cu, der bevæger sig med den mobile fasefront (figur 2). Hvis procentdelen af frit kobber er mindre end 5% (95% mærkningseffektivitet), fortsæt med injektion i dyr. Hvis procentdelen af frit kobber er større end 5%, fortsæt med rensning.
         BEMÆRK: Procentdelen af frit kobber afhænger generelt af forholdet mellem DOTA-mAb og ⁶⁴Cu, reaktionstid, pH og temperatur. Reaktionsbetingelserne skal optimeres af hver bruger for hver ny mAb for at sikre ensartede resultater.
4. Oprensning via en tyngdekraftssøjle af engangs-DNA-kvalitet
   1. Konditioner en engangs-DNA-kvalitet tyngdekraftsstrømningskolonne (afsaltnings-/bufferudvekslingskolonne) i henhold til producentens anvisninger. Anbring tyngdekraftssøjlen af DNA-kvalitet på et ringstativ eller et andet instrument bag tilstrækkelig blyafskærmning; Sørg for, at apparatet er stabilt og let at flytte. Placer røret under søjlen.
   2. Den rå reaktionsblanding pipetteres på tyngdekraftsstrømningssøjleharpiksen. Vent, indtil al væsken er strømmet ind i harpiksen. Der pipetteres tilstrækkeligt PBS til at bringe hele volumenet (råprodukt plus PBS) op på 500 μL. Bortskaf gennemstrømningen.
   3. Placer søjlen over 1,5 ml centrifugeglas mærket 1-10. Føj 1 ml PBS til kolonnen. Saml fem dråber i hvert rør, indtil strømmen er stoppet.
      BEMÆRK: Der kan kræves færre end 10 rør.
   4. Hætte bunden af søjlen og mål den resterende radioaktivitet. Mål hvert hætteglas med gennemløb. For hvert hætteglas med mere end 50 μCi fremstilles en ITLC pr. trin 3.3.7 til måling af det procentbundne kobber i hver fraktion.
      BEMÆRK: Den første en eller to fraktioner indeholder kun mobilfase; den radioaktivt mærkede mAb elueres først (typisk fraktion 2 eller 3 til 5 eller 6), og den frie ⁶⁴Cu elueres sidst (nogle holder sig til kolonnen). Den procentbundne ⁶⁴Cu kan variere mellem fraktioner.
   5. Kombiner fraktionerne med mere end 95% binding (mindre end 5% frit kobber); Brug injektionsvæsken, opløsning. Hvis det ønskes, skal du udføre størrelsesudelukkelse HPLC for at bekræfte radiomærkning⁵ og beregne den molære aktivitet. Gem en prøve for at måle koncentrationen på et UV-Vis-spektrofotometer, efter at det har henfaldet 10 halveringstider (127 timer eller 5,3 dage).

4. Forberedelse af dosis

BEMÆRK: Før du håndterer dosis, skal du bære korrekt PPE, herunder laboratoriefrakke, krops- og fingerdosimetre og handsker.

1. Der injiceres ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 timer før PET-scanning for at muliggøre tilstrækkelig cirkulation af radiosporstoffet i kroppen.
2. Placer straks blybeholderen med ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb bag blyafskærmning. Tænd geigertælleren for at overvåge potentiel forurening.
   BEMÆRK: Skift handsker ofte ved håndtering af radioaktivt materiale. Dobbelthandske, mens du trækker doser, anbefales for at lette hurtige handskeskift. Placer altid forurenede skarpe genstande og affald i det udpegede afskærmede affaldsområde.
3. ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb fortyndes til en passende koncentration i et 1,5 ml plastcentrifugerør med lav binding.
   BEMÆRK: ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb binder til plastik, hvis den ikke er lavbindende; ⁶⁴Cu binder til glas.
   1. Fortynd radiosporstoffet i saltvand for at forhindre radiolyse og forenkle udtagning af ensartede doser.
   2. Forbered doser til administration af mellem 75 og 150 μCi i 100 μL, hvis det er muligt. Sørg for, at den maksimale samlede injicerede volumen ikke overstiger 10 % af musens kropsvægt.
4. Brug en 500 μL (50 cc) insulinsprøjte til at trække dosis fra plastrøret med lav binding. Sørg for, at der ikke er bobler i sprøjten, da den injiceres intravenøst.
   1. Formærk sprøjterne med de tilsvarende dyrenumre.
   2. Registrer dosisaktiviteten og tiden i en laboratorienotesbog til dataanalyse.
   3. Hav doserne klar til injektion, så snart dyrene er kateteriseret for at reducere tiden under anæstesi.
5. Når doserne er klargjort, skal du forberede en standard (fantom) til scanning for at generere en kalibreringsfaktor.
   1. Fyld et 15 ml konisk rør med 50-75 μCi aktivitet fortyndet i vand (eller PBS).
      BEMÆRK: Sørg for grundig blanding af opløsningen. Standarden kan være fri ⁶⁴Cu tilbage fra mærkning.
      1. Mål mængden af aktivitet i standarden og registrer tiden.

5. Kanylering og injektion

BEMÆRK: Se tidligere beskrevne metoder 6 til intravenøs kanylering af mus til injektion af radiosporstoffet⁶.

1. Musene vejes og bedømmes for sygdommens sværhedsgrad som beskrevet i pkt. 2.1, før musene bedøves i en knockdown-boks fyldt med 1,5-3 % isofluran som forberedelse til administration af radioaktivt sporstof.
   BEMÆRK: Disse mus vil blive injiceret på bordpladen, ikke på PET-scanneren som tidligere beskrevet. Det er ikke nødvendigt at lime katetrene på plads til injektion, da musene ikke flyttes mellem kanylering og injektion.
2. Når en mus er kanyleret, skal nålen indsættes i enden af kateteret og injiceres langsomt. Efter injektionen følges op med en lille saltvandsskylning gennem kateteret for at sikre, at hele dosis injiceres.
   BEMÆRK: Volumenet skal omtrent svare til kateterets døde volumen, hvilket er 50 μL for de katetre, der anvendes af forfatterne.
   1. Injicer over et stykke laboratorieserviet for at opsamle eventuelle dryp af radiospor; Medtag dette ved måling af restdosis.
   2. Registrer tidspunktet for injektion i en laboratoriebog.
3. Fjern kanylen umiddelbart efter injektionen. Mål kanylen, doseringssprøjten og vævet ved hjælp af en dosiskalibrator for at bestemme den restdosis, der ikke blev injiceret i musen.
   1. Registrer aktiviteten og tiden i en laboratorienotesbog.
4. Når musene er injiceret, skal du mærke deres bure med et burkort, der angiver, at musene er radioaktive. Registrer og log burene i henhold til institutionelle retningslinjer. Placer derefter musene i et udpeget radioaktivt opbevaringsområde.

