Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Avbildning av CD19+ B-celler i en eksperimentell musemodell for autoimmun encefalomyelitt ved bruk av positronemisjonstomografi

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64133
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Dette papiret beskriver metodikk for radiomerking av et humanspesifikt anti-CD19 monoklonalt antistoff og hvordan man bruker det til å kvantifisere B-celler i sentralnervesystemet og perifert vev av en musemodell av multippel sklerose ved bruk av in vivo PET-avbildning, ex vivo gamma-telling og autoradiografi tilnærminger.

Abstract

Multippel sklerose (MS) er den vanligste demyeliniserende sykdommen i sentralnervesystemet (CNS) som rammer unge voksne, noe som ofte resulterer i nevrologiske utfall og funksjonshemming etter hvert som sykdommen utvikler seg. B-lymfocytter spiller en kompleks og kritisk rolle i MS-patologi og er målet for flere terapeutiske midler i kliniske studier. For tiden er det ingen måte å nøyaktig velge pasienter for spesifikke anti-B-celleterapier eller å ikke-invasivt kvantifisere effekten av disse behandlingene på B-cellebelastning i CNS og perifere organer. Positronemisjonstomografi (PET) avbildning har enormt potensial til å gi svært spesifikk, kvantitativ informasjon om in vivo spatiotemporal fordeling og byrde av B-celler i levende.

Denne artikkelen rapporterer metoder for å syntetisere og bruke et PET-sporstoff spesifikt for humane CD19+ B-celler i en veletablert B-celledrevet musemodell av MS, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), som induseres med humant rekombinant myelinoligodendrocyttglykoprotein 1-125. Beskrevet her er optimaliserte teknikker for å oppdage og kvantifisere CD19 + B-celler i hjernen og ryggmargen ved hjelp av in vivo PET-avbildning. I tillegg rapporterer denne artikkelen strømlinjeformede metoder for ex vivo gamma-telling av sykdomsrelevante organer, inkludert benmarg, ryggmarg og milt, sammen med høyoppløselig autoradiografi av CD19-sporbinding i CNS-vev.

Introduction

MS er en immunmediert nevrologisk lidelse; Den unike presentasjonen i hver pasient kan gjøre ledelsen utfordrende for både pasienter og klinikere1. Sykdommen i seg selv er preget av tilstedeværelse av demyeliniserende lesjoner og immuncelleinfiltrasjon i hjernen og ryggmargen, noe som resulterer i fysisk og kognitiv svekkelse2. Det tradisjonelle paradigmet om at MS er en T-cellemediert sykdom ble først utfordret i en landemerke fase II klinisk studie av rituximab3, en terapi rettet mot CD20 + -undergruppen av B-celler. Ytterligere B-celleterapier har siden blitt utviklet som retter seg mot CD194, en pan B-cellebiomarkør som uttrykkes på et bredere spekter av B-celler, som kan være både diagnostisk og terapeutisk fordelaktig. Videre har eksisterende metoder for å vurdere behandlingseffekt (dvs. overvåking av antall tilbakefall og magnetisk resonansavbildning [MR] -aktivitet) ikke råd til tidlige tiltak av respons, og plasserer dermed pasienter i betydelig risiko for CNS-skade på grunn av suboptimal terapivalg og optimalisering. Derfor er det et kritisk behov for strategier for å overvåke spesifikke immunceller, for eksempel CD19 + B-celler, i sanntid i CNS og periferien til MS-pasienter.

PET-avbildning er en robust bildebehandlingsteknikk som tillater in vivo , helkroppsvisualisering av et gitt mål av interesse, for eksempel CD19. Mens blod trekker, registreringer av tilbakefallsfrekvenser og lesjonsovervåking via MR gir øyeblikksbilder i behandlingseffekten, kan PET-bildebehandling tillate forskere og klinikere å overvåke effektiviteten av en terapi over hele kroppen. Denne proaktive tilnærmingen til terapeutisk overvåking gjør det mulig for klinikere å vurdere medisineringseffektiviteten i sanntid, noe som muliggjør raske justeringer etter behov. Overvåking av lokalisering og tetthet av cellepopulasjoner assosiert med sykdom tillater også longitudinell vurdering av alvorlighetsgrad ved bruk av pasientspesifikk anatomisk informasjon. Det er derfor viktig å etablere reproduserbare analysemetoder for pålitelig å utnytte det fulle potensialet for PET-avbildning i kliniske og prekliniske omgivelser.

Denne artikkelen beskriver metoder (figur 1) for å utføre PET-avbildning, ex vivo gammatelling og autoradiografi (ARG) av CD19+ B-celler med et 64 Cu-merket anti-humant CD19 monoklonalt antistoff (mAb), kjent som 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), i den eksperimentelle autoimmune encefalomyelitt (EAE) musemodellen av MS indusert i transgene mus som uttrykker humant CD19 (hCD19) ved bruk av humant rekombinant myelinoligodendrocyttglykoprotein 1-125 (MOG1-125). Vi tilbyr også metoder for å vurdere radiotracerbinding nøyaktig og reproduserbart i hjernen og ryggmargen, begge kritiske steder av patogenese ofte alvorlig påvirket i denne og andre neurodegenerative modeller. Disse teknikkene tillater ikke-invasiv undersøkelse av B-cellenes rolle i sykdomspatologi og har potensial til å bli klinisk oversatt for å vurdere effekten av anti-B-celleterapier i MS.

Protocol

Figure 1
Figur 1: Studiedesign. En oversikt over viktige teknikker i denne artikkelen. (A) Plassering av musene i skannesengen på ryggen reduserer bevegelse i ryggraden. (B) PET/CT-avbildning av musene. (C) Lag et snitt nedover ryggsiden av dyret for å eksponere ryggsøylen. (D) Bisect ryggraden i cervical / thorax og lumbale deler og fjern seksjonene etter de fem angitte kuttene. (E) Bruk en sprøyte for å fjerne ryggmargen fra ryggsøylen ved å lage en forsegling med sprøyten og ryggsøylen og skylle fra kraniale og kaudale ender av ryggsøylen som vist. (F) Isolerte cervikale / thorax og lumbale ryggmargssegmenter. Forkortelse: PET/CT = Positronemisjonstomografi/computertomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) ved Stanford University, et program akkreditert av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Mus ble akklimatisert til vivarium i minst 7 dager før studiestart for å minimere stress på musene, da stress kan påvirke EAE-induksjon.

1. EAE-induksjon hos kvinnelige humaniserte CD19-mus

  1. Indusere humaniserte CD19 C57BL/6J hunnmus i alderen 9-13 uker med EAE som tidligere beskrevet5 ved bruk av MOG1-125.

2. Dyrepleie og scoring i EAE-musemodell

  1. Skår sykdomsprogresjon og omsorg for musene som tidligere beskrevet5. Kort fortalt skårer du denne modellen på en skala fra 1-5 på følgende måte: 1 er halesvakhet/halehet, 2 er svekket baklemmelse, 3 er lammelse i bakbenet, 4 er lammelse i bakbenet med svakhet i forbenet, 5 er døende.

3. mAb-konjugering, radiomerking og karakterisering

  1. Konjugere den bifunksjonelle chelatoren 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraeddiksyremono-N-hydroksysuccinimidester (DOTA-NHS-ester) til hCD19-mAb til radiolabel med 64Cu.
    1. Bruk en avsaltingskolonne til å bytte ut lagringsbufferen hCD19-mAb med HEPES-buffer (pH 8,5-9): kondisjoner avsaltingskolonnen(e) med HEPES. Beregn antall kolonner som trengs basert på avsalting av kolonneprøvevolumkapasitet og volum av mAb som kreves: 0,5 ml rør: 30-130 μL prøvevolum, 300 μL vask; 2 ml rør: 200-700 μL prøvevolum, 1 ml vask.
    2. Avkjøl sentrifugen til 4 °C for bufferbytte via avsaltingskolonnen.
    3. Hent avsaltingskolonnen fra kjøleskapet. Fjern bunnen av avsaltingskolonnen, løsne hetten og legg kolonnen i et oppsamlingsrør.
    4. Sentrifuge ved 1,500 × g i 2 minutter for å fjerne lagringsløsningen; Kast gjennomstrømningen som inneholder oppbevaringsvæsken, og bruk oppsamlingsrøret på nytt. Merk en linje på kolonnen der det høyeste punktet på avsaltingskomprimert harpiks er skråstilt oppover.
    5. Legg til HEPES-buffer på undersiden av avsaltingskolonnen. Plasser avsaltingskolonnen i sentrifugen med linjen vendt utover; Spinn ved 1 500 × g i 2 minutter. Kast gjennomstrømningen og bruk oppsamlingsrøret på nytt.
    6. Gjenta trinn 3.1.4 og 3.1.5 2x med samme oppsamlingsrør og forkast gjennomstrømningen mellom trinnene.
    7. Plasser den kondisjonerte avsaltingskolonnen i et nytt oppsamlingsrør og etikett; dette røret vil inneholde hCD19-mAb.
    8. Tilsett hCD19-mAb på toppen av den kondisjonerte avsaltingskolonnen(e) og bruk HEPES-buffer til å skylle det tomme mAb-hetteglasset. Legg dette til toppen av avsaltingskolonnen (totalt volum i henhold til produsentens anbefaling). Spinn ved 1,500 × g i 2 minutter for å eluere hCD19-mAb. Hold gjennomstrømningen som inneholder hCD19-mAb.
    9. Mål konsentrasjonen av hCD19-mAb ved hjelp av et UV/Vis-spektrofotometer og juster om nødvendig til 0,5 μg/μL med HEPES-buffer.
    10. Til hCD19-mAb-løsningen, tilsett 1/50th volumet av mAb-oppløsningen på 0,5 M EDTA for å gjøre den endelige konsentrasjonen av EDTA 0,01 M i hCD19-mAb-løsningen. La hCD19-mAb-EDTA-oppløsningen stå i romtemperatur i 15 minutter.
    11. Fjern DOTA-NHS-ester fra fryseren og la den komme til romtemperatur (10-15 min). Beregn volumet av DMSO for å legge til DOTA-NHS-ester for å lage en DOTA-konsentrasjon som tillater tillegg av ønsket DOTA / mAb molforhold (som vanligvis er i størrelsesorden 1-2 DOTA / mAb).
      MERK: Volumet av DMSO-DOTA-NHS-ester tilsatt til hCD19-mAb bør ikke overstige 10% av mAb-volumet. Dette bør gjøres ved hjelp av et regneark, slik at det kan gjøres raskt og gjentatte ganger.
    12. Basert på ønsket forhold mellom DOTA og hCD19-mAb, beregne mengden DOTA-NHS-ester som skal legges til hCD19-mAb.
      nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/ml dota/dmso → ml DMSO → fortynningsfaktor for DOTA / DMSO oppløsning
    13. Vei 1-2 mg av DOTA-NHS-ester, og tilsett forsiktig riktig volum (beregnet i trinn 3.1.11) DMSO til DOTA-NHS-ester; Bland og spinn ned.
    14. Pipett det beregnede volumet av DOTA-NHS-ester-løsningen (trinn 3.1.12) inn i hCD19-mAb-løsningen; tørk utsiden av pipettespissen før tilsetning for å sikre at ekstra DOTA-NHS-ester ikke tilsettes (uten å endre mengden i pipetten). Bland forsiktig og spinn ned.
    15. Sett i kjøleskapet (4 °C) for å reagere over natten (12-16 timer).
  2. Rensing og konsentrasjon
    1. Avkjøl sentrifugen til 4 °C for sentrifugalkonsentratorbufferutvekslingstrinnene; plasser en PCR-rørblokk av metall på tørris for snap-frysing av konjugatet.
    2. Fjern DOTA-hCD19-mAb-reaksjonen fra kjøleskapet og slukk ved å legge til biologisk TRIS-buffer: 10% av totalt reaksjonsvolum. Fjern 10-20 μg av prøven for massespektrometrianalyse.
    3. Kondisjoner avsaltingskolonnen(e) som beskrevet ovenfor (trinn 3.1.1-3.1.5), bruk 0,1 M ammoniumacetatbuffer, pH 5,5.
    4. Buffer bytter DOTA-hCD19-mAb-løsningen til ammoniumacetat (trinn 3.1.1-3.1.8).
    5. Konsentrer DOTA-hCD19-mAb-løsningen: tilsett løsningen til en 50 kDa molekylvekt cut-off sentrifugalkonsentrator i henhold til produsentens anbefalinger om volum. Sentrifuge ved 4000 × g i 10 minutter (eller til volumet reduseres med 80% -90%); Forkast gjennomstrømningen.
    6. Gjenta ni ganger til (10 totalt): tilsett nok ammoniumacetat til å bringe volumet tilbake til maksimalt anbefalt volum.
      MERK: Totalen skal være det som opprinnelig ble lagt til, inkludert det som er igjen i kolonnen, vanligvis 400-450 μL for en 500 μL kapasitet sentrifugalkonsentrator.
      1. Skyll reaksjonshetteglasset med ammoniumacetatbuffer for å hente opp eventuell gjenværende DOTA-hCD19-mAb. Legg vasken til sentrifugalkonsentratoren.
      2. Sentrifuge ved 4000 × g i 10 minutter.
        MERK: Spinntiden kan reduseres ved påfølgende spinn hvis volumet reduseres til 80% -90% på kortere tid.
    7. Fjern proteinoppløsningen fra sentrifugalkonsentratoren. Legg merke til det totale volumet av DOTA-hCD19-mAb.
      1. I sentrifugalkonsentrator 2, tilsett nok ammoniumacetatbuffer for et totalt volum på 100 μL og pipette til å blande. Sett lokk på sentrifugalkonsentratorkolonnen og inverter. Spinn ved 4000 × g i 2 minutter for å samle løsningen. Overfør til et nytt rør.
      2. I sentrifugalkonsentrator 500, bruk en pipette for å samle mAb-løsningen fra sentrifugalkonsentratoren; Legg til et nytt rør.
    8. Mål konsentrasjonen med et UV-Vis-spektrofotometer. Hvis konsentrasjonen er over 2 mg/ml, fortynnes med ammoniumacetat til 2 mg/ml.
    9. Aliquot 100 μg per PCR-rør (ca. 50 μL); Merk rørene med DOTA-hCD19-mAb, dato, masse og konsentrasjon. Spinn ned hetteglassene.
    10. Snap-frys DOTA-hCD19-mAb på den kjølte PCR-blokken på tørris (eller frys på tørris). Når alle prøvene er frosset, legges de i en fryser på -80 °C.
    11. Mål antall DOTA per hCD19-mAb ved massespektrometri. Hold en prøve av ukonjugert (rent) antistoff fra hver konjugering for å beregne forholdet. Bruk ligning (1) gitt nedenfor; molekylvekt forkortes MW.
      Equation 1(1)
  3. Radiomerking
    MERK: Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE) for håndtering av radioaktivitet, inkludert laboratoriefrakk, hansker og en personlig kropps- og ringdosimetre, i henhold til institusjonelle forskrifter. Undersøk og bytt hansker regelmessig for å forhindre radioaktiv forurensning. Bruk blyskjerming og øk avstanden fra den radioaktive kilden ved å håndtere tang når det er mulig.
    1. Overfør radioaktivitet fra hetteglasset til et nytt hetteglass ved hjelp av en pipette. Mål radioaktiviteten.
    2. Fjern en alikot for den første radiomerkingsreaksjonen. Tilsett 50 μL ammoniumacetat (pH 5,5) per 1 mCi på 64Cu-CuCl3. Mål pH ved å pipetere 1 μL på en pH-stripe med et område som fanger opp 5,5 med nok oppløsning til å skille mellom 5 og 6.
    3. Hvis pH ikke er 4-5,5, endre den med 1 M NaOH eller 0,1 M HCl. Tilsett små mengder, 1-5 μL, på 1 M NaOH hvis pH er mindre enn 4 eller 0,1 M HCl hvis pH er større enn 5,5 til riktig pH er nådd. Med hver tilsetning, bland grundig, spinn ned og mål pH som beskrevet ovenfor. Legg merke til hver tilsetning og fjerning av enhver oppløsning (inkludert å kontrollere pH) slik at det endelige volumet kan beregnes.
    4. Når den optimale pH er oppnådd, tilsett 10 μg DOTA-hCD19-mAb per 1 mCi på 64Cu-CuCl3. Bland forsiktig og spinn kort ned.
    5. Plasser reaksjonshetteglasset på en termomixer satt til 37 °C og 400 omdreininger per minutt (rpm).
    6. Etter 30 min, slukk reaksjonen: del det totale reaksjonsvolumet med 50, og tilsett det volumet på 0,5 M EDTA til reaksjonsblandingen.
    7. Bestem merkingseffektiviteten ved hjelp av øyeblikkelig tynnsjiktskromatografi (ITLC) for å måle prosentandelen av bundet og fritt kobber i løsningen.
      1. Klipp 1 cm brede strimler av TLC-papir. Merk 1 cm fra toppen og bunnen av stripen og lag et rør (50 ml konisk kolbe) med mobilfase mindre enn 1 cm med 0,1 M sitronsyre (nivået av mobilfase skal være under 1 cm-merket på stripen når den plasseres i røret).
      2. Pipett 1 μL av reaksjonsoppløsningen på stripen nederst 1 cm merke (løsningsmiddel foran) og plasser stripen i røret. Se til løsemiddelfronten når det øverste 1 cm-merket, fjern stripen og pakk den inn i et stykke plastfolie.
      3. Plasser stripen på plattformen og kjør den gjennom en radio-TLC bildeskanner. Se etter den radiomerkede mAb ved opprinnelsen og fri 64Cu som beveger seg med mobilfasefronten (figur 2). Hvis prosentandelen fritt kobber er mindre enn 5% (95% merkingseffektivitet), fortsett med injeksjon i dyr. Hvis prosentandelen fritt kobber er større enn 5%, fortsett med rensing.
        MERK: Prosentandelen fritt kobber avhenger generelt av forholdet mellom DOTA-mAb og 64Cu, reaksjonstid, pH og temperatur. Reaksjonsbetingelsene bør optimaliseres av hver bruker for hver nye mAb for å sikre konsistente resultater.
  4. Rensing via en engangs DNA-grad gravitasjonskolonne
    1. Kondisjoner en disponibel DNA-klasse tyngdekraftstrømskolonne (avsalting/bufferutvekslingskolonne) i henhold til produsentens instruksjoner. Plasser engangs DNA-klasse tyngdekraftskolonnen på et ringstativ eller annet instrument bak tilstrekkelig blyskjerming; Forsikre deg om at apparatet er stabilt og lett bevegelig. Plasser røret under kolonnen.
    2. Pipetter den rå reaksjonsblandingen på harpiksen i tyngdekraftskolonnen. Vent til all væsken har strømmet inn i harpiksen. Pipett tilstrekkelig PBS til å bringe hele volumet (råprodukt pluss PBS) til 500 μL. Kast gjennomstrømningen.
    3. Plasser kolonnen over 1,5 ml sentrifugerør merket 1-10. Legg til 1 ml PBS i kolonnen. Samle fem dråper i hvert rør til strømmen har stoppet.
      MERK: Færre enn 10 rør kan være nødvendig.
    4. Sett lokk på bunnen av kolonnen og mål gjenværende radioaktivitet. Mål hvert hetteglass med gjennomstrømning. For hvert hetteglass med mer enn 50 μCi klargjøres en ITLC per trinn 3.3.7 for å måle prosentandelen bundet kobber i hver fraksjon.
      MERK: Den første eller to fraksjonene vil bare inneholde mobilfase; den radiomerkede mAb vil eluere først (vanligvis fraksjon 2 eller 3 til 5 eller 6) og den frie 64Cu vil eluere sist (noen vil holde seg til kolonnen). Prosentandelen bundet 64Cu kan variere mellom brøker.
    5. Kombiner fraksjonene med større enn 95% binding (mindre enn 5% fritt kobber); Bruk injeksjonsvæsken. Hvis ønskelig, utfør HPLC med størrelsesutelukkelse for å bekrefte radiomerking5 og beregne molaraktiviteten. Lagre en alikot for å måle konsentrasjonen på et UV-Vis-spektrofotometer etter at det har henfalt 10 halveringstider (127 timer eller 5,3 dager).