6. PET/CT-billeddannelse

1. Der udføres PET-billeddannelse 18-24 timer efter injektion af ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Vej og bedor musene inden scanning.
   BEMÆRK: Scannerens betjeningsvejledning afhænger af den scanner, der bruges.
   1. Sørg for, at røntgenkomponenten i PET/CT-scanneren er opvarmet og klar til anskaffelse.
   2. Åbn softwaren til anskaffelse af PET-scanneren på computeren.
   3. Fra rullemenuen Investigator Login skal du klikke på de relevante laboratorieoplysninger.
   4. På siden Projekt skal du enten oprette et nyt projekt eller vælge et eksisterende projekt i rullemenuen.
   5. Når initialiseringsprompten automatisk vises på skærmen, skal du klikke på Home Bed og vente på seng til hjem. Klik derefter på Varm op CT.
      1. Sørg for, at CT-afskærmningsdøren er lukket, så CT kan varme op.
2. Mens scanneren varmer op, skal du score EAE-musene og injicere dem subkutant med 0,2-0,4 ml varmt saltvand i flanken for hydrering.
3. Når scanneren er varmet op, skal du gå tilbage til computeren for at konfigurere PET-scanningerne til undersøgelsen.
   BEMÆRK: Disse kan sættes op før scanningsdagen.
   1. Under overskriften Seneste undersøgelser skal du klikke på Opret ny undersøgelse. Udfyld undersøgelsens navn, protokol, forbindelse og emneoplysninger.
      1. Hvis du udfører en PET/CT, skal du først vælge PET-protokol og derefter vælge CT-protokol.
         BEMÆRK: Typisk er en standard CT tilstrækkelig til scanning af EAE-musemodellen. En CT-scanning er 1 min lang og erhvervet med binning ved 2 x 2 ved spænding 80 kVp, strøm 150 μA og 720 fremspring. CT-billeder rekonstrueres ved hjælp af en modificeret feldkampalgoritme.
      2. For PET-protokollen skal du vælge en 10-15 minutters statisk 64-kobberscanning. Hvis denne scanning ikke allerede er på listen over tilgængelige protokoller, skal du tilføje den ved at klikke på fanen Protokoller i menuen Standard , Opret ny protokol | Rullemenuen Isotoper . Hvis den ønskede isotop ikke er angivet, skal du klikke på Mere | Tilføj fra bibliotek og tilføj den ønskede isotop. Definer scanningens varighed, klik på alternativknappen for statisk scanning, navngiv protokollen og klik på Gem.
      3. Gå tilbage til fanen Studier , og fortsæt med at navngive og konfigurere alle de ønskede scanninger for dagen.
         BEMÆRK: Det anbefales også at oprette en "CT-test" -scanning ved kun at bruge en standard CT for at kontrollere sengens placering af den første scanning for at sikre optimal placering. Dette bør være den første scanningskørsel for undersøgelsen.
4. Når scanneren er klar, bedøves musene i en knockdown-boks for at forberede dem til scanningen.
   BEMÆRK: På dette stadium er musene sandsynligvis meget syge; Det er bedste praksis at minimere tiden under anæstesi.
   1. Påfør øjengel.
5. Sørg for, at scanningslejet med fire mus er udstyret med varmeelementer, såsom varmepuder eller opvarmet luft, med isofluran indstillet til 1,5% -2% og varmepude tændt (figur 3). Placer musene i liggende stilling på scanningslejet.
   1. Efterhånden som EAE-sygdommen skrider frem, bliver musens rygsøjle alvorligt buet. Scan musene, mens de er på ryggen for at rette rygsøjlen så meget som muligt, hvilket forbedrer analysen nedstrøms. Træk forsigtigt musehalen for at hjælpe med at rette rygsøjlen.
6. Når du er i liggende stilling, skal du tape hver mus sikkert på plads med blødt mikroskoptape. Brug en strimmel tape over hovedet og en anden forsigtigt over maven for at minimere bevægelse på grund af vejrtrækning.
   1. Optag i en laboratorienotesbog, hvilken mus der er i hvilken scanningsposition.
7. Når musene er sikret, skal du vende tilbage til scanningscomputeren for at betjene scanneren.
8. Åbn menuen Bevægelsescontroller . Klik på PET Center FOV for at flytte musene på scanningslejet ind i PET-ringen. For dagens første scanning skal du klikke på CT Center FOV. Når du er på plads, skal du køre CT-testscanningen for at sikre, at positionen er korrekt; Gentag indtil sengens position er tilfredsstillende.
   1. Placer et lille stykke hvidt tape på scanningslejet for at markere den korrekte sengeplacering for resten af undersøgelsen.
9. Når sengen er på plads til PET-scanningen, startes scanningssekvensen ved at klikke på Kør.
   1. Vent på, at scanneren automatisk flytter fra PET-ringen til CT-adressen.
   2. Kontroller altid visuelt, om dyrene har bevæget sig i den rigtige position for både PET og CT.
   3. Registrer scanningens starttidspunkt i en laboratorienotesbog for henfaldskorrektion af den dosis, der injiceres under dataanalyse.
10. Når scanningen er fuldført, skal du lade billedet rekonstruere. Kontroller dataene, før du fjerner dyrene.
    BEMÆRK: 3D-ordnede undersæt forvente-maksimering (OSEM) rekonstruktion tager ca. 5 minutter for en statisk scanning.
11. Kontroller og godkend dataene visuelt ved hjælp af milten som en positiv kontrol, da dette væv indeholder et stort antal B-celler. Fjern dyrene fra scanningslejet og læg dem i en isofluranfyldt knockdown-boks som forberedelse til perfusion og efterfølgende dissektion.
12. Gentag trin 6.5-6.12 for de resterende mus i undersøgelsen.
13. Når alle musene er scannet, eller når du scanner en gruppe, der har et åbent sted i scanningslejet, skal du scanne standarden, der er udarbejdet i trin 4.6.