4. Tilberedning av dosering

MERK: Før du håndterer dosen, bruk riktig PPE, inkludert laboratoriefrakk, kropps- og fingerdosimetre og hansker.

  1. Injiser 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 timer før PET-skanning, for å muliggjøre tilstrekkelig sirkulasjon av radiotraceren i kroppen.
  2. Plasser blybeholderen umiddelbart med 64Cu-DOTA-hCD19-mAb bak blyskjerming. Slå på geigertelleren for å overvåke potensiell forurensning.
    MERK: Bytt hansker ofte ved håndtering av radioaktivt materiale. Doble hansker ved doseuttak anbefales for å gjøre det lettere å skifte hansker raskt. Plasser alltid forurensede skarpe gjenstander og søppel i det angitte skjermede søppelområdet.
  3. Fortynn 64Cu-DOTA-hCD19-mAb til en passende konsentrasjon i et lavbindende 1,5 ml plastsentrifugerør.
    MERK: 64Cu-DOTA-hCD19-mAb vil binde seg til plast hvis den ikke er lav binding; 64Cu vil binde seg til glass.
    1. Fortynn radiotraceren i saltoppløsning for å forhindre radiolyse og forenkle opptegning av konsistente doser.
    2. Klargjør doser for å administrere mellom 75 og 150 μCi i 100 μL, hvis mulig. Pass på at det maksimale totale injiserte volumet ikke overstiger 10 % av musens kroppsvekt.
  4. Bruk en 500 mikrol (50 cc) insulinsprøyte for å trekke opp dosen fra lavbindingsplastrøret. Forsikre deg om at det ikke er bobler i sprøyten, siden den skal injiseres intravenøst.
    1. Formerk sprøytene med de tilsvarende dyrenumrene.
    2. Registrer dose, aktivitet og tid i en laboratorienotatbok for dataanalyse.
    3. Ha dosene klare til injeksjon så snart dyrene er kateterisert for å redusere tiden under anestesi.
  5. Etter at dosene er klargjort, utarbeide en standard (fantom) for skanning for å generere en kalibreringsfaktor.
    1. Fyll et 15 ml konisk rør med 50-75 μCi aktivitet fortynnet i vann (eller PBS).
      MERK: Sørg for grundig blanding av oppløsningen. Standarden kan være gratis 64Cu igjen fra merking.
      1. Mål mengden aktivitet i standarden og registrer tiden.

5. Kanylering og injeksjon

MERK: Se tidligere beskrevne metoder 6 for intravenøs kanylering av mus for injeksjon av radiotracer6.

  1. Vei og skår musene for alvorlighetsgrad av sykdommen som beskrevet i pkt. 2.1 før bedøvelse av mus i en knockdown-boks fylt med 1,5-3 % isofluran som forberedelse til administrasjon av radiotracer.
    MERK: Disse musene vil bli injisert på benkplaten, ikke på PET-skanneren som tidligere beskrevet. Det er ikke nødvendig å lime katetrene på plass for injeksjon, da musene ikke vil bli flyttet mellom kanylering og injeksjon.
  2. Når en mus er kanylert, stikk nålen inn i enden av kateteret og injiser sakte. Etter injeksjon, følg med en liten saltvannsspyling gjennom kateteret for å sikre at hele dosen injiseres.
    MERK: Volumet skal omtrent være lik kateterets dødvolum, som er 50 μL for katetrene som brukes av forfatterne.
    1. Injiser over et stykke laboratorieserviett for å samle eventuelle drypp av radiotracer; Inkluder dette ved oppmåling av restdosen.
    2. Registrer tidspunktet for injeksjon i en lab notatbok.
  3. Fjern kanylen umiddelbart etter injeksjon. Mål kanylen, dosesprøyten og vevet ved hjelp av en dosekalibrator for å bestemme restdosen som ikke ble injisert i musen.
    1. Registrer aktiviteten og tiden i en notatblokk.
  4. Etter at musene er injisert, merk burene med et burkort som indikerer at musene er radioaktive. Registrer og logg merdene i henhold til institusjonelle retningslinjer. Plasser deretter musene i et utpekt radioaktivt holdeområde.

6. PET/CT-avbildning

  1. Utfør PET-avbildning 18-24 timer etter injeksjon av 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Vei og score musene før skanning.
    MERK: Skannerens bruksanvisning avhenger av skanneren som brukes.
    1. Sørg for at røntgenkomponenten i PET/CT-skanneren er oppvarmet og klar for innsamling.
    2. Åpne programvaren for anskaffelse av PET-skanner på datamaskinen.
    3. Fra rullegardinmenyen Investigator Login klikker du på riktig laboratorieinformasjon.
    4. På Prosjekt-siden kan du enten opprette et nytt prosjekt eller velge et eksisterende prosjekt fra rullegardinmenyen.
    5. Når initialiseringsprompten automatisk vises på skjermen, klikker du på Home Bed og venter på sengen til hjemmet. Klikk deretter på Varm opp CT.
      1. Forsikre deg om at CT-skjermdøren er lukket for å la CT varme opp.
  2. Mens skanneren varmes opp, scorer du EAE-musene og injiserer dem subkutant med 0,2-0,4 ml varmt saltvann i flanken for hydrering.
  3. Etter at skanneren er varmet opp, gå tilbake til datamaskinen for å sette opp PET-skanningene for studien.
    MERK: Disse kan settes opp før dagen for skanningen.
    1. Under overskriften Nylige studier klikker du på Opprett ny studie. Fyll ut studienavnet, protokollen, forbindelsen og emneinformasjonen.
      1. Hvis du utfører en PET/CT, velger du PET-protokoll først, og deretter velger du CT-protokoll.
        MERK: Vanligvis er en standard CT tilstrekkelig for å skanne EAE-musemodellen. En CT-skanning er 1 min lang og oppnås med binning ved 2 x 2 ved spenning 80 kVp, strøm 150 μA og 720 fremspring. CT-bilder rekonstrueres ved hjelp av en modifisert Feldkamp-algoritme.
      2. For PET-protokollen, velg en 10-15 min statisk 64-kobberskanning. Hvis denne skanningen ikke allerede er på listen over tilgjengelige protokoller, legger du den til ved å klikke på kategorien Protokoller i Standard-menyen , Opprett ny protokoll | Rullegardinmenyen Isotoper . Hvis ønsket isotop ikke er oppført, klikk på Mer | Legg til fra Bibliotek og legg til ønsket isotop. Definer skanningens varighet, klikk på alternativknappen for Static Scan, navngi protokollen og klikk på Lagre.
      3. Gå tilbake til kategorien Studier og fortsett å navngi og sette opp alle ønskede skanninger for dagen.
        MERK: Det anbefales også å sette opp en "CT Test" -skanning ved hjelp av bare en standard CT for å kontrollere sengens plassering av den første skanningen for å sikre optimal plassering. Dette bør være den første skanningen som kjøres for studien.
  4. Når skanneren er klar, bedøv musene i en knockdown-boks for å forberede dem på skanningen.
    MERK: På dette stadiet er musene sannsynligvis veldig syke; Det er beste praksis å minimere tiden under anestesi.
    1. Påfør øyegel.
  5. Forsikre deg om at skannesengen med fire mus er utstyrt med varmeelementer, for eksempel varmeputer eller oppvarmet luft, med isofluran satt til 1,5 %-2 % og varmepute slått på (figur 3). Plasser musene i liggende stilling på skannesengen.
    1. Etter hvert som EAE-sykdommen utvikler seg, blir musens ryggrad kraftig buet. Skann musene mens de er på ryggen for å rette ryggraden så mye som mulig, og forbedre analysen nedstrøms. Trekk forsiktig i musehalen for å hjelpe til med å rette ryggraden.
  6. Når du er i liggende posisjon, teiper du hver mus sikkert på plass med myk mikroskoptape. Bruk en stripe tape over hodet og en annen forsiktig over magen for å minimere bevegelse på grunn av pusten.
    1. Ta opp i en lab notatbok som musen er i hva skanning posisjon.
  7. Når musene er sikret, går du tilbake til skannecomputeren for å betjene skanneren.
  8. Åpne Motion Controller-menyen . Klikk på PET Center FOV for å flytte musene på skannesengen inn i PET-ringen. For dagens første skanning, klikk på CT Center FOV. Når du er på plass, kjør CT Test-skanningen for å sikre at posisjonen er riktig; Gjenta til sengestillingen er tilfredsstillende.
    1. Legg et lite stykke hvit tape på skannesengen for å markere riktig sengeplassering for resten av studien.
  9. Når sengen er på plass for PET-skanningen, starter du skannesekvensen ved å klikke på Kjør.
    1. Vent til skanneren automatisk beveger seg fra PET-ringen til CT.
    2. Sjekk alltid visuelt om dyrene har beveget seg i riktig posisjon for både PET og CT.
    3. Registrer starttidspunktet for skanningen i en laboratorienotatbok for forfallsjustering av dosen som ble injisert under dataanalysen.
  10. Etter at skanningen er fullført, la bildet rekonstruere. Sjekk dataene før du fjerner dyrene.
    MERK: 3D-bestilte delmengder av OSEM-rekonstruksjon (expectation-maximization) vil ta omtrent 5 minutter for en statisk skanning.
  11. Kontroller og godkjenn dataene visuelt, bruk milten som en positiv kontroll, da dette vevet inneholder et stort antall B-celler. Fjern dyrene fra skannesengen og legg dem i en isofluranfylt knockdown-boks som forberedelse til perfusjon og påfølgende disseksjon.
  12. Gjenta trinn 6,5-6,12 for de gjenværende musene i studien.
  13. Når alle musene er skannet eller når du skanner en gruppe som har et åpent sted i skannesengen, skann standarden som ble utarbeidet i trinn 4.6.

7. Disseksjon for ex vivo gamma telling og autoradiografi

  1. Før dissekering, sørg for at alle gamma telling og sentrifuge rør er forhåndsveid.
  2. Utfør eutanasi via perfusjon, som tidligere beskrevet6, med PBS og torakotomi mens musene er dypt bedøvet (kontinuerlig inhalasjon av 4% isofluran, 2 l / min 100% O2).
  3. For å fjerne benmargen, kutt begge lårbenene i kneet og bekkenet. Pass på at begge hodene er fjernet fra lårbenet.
    1. Plasser begge lårbenene i et 0,5 ml sentrifugerør som har et hull i bunnen (ved hjelp av en 20 G nål) og har lokket avskåret.
    2. Plasser 0,5 ml røret som inneholder lårbenene inne i et 1,5 ml sentrifugerør med lokket avskåret.
    3. Plasser hele røroppsettet i en minisentrifuge. Spinn i 4 min ved 4 500 × g.
      MERK: Benmargen skal løsnes gjennom hullet i 0,5 ml sentrifugerøret og slå seg ned i bunnen av 1,5 ml sentrifugerøret.
      1. Separat rørene. Vei de tomme lårbenene i 0,5 ml sentrifugerøret. Vei benmargen i sentrifugerøret på 1,5 ml. Plasser hvert sentrifugerør i gamma tellerør.
  4. Fjern hjernen ved hjelp av tang og saks, pass på å holde hjernestammen intakt. Plasser hjernen i et gamma tellerør. Registrer tørrvekten, skyll med PBS, og hold på is til du er klar for telling.
  5. For å fjerne ryggmargen, utfør følgende trinn.
    1. Fjern hud og pels ved å lage et snitt nedover ryggsiden av dyret for å eksponere ryggsøylen (figur 1).
    2. Separer lumbale (L) fra cervikale (C) og thoraxregioner ved å kutte langs tre tverrplan rundt og gjennom ryggsøylen: ved nakkebunnen (C1 vertebra) (figur 1D, nummer 1); ved foten av brystkassen (L1 vertebra) (figur 1D, nummer 2); ved undersiden av bekkenet (L5 virvel) (figur 1D, nummer 3).
    3. Skjær under brystkassen (figur 1D, nummer 2).
    4. Skjær rett over korsbenet for å skille lumbale spinalområdet. Trim ryggsøylen forsiktig fra bekkenenden til lumbale ryggmargen er synlig (figur 1D, nummer 3). Trim av det omkringliggende vevet for å isolere lumbale og cervikale / thoracale regioner i ryggraden (figur 1D, nummer 4 og 5).
    5. For å utvise ryggmargen, bruk en slip-tip sprøyte (3-10 ml) fylt med PBS. Lag en forsegling mellom sprøyten og ryggsøylen ved hjelp av tommelen og pekefingeren.
      1. Trykk PBS forsiktig gjennom sprøyten for å få ryggmargen ut på en absorberende pute (figur 1E). Gjenta for begge ryggradene. Plasser ryggmargen vev i en gamma telle rør.
      2. Registrer tørrvekten, og tilsett PBS for å sikre at vevet er i bunnen av røret for å unngå tørking. Legg røret på is til det er klart for telling.
      3. Fjern cervikal/thorax ryggmarg fra kranialenden og lumbalcolumna fra haleenden av ryggsøylen (figur 1E).

8. Ex vivo gamma telling

  1. Åpne gamma counter programvare. Naviger til arbeidslisten og velg ønsket protokoll, for eksempel en 30 s telleprotokoll for 64Cu.
  2. Forbered minst tre standarder i separate rør. Kjør dem nå for bruk i analyse (trinn 10.2). Målet er å lage tre replikere volumer og mengder aktivitet i tre separate rør.
    MERK: Et volum på 500 μL gir gode resultater. Mens aktiviteten vil bli bestemt av maskinen som brukes, fungerer 10 μCi generelt bra.
  3. Plasser standardene i et rack merket med strekkoden som tilsvarer ønsket protokoll som skal kjøres. Plasser stativet på gammatelleren.
  4. Etter registrering av orgelvektene, plasser rørene som inneholder organene på gammatellingsstativet etter rørene som inneholder standardene.
    MERK: Organer av interesse for denne modellen kan inkludere aksiale lymfeknuter, blod, benmarg, hjerne, cervikale lymfeknuter, lårben, hjerte, lever, lumbal ryggmarg, muskel, milt, hale og cervical / thoracic ryggmargen.
  5. Sett et stativ med en stoppstrekkode på baksiden av gammatelleren.
  6. Trykk på Play-knappen på datamaskinen. Hvis mulig, ikke trykk på Play før det er flere stativer eller organer som skal kjøres for å tillate at alle rørene telles kontinuerlig i en fil. Forsikre deg om at et stativ med en stoppstrekkode er på baksiden av gammatelleren for hver kjøring.
  7. Kjør til alle prøvene er talt opp. Lagre og eksporter filen.