7. Dissektion til ex vivo gammatælling og autoradiografi

1. Før du dissekerer, skal du sikre dig, at alle gammatællinger og centrifugerør er vejet på forhånd.
2. Udfør eutanasi via perfusion, som tidligere beskrevet⁶, med PBS og thoracotomi, mens musene bedøves dybt (kontinuerlig inhalation af 4% isofluran, 2 L/min 100%_O2).
3. For at fjerne knoglemarven skal du skære begge lårben ved knæ og bækken. Sørg for, at begge hoveder fjernes fra lårbenet.
   1. Placer begge lårben i et 0,5 ml centrifugerør, der har et hul i bunden (ved hjælp af en 20 G nål) og har låget skåret af.
   2. Anbring 0,5 ml røret indeholdende lårbenene inde i et 1,5 ml centrifugerør med låget afskåret.
   3. Placer hele røropsætningen i en minicentrifuge. Spin i 4 min ved 4.500 × g.
      BEMÆRK: Knoglemarven skal løsnes gennem hullet i 0,5 ml centrifugerøret og sætte sig i bunden af 1,5 ml centrifugeglasset.
      1. Adskil rørene. Vej de tomme lårben i 0,5 ml centrifugeglasset. Vej knoglemarven i 1,5 ml centrifugeglasset. Hvert centrifugeglas anbringes i gammatællerør.
4. Fjern hjernen ved hjælp af tang og saks, og pas på at holde hjernestammen intakt. Placer hjernen i et gammatællerør. Registrer tørvægten, skyl med PBS, og hold den på is, indtil den er klar til tælling.
5. Udfør følgende trin for at fjerne rygmarven.
   1. Fjern huden og pelsen ved at lave et snit ned ad dyrets dorsale side for at udsætte rygsøjlen (figur 1).
   2. Adskil lændehvirvelsøjlen (L) fra livmoderhalsområdet (C) og thoraxområdet ved at skære langs tre tværgående planer rundt om og gennem rygsøjlen: ved bunden af nakken (C1-hvirvelen) (figur 1D, nummer 1); ved bunden af brystkassen (L1-hvirvelen) (figur 1D, nummer 2); ved bunden af bækkenet (L5-hvirvelen) (figur 1D, nummer 3).
   3. Skær under ribbenburet (figur 1D, nummer 2).
   4. Skær direkte over korsbenet for at adskille lændehvirvelsøjlen. Trim forsigtigt rygsøjlen fra bækkenenden, indtil lændehvirvelsøjlen er synlig (figur 1D, nummer 3). Trim de omgivende væv af for at isolere lændehvirvelsøjlen og livmoderhalsen / thoraxområdet (figur 1D, nummer 4 og 5).
   5. For at udstøde rygmarven skal du bruge en slip-tip sprøjte (3-10 ml) fyldt med PBS. Opret en forsegling mellem sprøjten og rygsøjlen ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren.
      1. PBS skubbes forsigtigt gennem sprøjten for at presse rygmarven ud på en absorberende pude (figur 1E); Gentag for begge rygmarvsregioner. Placer rygmarvsvævet i et gammatællerør.
      2. Optag tørvægten, og tilsæt PBS for at sikre, at vævet er i bunden af røret for at undgå tørring. Placer røret på is, indtil det er klar til tælling.
      3. Udstød halsmarven fra kranieenden og lændehvirvelmarven fra rygsøjlens kaudale ende (figur 1E).

8. Ex vivo gammatælling

1. Åbn gammatællersoftwaren. Naviger til arbejdslisten, og vælg den ønskede protokol, såsom en 30 s tælleprotokol for ⁶⁴Cu.
2. Forbered mindst tre standarder i separate rør. Kør dem nu til brug i analyse (trin 10.2). Målet er at lave tre replikate volumener og mængder af aktivitet i tre separate rør.
   BEMÆRK: Et volumen på 500 μL giver gode resultater. Mens aktiviteten bestemmes af den anvendte maskine, fungerer 10 μCi generelt godt.
3. Placer standarderne i et rack mærket med stregkoden, der svarer til den ønskede protokol, der skal køres. Placer stativet på gammatælleren.
4. Efter registrering af organvægtene anbringes rørene med organerne på gammatællestativet efter rørene, der indeholder standarderne.
   BEMÆRK: Organer af interesse for denne model kan omfatte aksiale lymfeknuder, blod, knoglemarv, hjerne, cervikale lymfeknuder, lårben, hjerte, lever, lændehvirvelsøjlen, muskel, milt, hale og cervikal / thorax rygmarv.
5. Sæt et stativ med en stopstregkode bag på gammatælleren.
6. Tryk på knappen Afspil på computeren. Hvis det er muligt, skal du ikke trykke på Afspil , før der er flere stativer eller organer, der skal køres, så alle rør kan tælles kontinuerligt i en fil. Sørg for, at der er et stativ med en stopstregkode bag på gammatælleren for hver kørsel.
7. Kør, indtil alle prøverne er talt. Gem og eksporter filen.

9. Ex vivo-autoradiografi (ARG) af CNS-væv

1. Følg tidligere offentliggjorte trin for både hjerne- og rygmarvs-ARG (undtagen trin 2-6 beskrevet af Chaney et al., da musene allerede injiceres med radiosporstof fra PET-scanningen)⁶.
   BEMÆRK: Specifikke instruktioner til klargøring af rygmarven ARG-kassetten er angivet her⁶.
2. Når gammatællingen er afsluttet for lændehvirvelsøjlen og halsmarven / thorax rygmarven, skal du straks placere rørene på is, indtil alt CNS-væv er talt.
   BEMÆRK: Se den tidligere offentliggjorte metode for ARG i hjernen⁶.
3. Tip forsigtigt rørene for at lade rygmarven falde ud på en absorberende pude. Hvis rygmarven klæber til siden af røret, skylles forsigtigt med kold PBS og vippes røret igen. Tør forsigtigt hver rygmarv ved forsigtigt at blotte med et laboratorievæv. Placer de tørrede rygmarv på en organiseret måde på et tykt sort stykke papir.
   1. Mærk ved siden af rygmarven med en hvid pen for nem identifikation.
   2. Efterlad plads i hjørnerne og i midten af det sorte papir for at placere stakke af tre mikroskopglas for at fungere som afstandsstykker for at forhindre komprimering af rygmarven, når ARG-kassetten er lukket. Brug 5-7 stakke.
4. Når alle lændehvirvelsøjlen og halsmarven / thorax rygmarven er placeret på det sorte papir og mærket, skal du forsigtigt placere papiret i ARG-kassetten. Placer den åbne kassette på en bakke tøris for at fryse rygmarven.
5. Når den er frosset, placeres plastfolie forsigtigt mellem den digitale fosforopbevaringsskærm og rygmarven og placeres oven på prøverne. Luk straks kassetten og læg den i -20 °C fryseren i ca. 10 halveringstider (~127 timer).
6. Når eksponeringstiden er færdig, skal du scanne filmen ved hjælp af et fosforkamera. Analyser det resulterende digitale billede (se afsnit 12 for instruktioner).

10. Analyse af biodistributionsdata

1. Opret et regneark med "Dosiskorrektion" til matematisk at bestemme tidskorrektionen for det radioaktive henfald, hvilket normaliserer strålingsdoser og tillader sammenligninger mellem forsøgspersoner.
   1. Henfaldskorriger alle doser til injektionstiden, idet der tages højde for restaktivitet, der er tilbage i sprøjten og kateteret efter injektionen.
   2. Ved hjælp af standarderne udarbejdet i trin 8.2 beregnes aktivitetsmængden (μCi) og normaliserede tal pr. minut (CPM). Divider den gennemsnitlige CPM med den gennemsnitlige standardaktivitetsmængde for at få CPM / μCi.
      BEMÆRK: Sørg for, at aktivitetsmængden for hver standard er henfaldskorrigeret til det tidspunkt, hvor gammatælleren tæller CPM for standarderne. Gammatælleren skal normalisere alle CPM-værdier til protokollens starttidspunkt.
2. Opret regnearket "Resultater" for at beregne den endelige procent injicerede dosis pr. gram væv (% ID / g) for hver prøve.
   1. Henfaldskorrigering af den normaliserede CPM fra gammatælleren for hver prøve, der tælles til dyrets injektionstid.
      BEMÆRK: Forfaldskorrektion kan være til ethvert tidspunkt; sikre, at alle doser og CPM-værdier korrigeres for henfald til samme tidspunkt.
   2. Normaliser den henfaldskorrigerede CPM til massen af hver prøve for at bestemme CPM pr. prøve. Beregn det samlede antal injicerede CPM ved at trække CPM i halen fra det beregnede injicerede CPM.
      BEMÆRK: Halen behøver ikke at blive massekorrigeret, da denne CPM-værdi blot trækkes fra det samlede injicerede CPM for at tage højde for eventuelle ekstravenøse sporstoffer fra injektion.
   3. Divider CPM pr. masse med det samlede antal indsprøjtede CPM for at beregne %ID/g.
3. Opret et "Oversigt" regneark for at vise de endelige resultater til input i en grafsoftware og efterfølgende datavisualisering og statistisk analyse.

11. Analyse af PET-billeder

1. Åbn PET-analysesoftwaren. slikke på fil |Åbn lokale data | DICOM. Find den ønskede fil (DICOM-format). Åbn både PET og CT.
2. I Data Manager skal du justere PET - og CT-kontrasten til de ønskede niveauer.
3. Registrer og beskær individuelle mus.
   1. I menuen Navigation skal du vælge fanen Omlægning/registrering .
   2. Gå til den stive menu på denne fane. Angiv CT-scanningen (0) som den faste scanning og PET-scanningen (1) som scanningen i bevægelse.
   3. Vælg Stiv transformation og Hurtig kvalitet. Klik på Tilmeld.
   4. Når registreringen er fuldført (5-10 min), skal du klikke på fluebenet for at gemme registreringen.
   5. Undersøg dataene visuelt for at sikre, at registreringen lykkedes. Eksporter sessionen ved at klikke på Filer | Session | Eksport.
   6. Beskær derefter hver mus i en fuldkropsbeskæring: gå til navigationsmenuen og klik på Beskæring. Træk siderne af hvert tværsnit fra yderkanten indad.
   7. Når den ønskede mus er tæt beskåret, skal du klikke på fluebenet og eksportere sessionen for at gemme.
   8. Derefter skal du beskære og rette hovederne på hver mus til hjerneanalyse ved hjælp af den manuelle oversættelse, rotationer og flips i menuen Registrering / omorientering . Eksporter for at gemme.
4. Analyser rygmarven.
   1. For at starte analysen af interesseområder (ROI'er) i rygmarven skal du åbne 3D-ROI-værktøjet fra navigationsmenuen .
   2. Under overskriften ROI skal du bruge plustegnet nederst i menuen til at oprette seks ROI'er: Navbal ROI, Cervikal / Thoracic ROI, Lumbal Skeleton, Thoracic Skeleton, Lumbal Spinal Cord, Thoracic Spinal Cord.
      BEMÆRK: Lændehvirvel- og livmoderhals-/thorax-ROI'erne er generaliserede store ROI'er, der vil blive brugt til at skabe skelet-ROI'erne (figur 4).
   3. For at undgå visuel interferens fra PET-signalet med dette trin skal du klikke på F3 for at slukke for PET.
   4. Gå til toppen af 3D ROI Tool Operator. Klik på den udfyldte prik til højre for markørsymbolet for at åbne menuen 3D Paint Mode og Erode/Dilat .
   5. Vælg Sfære, og skift størrelsen til 20 pixel. Indstil Dilate til +5.
      1. Før du fortsætter, skal du gå til bunden af menuen. Sørg for, at Lumbal ROI er valgt, da dette er den første ROI , der trækkes.
   6. På CT finder du L6-hvirvlen i rygsøjlen (hvor rygsøjlen møder hofterne). Start en ryghvirvel over L6, tegn en grov ROI Lumbal ROI over de fem hvirvler over hofterne (L1-L5 hvirvler). Skift derefter til Cervikal / Thoracic ROI og spor resten af rygsøjlen til bunden af kraniet.
      BEMÆRK: Dette behøver ikke at være præcist, da det bruges til at angive, hvor Otsu-tærskelværdien skal forekomme i trin 11.4.8.
   7. Når du har tegnet de generaliserede ROI'er, skal du gå til toppen af operatøren. Vælg menuen Segmenteringsalgoritmer .
   8. Fra rullemenuen skal du vælge Otsu Thresholding. For input skal du vælge Lændeafkast. Sørg for, at Lumbal Skeleton er valgt nederst i menuen. I rullemenuen ved siden af Billede skal du sikre dig, at CT-scanningen er valgt, og klikke på Anvend. Gentag for cervikal / thorax ROI og thoraxskelet.
      1. Hvis Otsu-tærskelværdien ikke fremhæver rygsøjlen tilstrækkeligt, skal du bruge Global tærskelværdi og ændre Min-værdien til 350 og Max til 3.500 til manuel tærskel og justere efter behov for at isolere ryghvirvlerne.
   9. Når du har brugt Otsu-tærskelværdier til at oprette skelet-ROI'er, skal du vende tilbage til navigationsmenuen (markørikonet). Slet eller marker enten kolonnen H (skjul) for både den grove lænde- og cervikal-/thorax-ROI'er for at skjule dem. Marker kolonnen I (uforanderlig) for begge Skelet-ROI'er, så de ikke kan redigeres.
   10. Til sidst skal du vende tilbage til toppen af 3D ROI Tool Operator og gå til menuen 3D Paint for at tegne ROI'erne for rygmarv.
       1. Vælg kugleværktøjet igen, og spor rygmarven i skelettet for både lændehvirvel og thorax, hvilket sikrer, at den korrekte ROI er valgt nederst i menuen.
       2. For at slette ethvert investeringsafkast skal du klikke på Kommando / kontrol og tegne over den del, der skal slettes.
       3. Kontroller rygmarvs-ROI fra alle tre planer for at sikre, at der ikke er tegnet ROI uden for rygsøjlen.
5. Eksporter rygmarvsanalyseresultater.
   1. Hvis PET-signalet blev slået fra i trin 11.4.3, skal du trykke på F3 , efter at ROI'erne for rygmarv er tegnet, for at tænde PET igen, eller vælge Visual Controller (VC) og klikke på PET-bjælken.
   2. Gå tilbage til navigationsmenuen (markørikonet). Klik på gitterikonet for at vise tabel. Kopier tabellen til regnearkssoftware og gem.
   3. Til sidst skal du eksportere filen i PET-analysesoftware som beskrevet ovenfor for at gemme de trukne ROI'er.
6. Analyser hjernen ved hjælp af et halvautomatisk 3D-atlas.
   1. Åbn hovedbeskæringsfilen. Importer musens hjerneatlas ved at gå til menuen Avancerede moduler og vælge 3D Brain Atlas Tool. Sørg for, at referencen er indstillet til CT, og at beskæringsindstillingen ikke er markeret. Indstil en sti til outputmappen.
   2. I Avanceret indstilling skal du ændre Transformér til Versor-Affine. Behold alle andre standardindstillinger. Klik på Kør.
   3. Juster atlasset manuelt i menuen Omdirigering/registrering , og brug kraniets CT som retningslinje for montering af atlasset.
      1. Vær meget forsigtig, hvis skalering er nødvendig, da dette i høj grad kan påvirke hjernens strukturvolumener. Klik på fluebenet , når justeringen er afsluttet.
      2. Kør atlasset igen med Importer 3D-investeringsafkast valgt.
      3. Eksporter filen for at gemme atlasset, der er monteret på det beskårne hoved.
   4. Efter tegning og eksport af alle ROI'er fra de ønskede organer beregnes en standard bindende korrektionsværdi. Forfaldskorriger alle data og konverter til %ID/g som tidligere beskrevet⁶. Normaliser til det organ, der passer til dyremodellen, såsom hjertet for at normalisere til radiospor, der er til stede i blodpuljen.