9. Ex vivo autoradiografi (ARG) av CNS-vev

  1. Følg tidligere publiserte trinn for både hjerne og ryggmarg ARG (mens du ekskluderer trinn 2-6 beskrevet av Chaney et al., da musene allerede er injisert med radiotracer fra PET-skanningen)6.
    MERK: Spesifikke instruksjoner for klargjøring av ryggmargen ARG-kassetten er oppført her6.
  2. Etter at gammatellingen er fullført for lumbal og cervical/thoracic ryggmargen, legg straks rørene på is til alle CNS-vev er talt.
    MERK: Se den tidligere publiserte metoden for ARG i hjernen6.
  3. Tipp forsiktig rørene slik at ryggmargen faller ut på en absorberende pute. Hvis ryggmargen fester seg til siden av røret, skyll forsiktig med kald PBS og tipp røret igjen. Tørk forsiktig hver ryggmarg ved forsiktig blotting med et laboratorievev. Plasser de tørkede ryggmargene på en organisert måte på et tykt svart stykke papir.
    1. Merk ved siden av ryggmargen med en hvit penn for enkel identifisering.
    2. La det være plass i hjørnene og i midten av det svarte papiret for å plassere stabler med tre mikroskoplysbilder for å fungere som avstandsstykker for å forhindre kompresjon av ryggmargen når ARG-kassetten er lukket. Bruk 5-7 stabler.
  4. Når alle lumbale og cervical / thoracic ryggmargen er plassert på svart papir og merket, legg papiret forsiktig i ARG-kassetten. Plasser den åpne kassetten på et brett med tørris for å fryse ryggmargen.
  5. Når den er frossen, plasserer du forsiktig plastfolie mellom den digitale fosforoppbevaringsskjermen og ryggmargen og plasserer skjermen på toppen av prøvene. Lukk kassetten umiddelbart og legg den i fryseren på -20 °C i ca. 10 halveringstider (~127 timer).
  6. Når eksponeringstiden er fullført, skann filmen med et fosforbildeapparat. Analyser det resulterende digitale bildet (se avsnitt 12 for instruksjoner).

10. Analyse av biodistribusjonsdata

  1. Sett opp et "Dosekorreksjon" regneark for matematisk å bestemme tidskorreksjonen for det radioaktive henfallet, og dermed normalisere stråledoser og tillate sammenligninger mellom.
    1. Forfallskorrigere alle doser til injeksjonstiden, med hensyn til gjenværende aktivitet igjen i sprøyten og kateteret etter injeksjon.
    2. Ved hjelp av standardene utarbeidet i trinn 8.2, gjennomsnittlig aktivitetsmengde (μCi) og normalisert antall per minutt (CPM). Del gjennomsnittlig CPM med gjennomsnittlig standard aktivitetsbeløp for å få CPM / μCi.
      MERK: Forsikre deg om at aktivitetsmengden for hver standard er forfallskorrigert til det tidspunktet gammatelleren teller CPM for standardene. Gammatelleren skal normalisere alle CPM-verdier til protokollens starttidspunkt.
  2. Sett opp regnearket "Resultater" for å beregne den endelige prosentandelen injisert dose per gram vev (% ID / g) for hver prøve.
    1. Forfallskorrigere normalisert CPM fra gammatelleren for hver prøve som telles til injeksjonstiden til dyret.
      MERK: Forfallskorreksjon kan være til et hvilket som helst tidspunkt; sikre at alle doser og CPM-verdier er henfallskorrigert til samme tidspunkt.
    2. Normaliser forfallskorrigert CPM til massen av hver prøve for å bestemme CPM per prøve. Beregn den totale CPM injisert ved å trekke CPM i halen fra beregnet injisert CPM.
      MERK: Halen trenger ikke å massekorrigeres, da denne CPM-verdien ganske enkelt trekkes fra den totale injiserte CPM for å ta hensyn til eventuelle ekstravenøse sporstoffer fra injeksjon.
    3. Del CPM per masse med total CPM injisert for å beregne %ID/g.
  3. Sett opp et "Sammendrag" regneark for å vise de endelige resultatene for innspill til en grafisk programvare og påfølgende datavisualisering og statistisk analyse.

11. PET-bildeanalyse

  1. Åpne programvaren for PET-analyse. slikke på Fil |Åpne lokale data | DICOM. Finn ønsket fil (DICOM-format). Åpne både PET og CT.
  2. I Data Manager justerer du PET - og CT-kontrasten til de ønskede nivåene.
  3. Registrer og beskjær individuelle mus.
    1. I navigasjonsmenyen velger du kategorien Omorientering/registrering .
    2. Gå til Stiv meny i denne fanen. Angi CT-skanningen (0 ) som fast skanning og PET-skanning (1) som flytteskanning .
    3. Velg Stiv transformasjon og Rask kvalitet. Klikk på Registrer.
    4. Etter at registreringen er fullført (5-10 min), klikk på haken for å lagre registreringen.
    5. Inspiser dataene visuelt for å sikre at registreringen var vellykket. Eksporter økten ved å klikke på Fil | Sesjon | Eksport.
    6. Deretter beskjærer du hver mus i en helkroppsavling: gå til navigasjonsmenyen og klikk på Beskjæring. Dra sidene av hvert tverrsnitt fra ytterkanten og innover.
    7. Når ønsket mus er tett beskåret, klikker du på haken og eksporterer økten for å lagre.
    8. Deretter beskjærer og retter du hodene til hver mus for hjerneanalyse ved hjelp av manuell oversettelse, rotasjoner og flips i menyen Registrering / omorientering . Eksporter for å lagre.
  4. Analyser ryggmargen.
    1. Hvis du vil begynne å analysere interesseområder (ROI) i ryggmargen, åpner du verktøyet for 3D-avkastning fra navigasjonsmenyen .
    2. Under ROI-overskriften bruker du plusstegnet nederst på menyen for å opprette seks avkastninger: Lumbal ROI, Cervical/Thoracic ROI, Lumbal Skeleton, Thoracic Skeleton, Lumbal Spinal Cord, Thoracic Spinal Cord.
      MERK: Lumbal og Cervical / Thoracic ROI er generaliserte store avkastninger som vil bli brukt til å skape skjelettavkastningen (figur 4).
    3. For å unngå visuell forstyrrelse fra PET-signalet med dette trinnet, klikk på F3 for å slå av PET.
    4. Gå til toppen av 3D ROI Tool Operator. Klikk på den solide prikken til høyre for markørsymbolet for å åpne 3D-malemodus og Erode/Dilate-menyen .
    5. Velg Sphere og endre størrelsen til 20 piksler. Sett Utvid til +5.
      1. Før du fortsetter, gå til bunnen av menyen. Forsikre deg om at Lumbal ROI er valgt, da dette er den første avkastningen som skal trekkes.
    6. På CT finner du L6-ryggvirvelen i ryggsøylen (der ryggraden møter hoftene). Start en ryggvirvel over L6, tegn en grov ROI Lumbal ROI over de fem ryggvirvlene over hoftene (L1-L5 ryggvirvler). Bytt deretter til Cervical / Thoracic ROI og spore resten av ryggraden til bunnen av skallen.
      MERK: Dette trenger ikke å være presist, da det brukes til å indikere hvor Otsu-terskel skal forekomme i trinn 11.4.8.
    7. Etter å ha tegnet de generaliserte avkastningene, gå til toppen av operatøren. Velg menyen Segmenteringsalgoritmer .
    8. Fra rullegardinmenyen velger du Otsu Thresholding. For inngangen velger du Lumbal ROI. Nederst på menyen, sørg for at Lumbal Skeleton er valgt. I rullegardinmenyen ved siden av Bilde, sørg for at CT-skanningen er valgt og klikk på Bruk. Gjenta for cervical / thorax avkastning og thorax skjelett.
      1. Hvis Otsu-terskelverdien ikke fremhever ryggsøylen tilstrekkelig, bruk Global terskel og endre Min-verdien til 350 og Max til 3 500 for manuell terskel og juster etter behov for å isolere ryggvirvlene.
    9. Etter å ha brukt Otsu Thresholding for å opprette Skeleton ROIs, gå tilbake til navigasjonsmenyen (markørikon). Enten slett eller merk av for H (skjul) -kolonnen for både grov lumbal og cervikal / thorax-avkastning for å skjule dem. Merk av for I (uforanderlig) kolonnen for begge Skjelettavkastningen, slik at de ikke kan redigeres.
    10. Til slutt går du tilbake til toppen av 3D ROI Tool Operator og går til 3D Paint-menyen for å tegne avkastningen på ryggmargen.
      1. Velg Sphere-verktøyet igjen og spor ryggmargen i skjelettet for både lumbal og thorax, slik at riktig avkastning er valgt nederst i menyen.
      2. For å slette avkastningen, klikk på Kommando / Kontroll og tegn over delen som skal slettes.
      3. Kontroller ryggmargens avkastning fra alle tre planene for å sikre at det ikke er noen avkastning trukket utenfor ryggraden.
  5. Eksporter ryggmargsanalyseresultater.
    1. Hvis PET-signalet ble slått av i trinn 11.4.3, trykker du på F3 etter at ryggmargsavkastningen er trukket for å slå på PET igjen, eller velger Visual Controller (VC) og klikker på PET-linjen.
    2. Gå tilbake til navigasjonsmenyen (markørikon). Klikk på rutenettikonet for å vise tabell. Kopier tabellen til regnearkprogramvare og lagre.
    3. Til slutt, eksporter filen i PET-analyseprogramvare, som beskrevet ovenfor, for å lagre avkastningen som er trukket.
  6. Analyser hjernen ved hjelp av et halvautomatisk 3D-atlas.
    1. Åpne hodebeskjæringsfilen. Importer musens hjerneatlas ved å gå til menyen Avanserte moduler og velge 3D Brain Atlas Tool. Kontroller at referansen er satt til CT og at beskjæringsalternativet ikke er merket av. Angi en bane for utdatakatalogen.
    2. I Avansert innstilling endrer du Transformer til Versor-Affine. Behold alle andre standardinnstillinger. Klikk på Kjør.
    3. Juster atlaset manuelt i menyen Reorientering/Registrering og bruk CT på skallen som en retningslinje for tilpasning av atlaset.
      1. Vær forsiktig hvis skalering er nødvendig, da dette i stor grad kan påvirke hjernens strukturvolum. Klikk på haken når justeringen er fullført.
      2. Kjør atlaset på nytt med Importer 3D-avkastning valgt.
      3. Eksporter filen for å lagre atlaset som er montert på det beskårne hodet.
    4. Etter å ha tegnet og eksportert alle avkastninger fra de ønskede organene, beregner du en standard bindingskorreksjonsverdi. Forfallskorrigere alle data og konvertere til %ID/g som tidligere beskrevet6. Normaliser til organet som passer dyremodellen, for eksempel hjertet for å normalisere til radiotracer tilstede i blodbassenget.