12. Ex vivo-autoradiografi analyse

1. Åbn den digitale billedfil (.gel) ved hjælp af billedanalysesoftwaren. Juster lysstyrke og kontrast til den ønskede tærskel. Anvend en passende farveopslagstabel , hvis det ønskes.
   BEMÆRK: Royal eller Grays anbefales for nem visualisering.

Representative Results

hCD19-mAb var DOTA-konjugeret og radioaktivt mærket med ⁶⁴Cu som vist i figur 2. EAE og naive mus gennemgik PET/CT-scanning (figur 3) 18-24 timer efter injektion med ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. PET/CT-billeder blev co-registreret ved hjælp af PET-analysesoftwaren, og CNS-vævene blev analyseret ved hjælp af manuelle ROI'er eller et halvautomatisk 3D-hjerneatlas. Radiosporbindingen i ROI'er (figur 4) var højere i EAE-mus end i naive mus. Ex vivo gammatælling og ARG viste øget binding i rygmarven (både lændehvirvel- og cervikale thoraxsegmenter) og hjernen (kun ARG) hos EAE-mus sammenlignet med naive (figur 5 og figur 6). Ex vivo gammatælling af perfunderede mus viste også nedsat radiosporbinding i perifere organer, herunder milt, lårben og knoglemarv (figur 5), i overensstemmelse med B-celler, der forlader periferien og infiltrerer CNS i denne EAE-model.

Figur 2: Konjugerings- og radiomærkningsskema til generering af 64 Cu-mærket humanspecifikt CD19 monoklonalt antistof, 16C4-TM mAb (⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb) ud over kvalitetskontroldata. (A) Reaktion mellem DOTA-NHS-ester og hCD19 monoklonalt antistof til fremstilling af hCD19-DOTA-konjugat (ikke i skala) og radioaktiv mærkning med 64 Cu-CuCl3 til fremstilling af ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. B) Repræsentativ ITLC-kromatograf. Toppen ved 40-60 cm er det radioaktivt mærkede antistof; ubundet ⁶⁴Cu-CuCl₃ bevæger sig med den mobile fase og ville være til stede fra 200 til 240 cm. Der er ingen påviselig fri ⁶⁴Cu-CuCl3 i denne kromatograf. C) Specifikationerne for kvalitetskontrol af det radioaktivt mærkede antistof. Forkortelser: DOTA-NHS-ester = 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraeddikesyremono-N-hydroxysuccinimidester; ITLC/HPLC = øjeblikkelig tyndtlagskromatografi/højtydende væskekromatografi MALDI/LC-MS = matrixassisteret laserdesorption/ionisering/væskekromatografi-massespektrometri; CPM = tæller pr. minut. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Fotografier, der viser, hvordan man fastgør mus i en 3D-printet seng i PET-scanneren for at muliggøre billeddannelse af rygmarven og hjernen i høj kvalitet og samtidig minimere bevægelse. (A) 3D-printet scannerseng med fire mus (også kendt som "musehotel") udstyret med varmeelementer og anæstesirør. (B) bedøvede mus i liggende stilling for at maksimere rygsøjlens rethed; Sengepositionen for hver mus registreres. (C) Mus tapet sikkert over hovedet for at minimere bevægelse i hjernen og på tværs af maven for at minimere bevægelse fra vejrtrækning uden at påvirke vejrtrækningen. (D) Museleje placeret i scanneren og tapet til scanningslejet. Anæstesislangen blev forbundet fra scanner til seng og isofluran indstillet til 2%. Musens vejrtrækning blev overvåget for at sikre et passende isofluranniveau, før scannerdøren lukkes. Forkortelse: PET = Positronemissionstomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Rygmarvsbillede og hjerneanalyse og resultater ved hjælp af PET-analysesoftware. (A) i ) ROI'er (pink og tan) trukket på rygsøjlen for at adskille lændehvirvlen fra bryst- og livmoderhvirvlerne og forberede billedet til Otsu-tærskelværdi. ii ) Ryghvirvler (turkis og rød) blev segmenteret ud ved hjælp af Otsu Thresholding. iii ) Hvirvler blev derefter gjort uforanderlige i 3D ROI-menuen, og rygmarven blev opdelt i cervikal / thorax (lilla) og lændehvirvel (marine) ROI'er. iv) Vertebral ROI blev fjernet, hvilket efterlod rygmarvs-ROI'er og repræsentativt hjerneatlas anvendt. (B) Repræsentativ analyse af PET-resultater fra forskellige CNS-regioner repræsenteret som% ID/g normaliseret til hjertets ROI inden for hvert dyr. PET-anskaffelsen var en 10 minutters statisk scanning via PET/CT-billeddannelse. Hjerneområder kvantificeret ved hjælp af en halvautomatisk hjerneatlastilgang, vist i panel A. iv) Repræsentative resultater viser enten signifikans eller tendens til signifikant stigning i sporbindingen i hjernen og thorax rygmarven. Statistik udført ved hjælp af elevens t-test (*: p < 0,0332). Forkortelser: PET = Positronemissionstomografi; ROI'er = interesseregioner CNS = centralnervesystemet; CT = computertomografi; %ID/g = procent injiceret dosis pr. gram væv EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Repræsentativ kvantificering af ex vivo gammatælling i forskellige organer i EAE og naive mus udtrykt som %ID/g. Efter PET-scanning blev mus perfuseret med PBS for at fjerne radiosporstoffet i blodet, enten frit eller bundet til blodresidente CD19 ⁺ B-celler, og organer blev hurtigt dissekeret og vejet for at have en nøjagtig vægt af hvert organ. Sporbindingen er signifikant nedsat i milt og knoglemarv hos EAE-mus sammenlignet med naive. Øget radiosporbindingen observeres i både lændehvirvelsøjlen og cervikal/thorax rygmarvssegmentet hos EAE-mus. Hjernen viser ikke signifikant stigning i radiosporsignal, selvom det er tendens til betydelig stigning. Statistik udført ved hjælp af elevens t-test (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Forkortelser: PET = Positronemissionstomografi; %ID/g = procent injiceret dosis pr. gram væv EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; PBS = fosfatbufret saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Ex vivo ARG-billeder viser ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb-binding i sagittale hjernesektioner og hele rygmarv fra EAE sammenlignet med naive mus. Digitale fosforlagringsfilm blev scannet ved hjælp af et fosforkamera efter at have været udsat for radioaktive vævsprøver i ca. 10 halveringstider (127 timer eller 5 dage). De resulterende billeder afslører visuelt højere signal i hjernen hos EAE-mus sammenlignet med hjernesektioner fra naive mus, hvilket forventes på grund af de regioner, der vides at indeholde B-celler i denne model⁵. Specifikt er der øget sporsignal i hjernestammen, lillehjernen og ventriklerne i EAE-musehjernesektioner. Denne stigning i signal for EAE-musehjernesektioner afspejler, hvad der blev fundet i PET-kvantificeringen af hele hjernen, der er beskrevet ovenfor. Tilsvarende er der en stigning i radiosporbindingen i både cervikal/thorax og lumbal rygmarvssegmentet sammenlignet med naive rygmarv, hvilket afspejler, hvad der blev fundet ved ex vivo gammatælling. Forkortelser: PET = Positronemissionstomografi; EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; Udluftning = ventrikler; Cb = lillehjernen; BS = hjernestamme; TSc = thorax og cervikal rygmarv kombineret; LSc = lændehvirvelsøjlen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Farvning af CNS-væv af naivt og EAE-musehjernevæv med CD45R / B220. B-celler observeres i hjernestamme, meninges og hvidt stof hos EAE-mus (n = 7 EAE, n = 5 naive mus, gennemsnit fire skiver pr. Dyr). Dette tal er fra ⁵. Skalabjælker = 5 mm (lav forstørrelse [1x]) i sagittale hjernebilleder, 100 μm (høj forstørrelse [20x]) i hjernestamme, meninges og cerebellær hvid substans. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne artikel beskriver en strømlinet metode til billeddannelse af human-CD19⁺ B-celler i en musemodel af MS ved hjælp af CD19-PET. På grund af den heterogene præsentation af MS og varierende respons på behandlinger kan dets ledelse i klinikken være udfordrende, og der er stort behov for nye tilgange til valg og overvågning af terapi. PET-billeddannelse kan tjene som et effektivt værktøj til overvågning af sygdomsprogression og individuel respons på B-cellenedbrydende terapi. Ud over MS kan CD19-PET-billeddannelse bruges til at overvåge B-celleudtømning efter behandling i undertyper af lymfomer og leukæmi eller andre B-cellemedierede sygdomme. Denne protokol og repræsentative data viser nytten af billeddannelse af B-celler i neurologiske sygdomme.

For at studere humane CD19⁺ B-celler i forbindelse med MS valgte vi B-celleafhængige MOG_{1-125 EAE-model} ⁷. I lighed med andre EAE-modeller præsenterer denne model symptomer på progressiv lammelse og infiltration af immunceller i CNS. MOG_{1-125-modellen} er imidlertid unik, fordi den er en B-celledrevet model: mus indeholder varierende antal B-celler i det subaraknoidrum i hjernehinderne, hjernestammen, parenchymen og ventriklerne. Disse lymfocytter kan være tyndt spredt over disse regioner og / eller danne follikellignende strukturer, som også observeres hos mennesker med MS ^8,9. Ud over at bruge naive mus som kontrol, kan der anvendes et komplet Freunds induktionssæt, der kun er adjuvans (CFA) (dvs. en identisk induktionsemulsion til det, der gives til EAE-mus uden MOG-proteinet). I EAE-musemodellen er blodhjernebarrieren (BBB) dysfunktionel og tillader større enheder, såsom antistoffer, at krydse. CD19-mAb radiosporstoffet binder og forbliver kun i CNS, hvis B-celler er til stede; sporstoffet vil cirkulere tilbage i blodpuljen, hvis B-celler ikke er til stede. Vi har demonstreret dette ved hjælp af gammatælling og ex vivo autoradiografi af CNS-væv ved perfusering før måling af radioaktivitetsniveauerne i vævene. Vi har også påvist dette i tidligere publikationer, der rapporterer om brugen af mAb-baserede PET-radiosporstoffer (dvs. immunPET-billeddannelsesmetoder) til påvisning af B-celler i CNS ^1,2.