12. Ex vivo autoradiografi analyse

  1. Åpne den digitale bildefilen (.gel) ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren. Juster lysstyrken og kontrasten til ønsket terskel. Bruk en passende fargeoppslagstabell hvis ønskelig.
    MERK: Royal eller Grays anbefales for enkel visualisering.

Representative Results

hCD19-mAb var DOTA-konjugert og radiomerket med 64Cu som vist i figur 2. EAE og naive mus gjennomgikk PET/CT-skanning (figur 3) 18-24 timer etter injeksjon med 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. PET / CT-bilder ble samregistrert ved hjelp av PET-analyseprogramvaren, og CNS-vevene ble analysert ved hjelp av manuelle avkastninger eller et halvautomatisk 3D-hjerneatlas. Radiotracerbinding i ROI (figur 4) var høyere i EAE-mus enn i naive mus. Ex vivo gammatelling og ARG viste økt binding i ryggmargen (både lumbale og cervicale thoraxsegmenter) og hjerne (kun ARG) hos EAE-mus sammenlignet med naive (figur 5 og figur 6). Ex vivo gamma-telling av perfuserte mus viste også redusert radiotracerbinding i perifere organer, inkludert milt, lårben og benmarg (figur 5), forenlig med at B-celler forlot periferien og infiltrerte CNS i denne EAE-modellen.

Figure 2
Figur 2: Konjugasjons- og radiomerkingsskjema for generering av 64 Cu-merket humanspesifikt CD19 monoklonalt antistoff, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), i tillegg til kvalitetskontrolldata. (A) Reaksjon av DOTA-NHS-ester med hCD19 monoklonalt antistoff for å produsere hCD19-DOTA-konjugat (ikke i skala) og radiomerking med 64 Cu-CuCl3 for å produsere 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Representativ ITLC-kromatograf. Toppen på 40-60 cm er det radiomerkede antistoffet; ubundet 64Cu-CuCl3 beveger seg med den mobile fasen og vil være tilstede fra 200 til 240 cm. Det er ingen påviselig ledig 64Cu-CuCl3 i denne kromatografen. (C) Kvalitetskontrollspesifikasjonene for det radiomerkede antistoffet. Forkortelser: DOTA-NHS ester = 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraeddiksyre mono-N-hydroksysuccinimid ester; ITLC / HPLC = øyeblikkelig tynnsjiktskromatografi / væskekromatografi med høy ytelse; MALDI/LC-MS = matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering/væskekromatografi-massespektrometri; CPM = teller per minutt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Fotografier som demonstrerer hvordan man sikrer mus i en 3D-printet seng i PET-skanneren for å muliggjøre høykvalitetsavbildning av ryggmargen og hjernen samtidig som bevegelse minimeres . (A) 3D-trykt skannerseng med fire mus (også kjent som "musehotell") utstyrt med varmeelementer og anestesirør. (B) Bedøvede mus i liggende stilling for å maksimere ryggradens retthet; Sengeposisjonen til hver mus registreres. (C) Mus teipet sikkert over hodet for å minimere bevegelse i hjernen og over magen for å minimere bevegelse fra å puste, uten å påvirke pusten. (D) Museseng plassert i skanneren og teipet til skannesengen. Anestesislangen ble koblet fra skanner til seng og isofluran satt til 2%. Musepusten ble overvåket for å sikre riktig isofluran før skannerdøren ble lukket. Forkortelse: PET = Positronemisjonstomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Ryggmargsbilde og hjerneanalyse og resultater ved hjelp av PET-analyseprogramvare . (A) i ) ROI (rosa og brunfarge) trukket på ryggraden for å skille lumbal fra thorax og cervical vertebrae og forberede bilde for Otsu terskel. ii ) Ryggvirvler (turkise og røde) ble segmentert ut ved hjelp av Otsu Thresholding. iii ) Ryggvirvlene ble deretter gjort uforanderlige i 3D ROI-menyen, og ryggmargen delt inn i cervikal / thorax (lilla) og lumbal (marine) avkastning. iv) Den vertebrale avkastningen ble fjernet, slik at ryggmargsavkastning og representativt hjerneatlas ble brukt. (B) Representativ analyse av PET-resultater fra forskjellige CNS-regioner representert som% ID / g normalisert til hjertets avkastning i hvert dyr. PET-innsamling var en 10 min statisk skanning via PET/CT-avbildning. Hjerneområder kvantifisert ved hjelp av en halvautomatisert hjerneatlastilnærming, vist i panel A. iv) Representative resultater viser enten signifikans eller trend mot signifikant økning i sporbinding i hjerne og thorax ryggmarg. Statistikk utført med Student t-test (*: p < 0,0332). Forkortelser: PET = Positronemisjonstomografi; ROI = regioner av interesse; CNS = sentralnervesystemet; CT = computertomografi; %ID/g = prosent injisert dose per gram vev; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativ kvantifisering av ex vivo gammatelling i ulike organer i EAE og naive mus uttrykt som %ID/g. Etter PET-skanning ble mus perfusert med PBS for å fjerne radiotraceren som var tilstede i blodet, enten fri eller bundet til blodboende CD19 + B-celler, og organer ble raskt dissekert og veid for å ha en nøyaktig vekt av hvert organ. Sporbinding er signifikant redusert i milt og benmarg hos EAE-mus sammenlignet med naive. Økt radiotracerbinding er observert i både lumbal og cervical/thoracic ryggmargssegmenter hos EAE-mus. Hjernen viser ikke signifikant økning i radiotracer-signal, selv om den trender mot betydelig økning. Statistikk utført med Student t-test (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Forkortelser: PET = Positronemisjonstomografi; %ID/g = prosent injisert dose per gram vev; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Ex vivo ARG-bilder viser 64Cu-DOTA-hCD19-mAb-binding i sagittale hjerneseksjoner og hele ryggmarger fra EAE sammenlignet med naive mus. Digitale fosforlagringsfilmer ble skannet med fosforavbildning etter å ha blitt utsatt for radioaktive vevsprøver i ca. 10 halveringstider (127 timer eller 5 dager). De resulterende bildene avslører visuelt høyere signal i hjernen til EAE-mus sammenlignet med hjerneseksjoner fra naive mus, noe som forventes på grunn av regionene som er kjent for å inneholde B-celler i denne modellen5. Spesielt er det økt sporsignal i hjernestammen, lillehjernen og ventriklene i EAE-musehjerneseksjoner. Denne økningen i signal for EAE-musehjerneseksjoner speiler det som ble funnet for i PET-kvantifiseringen for hele hjernen som er beskrevet ovenfor. På samme måte er det en økning i radiotracerbinding i både cervikal / thorax og lumbale ryggmargssegmenter sammenlignet med naive ryggmarger, noe som gjenspeiler det som ble funnet ved hjelp av ex vivo gamma-telling. Forkortelser: PET = Positronemisjonstomografi; EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt; Vent = ventrikler; Cb = lillehjernen; BS = hjernestammen; TSc = thorax og cervical ryggmargen kombinert; LSc = lumbal ryggmarg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Farging av CNS-vev av naivt og EAE-musehjernevev med CD45R/B220. B-celler observeres i hjernestamme, hjernehinner og hvit substans hos EAE-mus (n = 7 EAE, n = 5 naive mus, gjennomsnittlig fire skiver per dyr). Dette tallet er fra 5. Skalastenger = 5 mm (lav forstørrelse [1x]) i sagittale hjernebilder, 100 μm (høy forstørrelse [20x]) i hjernestamme, hjernehinner og hvit substans i lillehjernen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne artikkelen beskriver en strømlinjeformet metode for avbildning av human-CD19+ B-celler i en musemodell av MS ved hjelp av CD19-PET. På grunn av den heterogene presentasjonen av MS og varierende respons på behandlinger, kan ledelsen i klinikken være utfordrende, og nye tilnærminger for terapivalg og overvåking er sterkt nødvendig. PET-avbildning kan tjene som et kraftig verktøy for å overvåke sykdomsprogresjon og individuell respons på B-cellenedbrytende terapi. I tillegg til MS kan CD19-PET-avbildning brukes til å overvåke B-celleuttømming etter behandling i subtyper av lymfomer og leukemi eller andre B-cellemedierte sykdommer. Denne protokollen og representative data viser nytten av avbildning av B-celler i nevrologiske sykdommer.