DOTA-chelatoren blev brugt, da den er blevet brugt i klinisk PET-billeddannelse med kobber-64-mærkede peptider og antistoffer, og vi sigter mod at oversætte hCD19-mAb til klinisk billeddannelse af MS-patienter. DOTA har tilstrækkelig bindingsaffinitet til kobber-64 in vivo. In vivo-stabiliteten er meget vigtig, fordi fri ⁶⁴Cu går til leveren og kan skjule signalet fra bundet radiospor; Det er således vigtigt at måle signalet i leveren for at beregne det relative signal sammenlignet med andre organer. Muskler tages typisk som kontrolvæv, men i tilfælde af EAE kan der være betændelse til stede i musklerne. Halveringstiden på ⁶⁴Cu er 12,7 timer, hvilket giver rigelig tid til, at DOTA-hCD19-mAb binder til sit mål, samtidig med at signalet kan måles med PET. Ved fremstilling af konjugatet skal der udføres små (75-125 μg) testreaktioner for at bestemme mængden af DOTA, der skal tilsættes til mAb for at producere det ønskede DOTA/mAb-forhold (f.eks. kan en reaktion på 6-10 gange overskydende DOTA-NHS-ester pr. mol mAb give et konjugat på 1-2 DOTA/mAb). Reaktionstiden og temperaturen (f.eks. 2-4 timer eller natten over ved 4 °C eller stuetemperatur) påvirker også DOTA/mAb-forholdet og bør optimeres. En titrering med ikke-radioaktivt kobber kan udføres for at beregne antallet af DOTA'er pr. mAb; Vi anbefaler dog at udføre MALDI-MS og/eller LC-MS for at opnå mere pålidelige og nøjagtige resultater.

Det beregnede DOTA/mAb-forhold er en gennemsnitsværdi for en bestemt prøve, og der forventes en vis variation. For MALDI, er der taget flere skud pr. prøve for de konjugerede og ikke-konjugerede mAbs. Vi beregner derefter forholdet mellem konjugeret og ikke-konjugeret for at bestemme det gennemsnitlige antal DOTA/mAb. DOTA/mAb-forholdet er vigtigt, fordi for mange chelatorer vil forstyrre antistofbindingen, og for få vil føre til inkonsekvent radiomærkning og lavt signal. Forholdet skal være meget tæt mellem konjugatbatcher for at opretholde ensartet signalintensitet og bindingskinetik; Ideelt set bør den samme batch af konjugat anvendes til alle eksperimenter inden for en bestemt undersøgelse. En lovende teknik til at reducere potentielle virkninger på immunreaktivitet på grund af mulig overkonjugering er at anvende stedspecifik konjugering¹⁰ , hvorved chelatorkonjugationen er stedselektiv på antistoffets tungkædede glycaner, hvilket garanterer tilsætning af 1 chelator pr. mAb.

Reaktionsbetingelserne for radiomærkning bør optimeres for at sikre den højeste mærkningseffektivitet og udbytte, da forskelle i antistof, DOTA/mAb-forhold og ⁶⁴Cu-molær aktivitet blandt andre betingelser vil påvirke radiomærkning. Brug af det optimale ⁶⁴Cu til mAb-konjugatforhold kan gøre det muligt at anvende radiosporstoffet uden rensning, hvilket reducerer den tid, der kræves til radioaktiv mærkning og tab på grund af tyngdekraftens strømningskolonne og radioaktivt henfald. En konsistent og pålidelig molær aktivitet kan også opnås, når det samme ⁶⁴Cu til mAb-konjugatforhold anvendes, hvilket er særligt vigtigt, når man sammenligner resultater på tværs af flere kohorter af mus eller billeddannelsesundersøgelser. ITLC-betingelserne kan også ændres, så de passer til hver bruger. Hvis rensning er nødvendig, skal der gemmes en prøve for enten HPLC- og/eller UV/Vis-spektrofotometri, så molaraktiviteten kan beregnes.

Det er vigtigt at bemærke, at brug af radioaktivt mærkede antistoffer til billeddannelse kan være udfordrende. Det er vigtigt, at det antistof, der anvendes til radiosporstoffet, er biologisk inaktivt for ikke at have en fysiologisk virkning. Da antistoffer desuden har en lang blodbolig, skal man vente længe nok på cirkulation, binding og clearance af en given mAb for at sikre et passende signal-til-baggrund uden at gå på kompromis med billedkvaliteten. Det er typisk tilstrækkeligt at vente i 20-48 timer på en 64 Cu-mærket mAb, men man bør tage billeder ved 2, 4, 6, 12, ²⁴, 48 timer efter injektion, når man vurderer et nyt mAb PET-sporstof for at bestemme det bedste tidspunkt for billeddannelse i en given gnavermodel. Det samme gælder for erhvervelse af ARG-billeder med det højeste signal-til-baggrundsforhold. De repræsentative billeder i denne protokol blev taget 18-20 timer efter injektion, selvom andre tidspunkter kan anvendes afhængigt af den anvendte radioisotop. Forskellige antistoffer, der binder til forskellige epitoper af CD19, vil give varierende resultater og bør karakteriseres strengt.

Når man analyserer rygmarvssignalet, er det vigtigt at placere mus på ryggen i scanningslejet for at reducere bevægelse forårsaget af vejrtrækning. Derudover kan liggende placering hjælpe med at rette rygsøjlen hos mus, der har øget rygkrumning på grund af udviklingen af EAE-sygdom. Et andet vigtigt aspekt at overveje, når man sigter mod at detektere signal i rygsøjlen og rygmarven, er at undgå at injicere MOG_1-125 på flanken, da injektionsstederne kan binde sporstoffet på grund af det tilknyttede immunrespons i disse områder. Nærheden af injektionsstedet kan forstyrre rygmarvsanalysen; Således foretrækkes injektioner i brystet til den anvendelse, der er beskrevet heri.

De anvendte billedanalyseteknikker er specifikke for CNS-billeddannelse. Et hjerneatlasværktøj i billedanalysesoftwaren giver reproducerbare og pålidelige resultater, så længe registreringen af PET og CT er nøjagtig. Brug af det halvautomatiske 3D-hjerneatlas og justering af det, så det passer til kraniet på hver mus, giver mulighed for ensartede ROI'er mellem dyr. Da der i øjeblikket ikke er nogen automatiseret eller halvautomatisk tilgang til analyse af signalet i rygmarven, skal der trækkes manuelle ROI'er. Især ved kvantificering af CD19 ⁺ B-celler (eller enhver celletype, der findes i både knoglemarv og rygmarv), er det afgørende at eliminere signalet fra rygsøjlen og knoglemarven så meget som muligt. Årsagen til dette er, at naive mus vides at indeholde flere CD19⁺ B-celler i deres knoglemarv end EAE-mus, hvor B-celler forlader periferien for at infiltrere CNS ^5,11. Dette knoglemarvssignal kan skjule det sande signal i rygmarven.

For at afgrænse ægte rygmarvssignal og samtidig minimere bidraget fra signal fra rygsøjlen og knoglemarven, kan Otsu-tærskel af CT-billedet bruges til at lave et uforanderligt ROI for rygsøjlen. En separat rygmarv ROI kan derefter let trækkes i rygsøjlen. Den samme teknik kan også anvendes til at måle knoglemarv i lårbenet. Dette er en meget nyttig metode til at få indsigt i sporbinding i rygmarven. På grund af PET's relativt lave rumlige opløsning og problemer vedrørende partiel volumeneffekt ved scanning af små anatomiske områder hos mus muliggør brugen af yderligere ex vivo-verifikationsteknikker (f.eks. gammatælling, ARG) validering af radiosporbinding i rygmarven uden tilstedeværelse af blod, cerebrospinalvæske eller spillover-signal fra rygsøjlen.

Signal i livmoderhalsen / thorax rygmarven har tendens til at variere i EAE-musene afhængigt af sygdommens sværhedsgrad og hvor mange B-celler der infiltrerer under det adaptive immunrespons. Denne variation i antallet af B-celler, der infiltrerer, såvel som den lille mængde B-celler i CNS sammenlignet med dem i bækken / rygmarven hos naive mus, kan gøre in vivo-kvantificering af rygmarvsvæv udfordrende hos mus. I betragtning af den rumlige opløsning af PET i billeddannelse af små dyr kan signal fra knoglemarven spildes over på rygmarvssignalet. Ex vivo biodistribution og autoradiografi afsluttet her hjælper med at validere PET-signalet fra ryghvirvlerne versus rygmarvsvævet. Mus perfuseres før dissektion for at fjerne ethvert ubundet sporstof i blodpuljen, så gammatællings- og autoradiografiresultaterne afspejler det sporstof, der faktisk er bundet i hvert organ, snarere end det sporstof, der er i blodpuljen i det organ.

Radiosporstoffer cirkulerer gennem blodet, og specifikt med antistofsporere er der ofte ubundet radiosporstof til stede i blodet i uger efter den første injektion. Da vi afbilder hjernen og rygmarven, som har mange blodkar, er det vigtigt at forstå, hvilken del af signalet der virkelig skyldes sporbinding i hjerne / væv af interesse versus det, der er til stede i blodpuljen. Det er derfor nødvendigt at opdele hjernesignalet ved signal i hjertet/blodpuljen. I den kliniske indstilling kan de samme billedanalyseteknikker til Otsu-tærskel af ryghvirvler og ROI'er af rygmarvsvæv anvendes til kvantificering. I betragtning af de større vævsvolumener hos mennesker sammenlignet med mus skulle der være betydeligt mindre påvirkning fra delvise volumeneffekter, hvilket fører til forbedret nøjagtighed og negerer behovet for ex vivo-teknikker til bekræftelse af in vivo-fund . Brugen af PET i klinikken vil give klinikere mulighed for at tilpasse behandlingen til hver patient afhængigt af deres individuelle B-cellebyrde.

ARG er især nyttig til at erhverve billeder i høj opløsning for at muliggøre en mere nøjagtig afgrænsning af den rumlige placering af sporstofbinding i små områder som hjernestamme og lillehjerne. De samme sektioner og / eller tilstødende sektioner kan gemmes for immunhistokemiske pletter for at bekræfte tilstedeværelsen af B-celler. Vi har tidligere farvet CNS-væv med CD45R/B220 (supplerende figur S1) for at korrelere antallet af B-celler med PET- og ARG-signal ^5,9. Farvningen kan derefter sammenlignes rumligt med ARG-resultaterne for at kontrollere, at radiosporsignalet matcher farvningsmønsteret. B-celler kan være til stede i klynger eller diffust i hele hjernestammen; PET-følsomheden er tilstrækkelig høj til at måle signalet, hvilket er opmuntrende for klinisk oversættelse. For rygmarvs-ARG sikrer fjernelse af rygmarven fra ryghvirvlerne, at det målte signal skyldes sporstofbinding i rygmarvsvævet snarere end knoglemarven og / eller blodet, hvilket kan skjule PET-billeder på grund af delvise volumeneffekter.

I lighed med ARG muliggør ex vivo gammatælling kvantificering af radioaktivt signal i individuelle organer. For denne særlige teknik er det vigtigt at måle vævets vådvægt og sikre, at de er i bunden af deres respektive rør, før rørene placeres i gammatælleren. Rørene skal mærkes med musenummer og væv, så det korrekte rør bruges; Røret vejes derefter på en kalibreret vægt, og organerne indsættes til nærmeste tiendedel mikrogram (0,0001 mg). Nogle væv er ekstremt små, og forskellen i rørmassen før og efter vil være i størrelsesordenen 0,0001 mg. Vævene skal vejes umiddelbart efter dissektion for at forhindre tab af fugt, hvilket resulterer i en lavere masse. Efter vejning skal hjernen og rygmarvsrørene fyldes med PBS for at forhindre tørring, før disse væv fryses til ARG.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter	MiliporeSigma	UFC505008	centrifugal filter
64Cu-CuCl3	Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner	Eckert & Ziegler	AR-2000
Autoradiography cassette	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film	GE Life Sciences	28-9564-78	Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only
Butterfly Needle Catheter	SAI Infusion Technologies	BLF-24
DOTA-NHS-ester	Macrocyclics	B-280
EAE Induction Kit	Hooke Laboratories	EK-2160
Geiger Counter	Ludlum	14C
GNEXT PET/CT Scanner	Sofie	GNEXT
Hidex Automatic Gamma Counter	Hidex	AMG
HPLC Column	Phenomenex	00H-2146-K0	5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm
Illustra NAP-5 column	Cytiva	17085301	DNA gravity column
Image J	NIH		ARG analysis software
Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	PI90410
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Scientific	840281400	UV-Vis micro/nano-spectrophotometer
PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade	Eppendorf	30124707
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
VivoQuant	Invicro	Version 4 Patch 3	PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	PI89882	Desalting column