For å studere humane CD19+ B-celler i sammenheng med MS, valgte vi den B-celleavhengige MOG1-125 EAE-modellen 7. I likhet med andre EAE-modeller, presenterer denne modellen med symptomer på progressiv lammelse og infiltrasjon av immunceller i CNS. MOG1-125-modellen er imidlertid unik ved at den er en B-celledrevet modell: mus inneholder varierende antall B-celler i subaraknoidalrommet i hjernehinnene, hjernestammen, parenkyma og ventriklene. Disse lymfocyttene kan være spredt spredt over disse områdene og/eller danne follikkellignende strukturer, som også observeres hos mennesker med MS 8,9. I tillegg til å bruke naive mus som kontroller, kan et komplett Freunds adjuvans (CFA)-bare induksjonssett brukes (dvs. en identisk induksjonsemulsjon til det som gis til EAE-mus sans MOG-proteinet). I EAE-musemodellen er blodhjernebarrieren (BBB) dysfunksjonell og tillater større enheter, for eksempel antistoffer, å krysse. CD19-mAb radiotracer vil bare binde seg og forbli i CNS hvis B-celler er til stede; sporstoffet vil sirkulere tilbake i blodbassenget hvis B-celler ikke er til stede. Vi har demonstrert dette ved hjelp av gammatelling og ex vivo autoradiografi av CNS-vev ved perfusering før måling av radioaktivitetsnivået i vevet. Vi har også demonstrert dette i tidligere publikasjoner som rapporterer bruken av mAb-baserte PET-radiotracere (dvs. immunoPET-bildebehandlingsmetoder) for å oppdage B-celler i CNS 1,2.

DOTA-kelatoren ble brukt siden den har blitt brukt i klinisk PET-avbildning med kobber-64-merkede peptider og antistoffer, og vi tar sikte på å oversette hCD19-mAb for klinisk avbildning av MS-pasienter. DOTA har tilstrekkelig bindingsaffinitet til kobber-64 in vivo. In vivo-stabiliteten er svært viktig fordi fri 64Cu går til leveren og kan skjule signalet fra bundet radiotracer; Det er derfor viktig å måle signalet i leveren for å beregne det relative signalet sammenlignet med andre organer. Muskler tas vanligvis som et kontrollvev, men i tilfelle av EAE kan det være betennelse tilstede i musklene. Halveringstiden på 64Cu er 12,7 timer, noe som gir god tid for DOTA-hCD19-mAb til å binde seg til målet samtidig som signalet kan måles med PET. Ved fremstilling av konjugatet bør småskala (75-125 μg) testreaksjoner utføres for å bestemme mengden DOTA som skal legges til mAb for å produsere ønsket DOTA / mAb-forhold (f.eks. En reaksjon på 6-10 ganger overflødig DOTA-NHS-ester per mol mAb kan ha råd til et konjugat på 1-2 DOTA / mAb). Reaksjonstiden og temperaturen (f.eks. 2-4 timer eller over natten ved 4 °C eller romtemperatur) påvirker også DOTA/mAb-forholdet og bør optimaliseres. En titrering med ikke-radioaktivt kobber kan utføres for å beregne antall DOTA per mAb. Vi anbefaler imidlertid å utføre MALDI-MS og/eller LC-MS for mer pålitelige og nøyaktige resultater.

Det beregnede DOTA/mAb-forholdet er en gjennomsnittsverdi for en bestemt prøve, og noe variasjon forventes. For MALDI tas flere skudd per prøve for de konjugerte og ukonjugerte mAbs. Vi beregner deretter forholdet mellom konjugert og ukonjugert for å bestemme gjennomsnittlig antall DOTA / mAb. DOTA/mAb-forholdet er viktig fordi for mange kelatorer vil forstyrre antistoffbindingen og for få vil føre til inkonsekvent radiomerking og lavt signal. Forholdet bør være svært nært mellom partier av konjugat for å opprettholde konsistent signalintensitet og bindingskinetikk; Ideelt sett bør samme gruppe konjugat brukes til alle eksperimenter innenfor en bestemt studie. En lovende teknikk for å redusere potensielle effekter på immunreaktivitet på grunn av mulig overkonjugering er å bruke stedsspesifikk konjugering10 hvorved chelatorkøyningen er stedsselektiv på antistoffets tunge kjedeglykaner, og dermed garanterer tilsetning av 1 kelator per mAb.

Radiomerkingsreaksjonsbetingelsene bør optimaliseres for å sikre høyest mulig merkingseffektivitet og utbytte, siden forskjeller i antistoff, DOTA / mAb-forhold og 64Cu molar aktivitet, blant andre forhold, vil påvirke radiomerking. Bruk av det optimale konjugatforholdet 64Cu til mAb kan tillate at radiotraceren brukes uten rensing, noe som reduserer tiden som kreves for radiomerking og tap på grunn av tyngdekraftsstrømningskolonnen og radioaktivt henfall. En konsistent og pålitelig molar aktivitet kan også oppnås når det samme 64Cu til mAb konjugatforholdet brukes, noe som er spesielt viktig når man sammenligner resultater på tvers av flere kohorter av mus eller bildestudier. ITLC-betingelsene kan også endres for å passe hver bruker. Hvis rensing er nødvendig, bør en alikot lagres for enten HPLC- og/eller UV/Vis-spektrofotometri slik at molaraktiviteten kan beregnes.

Det er viktig å merke seg at bruk av radiomerkede antistoffer for avbildning kan være utfordrende. Det er viktig at antistoffet som brukes til radiotraceren er biologisk inert for ikke å ha en fysiologisk effekt. Dessuten, siden antistoffer har lang blodopphold, må man vente lenge nok på sirkulasjon, binding og clearance av en gitt mAb for å sikre et passende signal-til-bakgrunn uten at det går ut over bildekvaliteten. Vanligvis er det tilstrekkelig å vente i 20-48 timer for en 64 Cu-merket mAb, men man bør avbilde ved 2, 4, 6, 12, 24, 48 timer etter injeksjon når man vurderer en ny mAb PET-sporstoff for å bestemme det beste tidspunktet for avbildning i en gitt gnagermodell. Det samme gjelder for anskaffelse av ARG-bilder med det høyeste signal-til-bakgrunn-forholdet. De representative bildene i denne protokollen ble tatt 18-20 timer etter injeksjon, selv om andre tidspunkter kan brukes avhengig av radioisotopen som brukes. Ulike antistoffer som binder seg til forskjellige epitoper av CD19 vil gi varierende resultater og bør karakteriseres strengt.

Når du analyserer ryggmargssignalet, er det viktig å plassere mus på ryggen i skannesengen for å redusere bevegelse forårsaket av pust. I tillegg kan liggende plassering bidra til å rette ryggraden hos mus som har økt spinalkurvatur på grunn av utviklingen av EAE-sykdom. Et annet viktig aspekt å vurdere når man tar sikte på å oppdage signal i ryggraden og ryggmargen, er å unngå å injisere MOG1-125 på flanken, da injeksjonsstedene kan binde sporstoffet på grunn av den tilhørende immunresponsen i disse områdene. Nærheten til injeksjonsstedet kan forstyrre ryggmargsanalysen; Dermed er injeksjoner i brystet å foretrekke for applikasjonen som er beskrevet her.

Bildeanalyseteknikkene som brukes er spesifikke for CNS-avbildning. Et hjerneatlasverktøy i bildeanalyseprogramvaren gir reproduserbare og pålitelige resultater så lenge registreringen av PET og CT er nøyaktig. Ved å bruke det halvautomatiske 3D-hjerneatlaset og justere det slik at det passer til skallen til hver mus, kan du oppnå konsistent avkastning mellom dyr. Siden det for øyeblikket ikke er noen automatisert eller semi-automatisert tilnærming for å analysere signalet i ryggmargen, må manuelle avkastninger trekkes. Spesielt når du kvantifiserer CD19 + B-celler (eller en hvilken som helst celletype som er tilstede i både benmarg og ryggmarg), er det viktig å eliminere signalet som oppstår fra ryggraden og benmargen så mye som mulig. Årsaken til dette er at naive mus er kjent for å inneholde flere CD19+ B-celler i benmargen enn EAE-mus, der B-celler forlater periferien for å infiltrere CNS 5,11. Dette benmargssignalet kan skjule det sanne signalet i ryggmargen.

For å avgrense ekte ryggmargssignal samtidig som signalbidraget fra ryggsøylen og benmargen minimeres, kan Otsu-terskelverdien av CT-bildet brukes til å lage en uforanderlig avkastning for ryggsøylen. En separat ryggmargsavkastning kan da enkelt trekkes inn i ryggsøylen. Den samme teknikken kan også brukes til å måle benmarg i lårbenet. Dette er en veldig nyttig metode for å få innsikt i sporbinding i ryggmargen. På grunn av den relativt lave romlige oppløsningen av PET og problemer knyttet til den partielle volumeffekten ved skanning av små anatomiske regioner av mus, muliggjør bruk av ytterligere ex vivo bekreftende teknikker (f.eks. gamma-telling, ARG) validering av radiotracerbinding i ryggmargen uten tilstedeværelse av blod, cerebrospinalvæske eller spillover-signal fra ryggraden.

Signalet i cervikal / thoracal ryggmargen har en tendens til å variere i EAE-musene, avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen og hvor mange B-celler som infiltrerer under den adaptive immunresponsen. Denne variasjonen i antall B-celler som infiltrerer, samt den lille mengden B-celler i CNS sammenlignet med de i bekken-/ryggmargen hos naive mus, kan gjøre in vivo-kvantifisering av ryggmargsvev utfordrende hos mus. Gitt den romlige oppløsningen av PET i smådyravbildning, kan signalet fra beinmargen smitte over på ryggmargssignalet. Ex vivo biodistribusjon og autoradiografi fullført her hjelper til med å validere PET-signalet til ryggvirvlene versus ryggmargsvevet. Mus blir perfusert før disseksjon for å fjerne eventuelle ubundne sporstoffer i blodbassenget, slik at gammatellingen og autoradiografiresultatene gjenspeiler sporstoffet som faktisk er bundet i hvert organ i stedet for sporstoffet som er i blodbassenget i det organet.

Radiotracere sirkulerer gjennom blodet, og med antistoffsporere, spesielt, er det ofte ubundet radiotracer tilstede i blodet i flere uker etter den første injeksjonen. Siden vi avbilder hjernen og ryggmargen, som har mange blodårer, er det viktig å forstå hvilken del av signalet som virkelig skyldes sporbinding i hjerne / vev av interesse versus det som er tilstede i blodbassenget. Det er derfor nødvendig å dele hjernesignalet med signal i hjertet/blodbassenget. I den kliniske settingen kan de samme bildeanalyseteknikkene til Otsu-terskel av ryggvirvler og avkastning på ryggmargsvev brukes til kvantifisering. Gitt de større vevsvolumene hos mennesker sammenlignet med mus, bør det være betydelig mindre påvirkning fra partielle volumeffekter, noe som fører til forbedret nøyaktighet og negerer behovet for ex vivo-teknikker for å bekrefte in vivo-funn. Bruken av PET i klinikken vil tillate klinikere å tilpasse terapi for hver pasient avhengig av deres individuelle B-cellebyrde.

ARG er spesielt nyttig for å anskaffe bilder med høy oppløsning for å muliggjøre mer nøyaktig avgrensning av den romlige plasseringen av sporstoffbinding i små regioner som hjernestammen og lillehjernen. De samme seksjonene og/eller tilstøtende seksjoner kan lagres for immunhistokjemiske flekker for å bekrefte tilstedeværelsen av B-celler. Vi har tidligere farget CNS-vev med CD45R/B220 (tilleggsfigur S1) for å korrelere antall B-celler med PET- og ARG-signal 5,9. Fargingen kan deretter sammenlignes romlig med ARG-resultatene for å verifisere at radiotracersignalet samsvarer med fargemønsteret. B-celler kan være tilstede i klynger eller diffust gjennom hele hjernestammen; PET-følsomheten er tilstrekkelig høy til å måle signalet, noe som er oppmuntrende for klinisk oversettelse. For ryggmargs ARG sikrer fjerning av ryggmargen fra ryggvirvlene at signalet som måles skyldes sporbinding i ryggmargsvevet i stedet for benmarg og / eller blod, noe som kan skjule PET-bilder på grunn av delvise volumeffekter.

I likhet med ARG muliggjør ex vivo gamma-telling kvantifisering av radioaktivt signal i individuelle organer. For denne spesielle teknikken er det viktig å måle våtvekten av vev og sørge for at de er på bunnen av sine respektive rør før du plasserer rørene i gammatelleren. Rørene må merkes med musenummer og vev, slik at riktig rør brukes; Røret veies deretter på en kalibrert vekt og organer settes inn i nærmeste tiendedel av et mikrogram (0,0001 mg). Noen vev er ekstremt små og forskjellen i rørmassen før og etter vil være i størrelsesorden 0,0001 mg. Vevet bør veies umiddelbart etter disseksjon for å forhindre tap av fuktighet, noe som resulterer i en lavere masse. Etter veiing skal hjernen og ryggmargsrørene fylles med PBS for å forhindre tørking før frysing av disse vevene for ARG.

Disclosures

CD19-antistoffet ble levert av Horizon Therapeutics.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for støtten fra SCi3 smådyravbildningsanlegg ved Stanford og Dr. Frezghi Habte for hans tekniske assistanse med PET/CT. LC-MS utføres av kjernepersonalet ved kjerneanlegget ved Stanford University Mass Spectrometry (SUMS), og vi setter pris på personalet for å tilby denne tjenesten. Vi takker Horizon Therapeutics for svært vennlig å gi hCD19-mAb og Jodi Karnell spesielt for hennes tekniske veiledning og støtte. Dette arbeidet ble finansiert av NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter MiliporeSigma UFC505008 centrifugal filter
64Cu-CuCl3 Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner Eckert & Ziegler AR-2000
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film  GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only
Butterfly Needle Catheter SAI Infusion Technologies BLF-24
DOTA-NHS-ester Macrocyclics B-280
EAE Induction Kit Hooke Laboratories EK-2160
Geiger Counter Ludlum 14C
GNEXT PET/CT Scanner Sofie GNEXT
Hidex Automatic Gamma Counter Hidex AMG
HPLC Column Phenomenex  00H-2146-K0 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm
Illustra NAP-5 column Cytiva 17085301 DNA gravity column
Image J NIH ARG analysis software
Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) Thermo Scientific PI90410
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific 840281400 UV-Vis micro/nano-spectrophotometer
PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade Eppendorf 30124707
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
VivoQuant Invicro Version 4 Patch 3 PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific PI89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  2. Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
  3. Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).
  4. Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies. Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107 (2016).
  5. Stevens, M. Y., et al. Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275 (2020).
  6. Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke. Journal of Visualized Experiments. (136), e57243 (2018).
  7. Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein. European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).
  8. Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor. Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).
  9. James, M. L., et al. Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).
  10. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  11. Lyons, J. -A., et al. B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide. European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).

Tags

Avbildning CD19+ B-celler eksperimentell autoimmun encefalomyelitt musemodell positronemisjonstomografi multippel sklerose demyeliniserende sykdom i sentralnervesystemet B-lymfocytter MS-patologi anti-B-celleterapier PET-avbildning in vivo spatiotemporal distribusjon B-cellebelastning PET-sporstoff humane CD19+ B-celler B-celledrevet musemodell av MS myelinoligodendrocyttglykoprotein 1-125 hjerne- og ryggmargsavbildning PET-avbildning in vivo ex vivo gammatelling sykdomsrelevante organer autoradiografi
Avbildning av CD19<sup>+</sup> B-celler i en eksperimentell musemodell for autoimmun encefalomyelitt ved bruk av positronemisjonstomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reyes, S. T., Azevedo, E. C.,… More

Reyes, S. T., Azevedo, E. C., Cropper, H. C., Nagy, S., Deal, E. M., Chaney, A. M., James, M. L. Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography. J. Vis. Exp. (191), e64133, doi:10.3791/64133 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter