Imagerie des lymphocytes B CD19⁺ dans un modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune à l’aide de la tomographie par émission de positons

Summary

Cet article détaille la méthodologie de radiomarquage d’un anticorps monoclonal anti-CD19 spécifique à l’homme et comment l’utiliser pour quantifier les lymphocytes B dans le système nerveux central et les tissus périphériques d’un modèle murin de sclérose en plaques à l’aide d’approches d’imagerie TEP in vivo, de comptage gamma ex vivo et d’autoradiographie.

Abstract

La sclérose en plaques (SEP) est la maladie démyélinisante du système nerveux central (SNC) la plus courante chez les jeunes adultes, entraînant souvent des déficits neurologiques et une invalidité au fur et à mesure que la maladie progresse. Les lymphocytes B jouent un rôle complexe et essentiel dans la pathologie de la SEP et sont la cible de plusieurs traitements dans le cadre d’essais cliniques. À l’heure actuelle, il n’existe aucun moyen de sélectionner avec précision les patients pour des thérapies anti-lymphocytes B spécifiques ou de quantifier de manière non invasive les effets de ces traitements sur la charge des lymphocytes B dans le SNC et les organes périphériques. L’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) a un énorme potentiel pour fournir des informations quantitatives très spécifiques sur la distribution spatio-temporelle in vivo et la charge des lymphocytes B chez les sujets vivants.

Cet article présente des méthodes de synthèse et d’utilisation d’un traceur TEP spécifique des lymphocytes B CD19⁺ humains dans un modèle murin bien établi de SEP piloté par les lymphocytes B, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), qui est induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline recombinante humaine 1-125. Des techniques optimisées sont décrites ici pour détecter et quantifier les lymphocytes B CD19⁺ dans le cerveau et la moelle épinière à l’aide de l’imagerie TEP in vivo . De plus, cet article présente des méthodes simplifiées pour le comptage gamma ex vivo d’organes pertinents pour la maladie, y compris la moelle osseuse, la moelle épinière et la rate, ainsi qu’une autoradiographie à haute résolution de la liaison du traceur CD19 dans les tissus du SNC.

Introduction

La SEP est un trouble neurologique à médiation immunitaire ; La présentation unique de chaque patient peut rendre la prise en charge difficile pour les patients et les cliniciens¹. La maladie elle-même se caractérise par la présence de lésions démyélinisantes et d’infiltration de cellules immunitaires dans le cerveau et la moelle épinière, entraînant des troubles physiques et cognitifs². Le paradigme traditionnel selon lequel la SEP est une maladie à médiation par les lymphocytes T a été remis en question pour la première fois dans le cadre d’un essai clinique historique de phase II sur le rituximab³, un traitement ciblant le sous-ensemble CD20⁺ des lymphocytes B. Depuis, d’autres thérapies à base de lymphocytes B ont été mises au point pour cibler CD19⁴, un biomarqueur pan-lymphocytaire B qui s’exprime sur une gamme plus large de lymphocytes B, ce qui peut être avantageux à la fois sur le plan diagnostique et thérapeutique. De plus, les méthodes existantes d’évaluation de l’efficacité du traitement (c’est-à-dire la surveillance du nombre de poussées et de l’activité de l’imagerie par résonance magnétique [IRM]) ne permettent pas de mesurer précocement la réponse, ce qui expose les patients à un risque important de lésions du SNC en raison d’une sélection et d’une optimisation thérapeutiques sous-optimales. Par conséquent, il est essentiel de mettre en place des stratégies pour surveiller des cellules immunitaires spécifiques, telles que les lymphocytes B CD19⁺ , en temps réel dans le SNC et à la périphérie des patients atteints de SEP.

L’imagerie TEP est une technique d’imagerie robuste qui permet de visualiser in vivo le corps entier d’une cible d’intérêt donnée, telle que CD19. Alors que les prises de sang, les enregistrements des taux de rechute et la surveillance des lésions par IRM fournissent des instantanés de l’efficacité du traitement, l’imagerie TEP peut permettre aux chercheurs et aux cliniciens de surveiller l’efficacité d’un traitement sur l’ensemble du corps. Cette approche proactive de la surveillance thérapeutique permet aux cliniciens d’évaluer l’efficacité des médicaments en temps réel, ce qui permet des ajustements rapides au besoin. La surveillance de l’emplacement et de la densité des populations cellulaires associées à la maladie permet également une évaluation longitudinale de la gravité à l’aide d’informations anatomiques spécifiques au patient. Il est donc essentiel de mettre en place des méthodes analytiques reproductibles pour exploiter de manière fiable tout le potentiel de l’imagerie TEP dans des contextes cliniques et précliniques.

Cet article décrit les méthodes (Figure 1) permettant d’effectuer l’imagerie TEP, le comptage gamma ex vivo et l’autoradiographie (ARG) des lymphocytes B CD19⁺ avec un anticorps monoclonal (mAb) anti-CD19 humain marqué au 64 Cu, connu sous le nom de 16C4-TM (⁶⁴Cu-hCD19-mAb), dans le modèle murin expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) de SEP induite chez des souris transgéniques exprimant le CD19 humain (hCD19) à l’aide de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline recombinante humaine 1-125 (MOG_1-125). Nous fournissons également des méthodes permettant d’évaluer la liaison des radiotraceurs de manière précise et reproductible dans le cerveau et la moelle épinière, deux sites critiques de pathogenèse souvent gravement affectés dans ce modèle et dans d’autres modèles neurodégénératifs. Ces techniques permettent d’étudier de manière non invasive le rôle des lymphocytes B dans la pathologie de la maladie et ont le potentiel d’être traduites cliniquement pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-lymphocytes B dans la SEP.

Protocol

Figure 1 : Plan de l’étude. Un aperçu des techniques clés dans cet article. (A) Placer les souris sur le dos dans le lit de balayage réduit les mouvements de la colonne vertébrale. (B) Imagerie TEP/TDM des souris. (C) Faites une incision sur la face dorsale de l’animal pour exposer la colonne vertébrale. (D) Divisez la colonne vertébrale en deux parties cervicales/thoraciques et lombaires et retirez les sections qui suivent les cinq coupes indiquées. (E) À l’aide d’une seringue, retirer la moelle épinière de la colonne vertébrale en faisant un joint avec la seringue et la colonne vertébrale et en rinçant les extrémités crânienne et caudale de la colonne vertébrale comme indiqué. (F) Segments isolés de la moelle épinière cervicale/thoracique et lombaire. Abréviation : TEP/TDM = tomographie par émission de positons/tomodensitométrie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément à l’Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) de l’Université de Stanford, un programme accrédité par l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Les souris ont été acclimatées au vivarium pendant au moins 7 jours avant le début de l’étude afin de minimiser le stress sur les souris, car le stress peut affecter l’induction de l’EAE.

1. Induction de l’EAE chez les souris CD19 humanisées femelles

1. Induire des souris femelles CD19 C57BL/6J humanisées âgées de 9 à 13 semaines avec EAE comme décrit précédemment⁵ en utilisant MOG_1-125.

2. Soins aux animaux et notation dans le modèle de souris EAE

1. Évaluez la progression de la maladie et les soins aux souris comme décrit précédemment⁵. En bref, notez ce modèle sur une échelle de 1 à 5 comme suit : 1 est la faiblesse / la mollesse de la queue, 2 est l’affaiblissement des membres postérieurs, 3 est la paralysie des membres postérieurs, 4 est la paralysie des membres postérieurs avec faiblesse des membres antérieurs, 5 est moribond.

3. Conjugaison, radiomarquage et caractérisation des anticorps monoclonaux

1. Conjuguer l’ester mono-N-hydroxysuccinimide de l’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (ester DOTA-NHS) au hCD19-mAb pour radiomarquer avec ⁶⁴Cu.
   1. À l’aide d’une colonne de dessalage, remplacez le tampon de stockage hCD19-mAb par un tampon HEPES (pH 8,5-9) : conditionnez la ou les colonnes de dessalage avec HEPES. Calculer le nombre de colonnes nécessaires en fonction de la capacité du volume d’échantillon de la colonne de dessalage et du volume d’anticorps monoclonaux requis : tubes de 0,5 mL : 30 à 130 μL de volume d’échantillon, 300 μL de lavage ; Tubes de 2 ml : volume d’échantillon de 200 à 700 μl, lavage de 1 ml.
   2. Refroidir la centrifugeuse à 4 °C pour l’échange de tampon via la colonne de dessalage.
   3. Récupérez la colonne de dessalage du réfrigérateur. Retirez le bas de la colonne de dessalage, desserrez le bouchon et placez la colonne dans un tube de collecte.
   4. Centrifuger à 1 500 × g pendant 2 min pour éliminer la solution de stockage ; Jetez le passage contenant la solution de stockage et réutilisez le tube de collecte. Tracez une ligne sur la colonne où le point le plus élevé de la résine compactée de dessalage est incliné vers le haut.
   5. Ajoutez un tampon HEPES sur le côté inférieur de la colonne de dessalage. Placez la colonne de dessalage dans la centrifugeuse avec la ligne vers l’extérieur ; Essorez à 1 500 × g pendant 2 min. Jetez le flux et réutilisez le tube de collecte.
   6. Répétez les étapes 3.1.4 et 3.1.5 2 fois en utilisant le même tube de collecte et en jetant l’écoulement entre les étapes.
   7. Placez la colonne de dessalage conditionnée dans un nouveau tube de collecte et étiquetez-le ; ce tube contiendra le hCD19-mAb.
   8. Ajouter de l’hCD19-mAb au sommet de la ou des colonnes de dessalage conditionnées et utiliser un tampon HEPES pour rincer le flacon d’anticorps monoclonaux vide ; Ajoutez-le en haut de la colonne de dessalage (volume total selon les recommandations du fabricant). Essorez à 1 500 × g pendant 2 min pour éluer le hCD19-mAb. Conservez le flux contenant le hCD19-mAb.
   9. Mesurez la concentration d’hCD19-mAb à l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis et ajustez-la à 0,5 μg/μL avec un tampon HEPES si nécessaire.
   10. À la solution d’anticorps monoclonaux hCD19, ajouter 1/50e^{du volume} de la solution d’anticorps monoclonaux de 0,5 M d’EDTA pour obtenir la concentration finale d’anticorps monoclonaux de 0,01 M dans la solution d’anticorps monoclonaux hCD19. Laisser reposer la solution hCD19-mAb-EDTA à température ambiante pendant 15 min.
   11. Retirez l’ester DOTA-NHS du congélateur et laissez-le revenir à température ambiante (10-15 min). Calculez le volume de DMSO à ajouter à l’ester DOTA-NHS pour obtenir une concentration de DOTA qui permettra d’ajouter le rapport molaire DOTA/mAb souhaité (qui est généralement de l’ordre de 1 à 2 DOTA/mAb).
       REMARQUE : Le volume d’ester DMSO-DOTA-NHS ajouté à l’anticorps monoclonal hCD19 ne doit pas dépasser 10 % du volume d’anticorps monoclonaux. Cela doit être fait à l’aide d’une feuille de calcul afin que cela puisse être fait rapidement et à plusieurs reprises.
   12. Sur la base du rapport souhaité entre DOTA et hCD19-mAb, calculez la quantité d’ester DOTA-NHS à ajouter à hCD19-mAb.
       nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg de DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL de DMSO → facteur de dilution de la solution DOTA/DMSO
   13. Peser 1 à 2 mg d’ester DOTA-NHS et ajouter soigneusement le volume correct (calculé à l’étape 3.1.11) de DMSO à l’ester DOTA-NHS ; Mélangez et essorez.
   14. Pipeter le volume calculé de la solution d’ester DOTA-NHS (étape 3.1.12) dans la solution de hCD19-mAb ; essuyez l’extérieur de l’embout de la pipette avant l’ajout pour vous assurer qu’il n’y a pas d’ajout supplémentaire d’ester DOTA-NHS (sans modifier la quantité dans la pipette). Mélangez doucement et essorez.
   15. Placer au réfrigérateur (4 °C) pour réagir toute la nuit (12-16 h).
2. Purification et concentration
   1. Refroidir la centrifugeuse à 4 °C pour les étapes d’échange du tampon du concentrateur centrifuge ; placez un bloc de tube PCR en métal sur de la glace carbonique pour congeler le conjugué.
   2. Sortez la réaction DOTA-hCD19-mAb du réfrigérateur et trempez-la en ajoutant un tampon TRIS de qualité biologique : 10 % du volume total de la réaction. Prélever 10 à 20 μg de l’échantillon pour l’analyse par spectrométrie de masse.
   3. Conditionner la ou les colonnes de dessalage comme décrit ci-dessus (étapes 3.1.1 à 3.1.5), à l’aide d’un tampon d’acétate d’ammonium de 0,1 M, pH 5,5.
   4. Remplacer la solution de DOTA-hCD19-mAb par de l’acétate d’ammonium (étapes 3.1.1-3.1.8).
   5. Concentrer la solution DOTA-hCD19-mAb : ajouter la solution à un concentrateur centrifuge de coupure de 50 kDa de poids moléculaire en suivant les recommandations du fabricant en matière de volume. Centrifuger à 4 000 × g pendant 10 min (ou jusqu’à ce que le volume soit réduit de 80 % à 90 %) ; Jetez l’écoulement.
   6. Répétez neuf fois de plus (10 au total) : ajoutez suffisamment d’acétate d’ammonium pour ramener le volume au volume maximum recommandé.
      REMARQUE : Le total doit correspondre à ce qui a été ajouté initialement, y compris ce qui reste dans la colonne, généralement 400-450 μL pour un concentrateur centrifuge d’une capacité de 500 μL.
      1. Rincer le flacon de réaction avec un tampon d’acétate d’ammonium pour récupérer tout résidu de DOTA-hCD19-mAb ; Ajoutez le lavage dans le concentrateur centrifuge.
      2. Centrifuger à 4 000 × g pendant 10 min.
         REMARQUE : Le temps d’essorage peut être réduit lors des tours suivants si le volume est réduit à 80%-90% en moins de temps.
   7. Retirez la solution protéique du concentrateur centrifuge. Notez le volume total du DOTA-hCD19-mAb.
      1. Dans le concentrateur centrifuge 2, ajouter suffisamment de tampon d’acétate d’ammonium pour un volume total de 100 μL et la pipette pour mélanger. Fermez la colonne du concentrateur centrifuge et inversez-la. Essorez à 4 000 × g pendant 2 min pour recueillir la solution. Transférer dans un nouveau tube.
      2. Dans le concentrateur centrifuge 500, utilisez une pipette pour recueillir la solution d’anticorps monoclonaux du concentrateur centrifuge ; ajouter à un nouveau tube.
   8. Mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Si la concentration est supérieure à 2 mg/mL, diluer avec de l’acétate d’ammonium à 2 mg/mL.
   9. Aliquote 100 μg par tube PCR (environ 50 μL) ; étiquetez les tubes avec DOTA-hCD19-mAb, la date, la masse et la concentration. Faites tourner les flacons.
   10. Congelez le DOTA-hCD19-mAb sur le bloc PCR réfrigéré sur de la glace carbonique (ou congelez-le sur de la glace sèche). Une fois tous les échantillons congelés, placez-les dans un congélateur à -80 °C.
   11. Mesurer le nombre de DOTA par hCD19-mAb par spectrométrie de masse. Conservez un échantillon d’anticorps non conjugués (purs) de chaque conjugaison pour calculer le rapport. Utilisez l’équation (1) ci-dessous ; la masse moléculaire est abrégée MW.
       (1)
3. Radiomarquage
   REMARQUE : Porter l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié pour manipuler la radioactivité, y compris une blouse de laboratoire, des gants et un dosimètre corporel et annulaire individuel, conformément aux règlements de l’établissement. Inspectez et changez régulièrement de gants pour éviter toute contamination radioactive. Utilisez un blindage en plomb et augmentez la distance par rapport à la source radioactive en manipulant avec des pinces lorsque cela est possible.
   1. Transférez la radioactivité du flacon d’expédition vers un nouveau flacon à l’aide d’une pipette. Mesurez la radioactivité.
   2. Retirer une aliquote pour la première réaction de radiomarquage. Ajouter 50 μL d’acétate d’ammonium (pH 5,5) par 1 mCi de ⁶⁴Cu-CuCl₃. Mesurez le pH en pipetant 1 μL sur une bandelette de pH avec une plage de 5,5 avec une résolution suffisante pour distinguer 5 et 6.
   3. Si le pH n’est pas de 4 à 5,5, modifiez-le en utilisant 1 M de NaOH ou 0,1 M de HCl. Ajouter de petites quantités, de 1 à 5 μL, de 1 M de NaOH si le pH est inférieur à 4 ou de 0,1 M HCl si le pH est supérieur à 5,5 jusqu’à ce que le pH correct soit atteint. À chaque ajout, mélangez soigneusement, essorez et mesurez le pH comme décrit ci-dessus. Notez chaque ajout et retrait de toute solution (y compris pour vérifier le pH) afin que le volume final puisse être calculé.
   4. Une fois le pH optimal atteint, ajouter 10 μg de DOTA-hCD19-mAb pour 1 mCi de ⁶⁴Cu-CuCl₃. Mélangez doucement et essorez brièvement.
   5. Placez le flacon de réaction sur un thermomélangeur réglé à 37 °C et 400 tours par minute (tr/min).
   6. Au bout de 30 min, tremper la réaction : diviser le volume total de la réaction par 50 et ajouter ce volume de 0,5 M EDTA au mélange réactionnel.
   7. Déterminer l’efficacité du marquage à l’aide de la chromatographie instantanée sur couche mince (ITLC) pour mesurer le pourcentage de cuivre lié et libre dans la solution.
      1. Découpez des bandes de papier TLC de 1 cm de large. Marquez à 1 cm du haut et du bas de la bandelette et préparez un tube (fiole conique de 50 ml) avec une phase mobile de moins de 1 cm d’acide citrique 0,1 M (le niveau de phase mobile doit être inférieur au repère de 1 cm sur la bandelette lorsqu’elle est placée dans le tube).
      2. Pipeter 1 μL de la solution réactionnelle sur la bandelette au repère inférieur de 1 cm (avant de solvant) et placer la bandelette dans le tube. Surveillez jusqu’à ce que le devant du solvant atteigne la marque supérieure de 1 cm, retirez la bande et enveloppez-la dans un morceau de film plastique.
      3. Placez la bandelette sur la plate-forme et passez-la dans un scanner d’imagerie radio-TLC. Recherchez l’anticorps monoclonal radiomarqué à l’origine et le ⁶⁴Cu libre qui se déplace avec le front de phase mobile (Figure 2). Si le pourcentage de cuivre libre est inférieur à 5 % (efficacité d’étiquetage de 95 %), procéder à l’injection chez les animaux. Si le pourcentage de cuivre libre est supérieur à 5%, procédez à la purification.
         REMARQUE : Le pourcentage de cuivre libre dépend généralement du rapport DOTA-mAb à ⁶⁴Cu, du temps de réaction, du pH et de la température. Les conditions de réaction doivent être optimisées par chaque utilisateur pour chaque nouvel anticorps monoclonal afin d’assurer des résultats cohérents.
4. Purification à l’aide d’une colonne gravitaire jetable de qualité ADN
   1. Conditionner une colonne d’écoulement gravitaire jetable de qualité ADN (colonne de dessalage/d’échange de tampon) selon les instructions du fabricant. Placez la colonne gravitationnelle jetable de qualité ADN sur un support annulaire ou un autre instrument derrière un blindage de plomb adéquat ; Assurez-vous que l’appareil est stable et facilement déplaçable. Placez le tube sous la colonne.
   2. Pipeter le mélange réactionnel brut sur la résine de la colonne d’écoulement par gravité. Attendez que tout le liquide se soit écoulé dans la résine. Pipeter suffisamment de PBS pour porter le volume total (produit brut plus PBS) à 500 μL.
   3. Placez la colonne au-dessus de tubes à centrifuger de 1,5 ml étiquetés de 1 à 10. Ajouter 1 mL de PBS dans la colonne. Recueillez cinq gouttes dans chaque tube jusqu’à ce que l’écoulement se soit arrêté.
      REMARQUE : Moins de 10 tubes peuvent être nécessaires.
   4. Coiffez le bas de la colonne et mesurez la radioactivité résiduelle. Mesurez chaque flacon avec un écoulement continu. Pour chaque flacon de plus de 50 μCi, préparer un ITLC à l’étape 3.3.7 pour mesurer le pourcentage de cuivre lié dans chaque fraction.
      REMARQUE : La ou les deux premières fractions ne contiendront que la phase mobile ; les anticorps monoclonaux radiomarqués élueront en premier (généralement les fractions 2 ou 3 à 5 ou 6) et les ⁶⁴Cu libres élueront en dernier (certains colleront à la colonne). Le pourcentage lié ⁶⁴Cu peut varier d’une fraction à l’autre.
   5. Combiner les fractions avec une liaison supérieure à 95 % (moins de 5 % de cuivre libre) ; Utilisez la solution injectable. Si vous le souhaitez, effectuez une HPLC d’exclusion de taille pour confirmer le radiomarquage⁵ et calculer l’activité molaire. Conservez une aliquote pour mesurer la concentration sur un spectrophotomètre UV-Vis après qu’il se soit désintégré pendant 10 demi-vies (127 h ou 5,3 jours).

4. Préparation de la dose

REMARQUE : Avant de manipuler la dose, portez un EPI approprié, y compris une blouse de laboratoire, des dosimètres corporels et des dosimètres pour les doigts et des gants.

1. Injecter 64 anticorps monoclonaux Cu-DOTA-hCD19 18 à ²⁴h avant la TEP, afin de permettre une circulation adéquate du radiotraceur dans l’organisme.
2. Placez immédiatement le récipient en plomb avec le ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb derrière un blindage en plomb. Allumez le compteur Geiger pour surveiller la contamination potentielle.
   REMARQUE : Changez fréquemment de gants lorsque vous manipulez des matières radioactives. Il est recommandé de porter deux gants pendant le prélèvement des doses pour faciliter les changements rapides de gants. Placez toujours les objets tranchants et les déchets contaminés dans la zone de déchets protégée désignée.
3. Diluer le ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb à une concentration appropriée dans un tube à centrifuger en plastique de 1,5 mL à faible liaison.
   REMARQUE : Le ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb se liera au plastique s’il n’est pas à faible liaison ; ⁶⁴ ansCu se liera au verre.
   1. Diluer le radiotraceur dans une solution saline pour éviter la radiolyse et simplifier le prélèvement de doses constantes.
   2. Préparer des doses à administrer entre 75 et 150 μCi dans 100 μL, si possible. Assurez-vous que le volume total maximal injecté ne dépasse pas 10 % du poids corporel de la souris.
4. Utilisez une seringue à insuline de 500 μL (50 cc) pour prélever la dose dans le tube en plastique à faible liaison. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la seringue car elle sera injectée par voie intraveineuse.
   1. Pré-étiquetez les seringues avec les numéros d’animaux correspondants.
   2. Enregistrez l’activité et la durée de la dose dans un cahier de laboratoire pour l’analyse des données.
   3. Préparez les doses pour l’injection dès que les animaux sont cathétérisés afin de réduire le temps passé sous anesthésie.
5. Une fois les doses préparées, préparez un étalon (fantôme) pour le balayage afin de générer un facteur d’étalonnage.
   1. Remplir un tube conique de 15 mL avec 50 à 75 μCi d’activité diluée dans de l’eau (ou du PBS).
      REMARQUE : Assurez-vous de bien mélanger la solution. L’étalon peut être exempt de ⁶⁴Cu restants de l’étiquetage.
      1. Mesurez la quantité d’activité dans la norme et enregistrez le temps.

5. Canulation et injection

NOTE : Voir les méthodes⁶ décrites précédemment pour la canulation intraveineuse de souris pour injection du radiotraceur⁶.

1. Peser et noter les souris en fonction de la gravité de la maladie, comme décrit à la section 2.1, avant d’anesthésier les souris dans une boîte de démolition remplie d’isoflurane à 1,5 à 3 % en vue de l’administration de radiotraceurs.
   REMARQUE : Ces souris seront injectées sur la paillasse, et non sur le scanner TEP comme décrit précédemment. Il n’est pas nécessaire de coller les cathéters en place pour l’injection, car les souris ne seront pas déplacées entre la canulation et l’injection.
2. Une fois qu’une souris est canulée, insérez l’aiguille dans l’extrémité du cathéter et injectez lentement. Après l’injection, appliquez ensuite une petite solution saline à travers le cathéter pour vous assurer que toute la dose est injectée.
   REMARQUE : Le volume doit être approximativement égal au volume mort du cathéter, qui est de 50 μL pour les cathéters utilisés par les auteurs.
   1. Injecter sur un morceau de lingette de laboratoire pour recueillir les gouttes de radiotraceur ; Tenez-en compte lors de la mesure de la dose résiduelle.
   2. Notez l’heure de l’injection dans un cahier de laboratoire.
3. Retirez la canule immédiatement après l’injection. Mesurez la canule, la seringue doseuse et le tissu à l’aide d’un calibrateur de dose pour déterminer la dose résiduelle qui n’a pas été injectée à la souris.
   1. Enregistrez l’activité et le temps dans un cahier de laboratoire.
4. Une fois les souris injectées, étiquetez leurs cages avec une carte de cage indiquant que les souris sont radioactives. Consigner et consigner les cages conformément aux directives de l’établissement. Ensuite, placez les souris dans une zone d’attente radioactive désignée.

6. Imagerie TEP/TDM

1. Réaliser une imagerie TEP 18 à 24 h après l’injection de ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Pesez et notez les souris avant le scan.
   REMARQUE : Le mode d’emploi du scanner dépend du scanner utilisé.
   1. Assurez-vous que la composante radiographique du tomodensitomètre est réchauffée et prête pour l’acquisition.
   2. Ouvrez le logiciel d’acquisition du scanner TEP sur l’ordinateur.
   3. Dans le menu déroulant Connexion de l’investigateur , cliquez sur les informations de laboratoire appropriées.
   4. Sur la page Projet, créez un nouveau projet ou sélectionnez un projet existant dans le menu déroulant.
   5. Lorsque l’invite d’initialisation apparaît automatiquement à l’écran, cliquez sur Home Bed et attendez que Bed to Home soit à la maison. Ensuite, cliquez sur Warm up CT.
      1. Assurez-vous que la porte de blindage de la tomodensitométrie est fermée pour permettre à la tomodensitométrie de se réchauffer.
2. Pendant que le scanner se réchauffe, marquez les souris EAE et injectez-leur par voie sous-cutanée 0,2 à 0,4 ml de solution saline chaude dans le flanc pour les hydrater.
3. Une fois le scanner réchauffé, retournez à l’ordinateur pour configurer les tomodensitogrammes pour l’étude.
   REMARQUE : Ceux-ci peuvent être configurés avant le jour de l’analyse.
   1. Sous l’en-tête Études récentes , cliquez sur Créer une nouvelle étude. Remplissez le nom de l’étude, le protocole, le composé et les informations sur le sujet.
      1. Si vous effectuez une TEP/TDM, sélectionnez d’abord Protocole TEP , puis Protocole CT.
         REMARQUE : En règle générale, une tomodensitométrie standard est suffisante pour scanner le modèle de souris EAE. Une tomodensitométrie dure 1 min et est acquise avec un binning à 2 x 2 à une tension de 80 kVp, un courant de 150 μA et des projections de 720. Les images TDM sont reconstruites à l’aide d’un algorithme de Feldkamp modifié.
      2. Pour le protocole PET, choisissez un balayage statique de 10 à 15 minutes à 64 cuivres. Si cette analyse ne figure pas déjà dans la liste des protocoles disponibles, ajoutez-la en cliquant sur l’onglet Protocoles dans le menu Standard , Créer un nouveau protocole | Menu déroulant Isotopes . Si l’isotope souhaité n’est pas répertorié, cliquez sur Plus | Ajouter à partir de la bibliothèque et ajouter l’isotope souhaité. Définissez la durée de l’analyse, cliquez sur la case d’option pour l’analyse statique, nommez le protocole et cliquez sur Enregistrer.
      3. Revenez à l’onglet Études et continuez à nommer et à configurer toutes les analyses souhaitées pour la journée.
         REMARQUE : Il est recommandé de configurer également un « test de tomodensitométrie » en utilisant uniquement un scanner standard pour vérifier le positionnement du lit du premier balayage afin d’assurer un placement optimal. Il doit s’agir de la première analyse de l’étude.
4. Une fois que le scanner est prêt, anesthésiez les souris dans une boîte démontable pour les préparer à l’analyse.
   REMARQUE : À ce stade, les souris sont probablement très malades ; Il est préférable de minimiser le temps passé sous anesthésie.
   1. Appliquez un gel pour les yeux.
5. Assurez-vous que le plateau de numérisation à quatre souris est équipé d’éléments chauffants, tels que des coussins chauffants ou de l’air chauffé, avec l’isoflurane réglé sur 1,5 % à 2 % et le coussin chauffant allumé (Figure 3). Placez les souris en décubitus dorsal sur le lit de numérisation.
   1. Au fur et à mesure que la maladie EAE progresse, la colonne vertébrale de la souris devient sévèrement courbée. Scannez les souris pendant qu’elles sont sur le dos pour redresser la colonne vertébrale autant que possible, améliorant ainsi l’analyse en aval. Tirez doucement sur la queue de la souris pour aider à redresser la colonne vertébrale.
6. Une fois en position couchée, fixez solidement chaque souris avec du ruban adhésif souple pour microscope. Utilisez une bande de ruban adhésif sur la tête et une autre doucement sur le ventre pour minimiser les mouvements dus à la respiration.
   1. Enregistrez dans un cahier de laboratoire quelle souris se trouve dans quelle position de numérisation.
7. Une fois les souris sécurisées, retournez à l’ordinateur de numérisation pour faire fonctionner le scanner.
8. Ouvrez le menu Contrôleur de mouvement . Cliquez sur le champ de vision du centre PET pour déplacer les souris sur le lit de numérisation dans l’anneau PET. Pour le premier scan de la journée, cliquez sur CT Center FOV. Une fois en position, exécutez le test CT pour vous assurer que la position est correcte ; Répétez l’opération jusqu’à ce que la position du lit soit satisfaisante.
   1. Placez un petit morceau de ruban adhésif blanc sur le lit de numérisation pour marquer l’emplacement correct du lit pour le reste de l’étude.
9. Une fois que le lit est en place pour la TEP, lancez la séquence de balayage en cliquant sur Exécuter.
   1. Attendez que le scanner passe automatiquement de l’anneau PET au scanner.
   2. Vérifiez toujours visuellement si les animaux se sont déplacés dans la bonne position pour la TEP et la TDM.
   3. Enregistrez l’heure de début de l’analyse dans un cahier de laboratoire pour corriger la décroissance de la dose injectée pendant l’analyse des données.
10. Une fois la numérisation terminée, laissez l’image se reconstruire. Vérifiez les données avant de retirer les animaux.
    REMARQUE : La reconstruction OSEM (Expectation Expectation-Maximization) ordonnée en 3D prendra environ 5 minutes pour un balayage statique.
11. Vérifiez visuellement et approuvez les données, en utilisant la rate comme témoin positif, car ce tissu contient un grand nombre de lymphocytes B. Retirez les animaux du lit d’analyse et placez-les dans une boîte de démolition remplie d’isoflurane en vue de la perfusion et de la dissection subséquente.
12. Répétez les étapes 6.5 à 6.12 pour les souris restantes de l’étude.
13. Lorsque toutes les souris sont scannées ou lors de l’analyse d’un groupe qui a une place libre dans le lit de numérisation, scannez l’étalon préparé à l’étape 4.6.

7. Dissection pour comptage gamma ex vivo et autoradiographie

1. Avant de disséquer, assurez-vous que tous les tubes de comptage gamma et de centrifugation ont été pré-pesés.
2. Pratiquer l’euthanasie par perfusion, comme décrit précédemment⁶, avec PBS et thoracotomie pendant que les souris sont anesthésiées en profondeur (inhalation continue d’isoflurane à 4 %, 2 L/min à 100 % d’O₂).
3. Pour enlever la moelle osseuse, coupez les deux fémurs au niveau du genou et du bassin. Assurez-vous que les deux têtes sont retirées du fémur.
   1. Placez les deux fémurs dans un tube à centrifuger de 0,5 mL percé d’un trou au fond (à l’aide d’une aiguille de 20 G) dont le couvercle est coupé.
   2. Placez le tube de 0,5 ml contenant les fémurs à l’intérieur d’un tube à centrifuger de 1,5 ml avec le couvercle coupé.
   3. Placez l’ensemble du tube dans une mini centrifugeuse. Essorez pendant 4 min à 4 500 × g.
      REMARQUE : La moelle osseuse doit être délogée par le trou du tube à centrifuger de 0,5 mL et se déposer au fond du tube à centrifuger de 1,5 mL.
      1. Séparez les tubes. Peser les fémurs vides dans le tube à centrifuger de 0,5 ml. Peser la moelle osseuse dans le tube à centrifuger de 1,5 ml. Placez chaque tube à centrifuger dans des tubes de comptage gamma.
4. Retirez le cerveau à l’aide d’une pince et de ciseaux, en prenant soin de garder le tronc cérébral intact. Placez le cerveau dans un tube de comptage gamma. Enregistrez le poids sec, rincez avec PBS et gardez sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à compter.
5. Pour retirer la moelle épinière, effectuez les opérations suivantes.
   1. Retirez la peau et la fourrure en faisant une incision sur la face dorsale de l’animal pour exposer la colonne vertébrale (figure 1).
   2. Séparez les régions lombaires (L) des régions cervicales (C) et thoracique en coupant le long de trois plans transversaux autour et à travers la colonne vertébrale : à la base du cou (vertèbre C1) (Figure 1D, numéro 1) ; à la base de la cage thoracique (vertèbre L1) (Figure 1D, numéro 2) ; à la base du bassin (vertèbre L5) (Figure 1D, numéro 3).
   3. Coupez sous la cage thoracique (Figure 1D, numéro 2).
   4. Coupez directement au-dessus du sacrum pour séparer la région lombaire de la colonne vertébrale. Coupez soigneusement la colonne vertébrale à partir de l’extrémité pelvienne jusqu’à ce que la moelle épinière lombaire soit visible (Figure 1D, numéro 3). Coupez les tissus environnants pour isoler les régions lombaire et cervicale/thoracique de la colonne vertébrale (figure 1D, numéros 4 et 5).
   5. Pour expulser la moelle épinière, utilisez une seringue à embout coulissant (3 à 10 ml) remplie de PBS. Créez un joint entre la seringue et la colonne vertébrale à l’aide du pouce et de l’index.
      1. Poussez doucement le PBS à travers la seringue pour expulser la moelle épinière sur un tampon absorbant (Figure 1E) ; Répétez l’opération pour les deux régions de la colonne vertébrale. Placez les tissus de la moelle épinière dans un tube de comptage gamma.
      2. Enregistrez le poids sec et ajoutez du PBS pour vous assurer que le tissu est au fond du tube afin d’éviter qu’il ne se dessèche. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à compter.
      3. Expulser la moelle épinière cervicale/thoracique de l’extrémité crânienne et la moelle épinière lombaire de l’extrémité caudale de la colonne vertébrale (Figure 1E).

8. Comptage gamma ex vivo

1. Ouvrez le logiciel du compteur gamma. Accédez à la liste de travail et sélectionnez le protocole souhaité, par exemple un protocole de comptage de 30 s pour ⁶⁴Cu.
2. Préparez au moins trois étalons dans des tubes séparés. Exécutez-les maintenant pour les utiliser dans l’analyse (étape 10.2). Essayez de faire trois volumes et quantités d’activité répétés dans trois tubes distincts.
   REMARQUE : Un volume de 500 μL donne de bons résultats. Bien que l’activité soit déterminée par la machine utilisée, 10 μCi fonctionnent généralement bien.
3. Placez les étalons dans un rack étiqueté avec le code-barres correspondant au protocole souhaité à exécuter. Placez la grille sur le compteur gamma.
4. Après avoir enregistré les poids des orgues, placez les tubes contenant les organes sur la grille de comptage gamma après les tubes contenant les étalons.
   REMARQUE : Les organes d’intérêt pour ce modèle peuvent inclure les ganglions lymphatiques axiaux, le sang, la moelle osseuse, le cerveau, les ganglions lymphatiques cervicaux, le fémur, le cœur, le foie, la moelle épinière lombaire, les muscles, la rate, la queue et la moelle épinière cervicale/thoracique.
5. Placez une grille avec un code-barres d’arrêt à l’arrière du compteur gamma.
6. Appuyez sur le bouton Lecture de l’ordinateur. Si possible, n’appuyez pas sur Play tant qu’il n’y a pas plusieurs racks ou organes à exécuter pour permettre à tous les tubes d’être comptés en continu dans un seul fichier. Assurez-vous qu’un rack avec un code-barres d’arrêt se trouve à l’arrière du compteur gamma pour chaque passage.
7. Exécutez jusqu’à ce que tous les échantillons aient été comptés. Enregistrez et exportez le fichier.

9. Autoradiographie ex vivo (ARG) du tissu du SNC

1. Suivez les étapes précédemment publiées pour l’ARG du cerveau et de la moelle épinière (tout en excluant les étapes 2 à 6 décrites par Chaney et al., car les souris ont déjà reçu une injection de radiotraceur à partir de la TEP)⁶.
   REMARQUE : Des instructions spécifiques pour la préparation de la cassette ARG de la moelle épinière sont répertoriées ici⁶.
2. Une fois le comptage gamma terminé pour la moelle épinière lombaire et cervicale/thoracique, placez rapidement les tubes sur de la glace jusqu’à ce que tous les tissus du SNC aient été comptés.
   REMARQUE : Reportez-vous à la méthode publiée précédemment pour l’ARG du cerveau⁶.
3. Inclinez doucement les tubes pour permettre aux moelles épinières de tomber sur un tampon absorbant. Si la moelle épinière colle sur le côté du tube, rincez doucement avec du PBS froid et inclinez à nouveau le tube. Séchez soigneusement chaque moelle épinière en épongeant doucement avec un mouchoir en papier. Placez les moelles épinières séchées de manière organisée sur un morceau de papier noir épais.
   1. Étiquetez à côté de la moelle épinière avec un stylo blanc pour une identification facile.
   2. Laissez de l’espace dans les coins et au milieu du papier noir pour placer des piles de trois lames de microscope qui agissent comme des entretoises pour empêcher la compression de la moelle épinière lorsque la cassette ARG est fermée. Utilisez 5 à 7 piles.
4. Une fois que toutes les moelles lombaires et cervicales/thoraciques sont positionnées sur le papier noir et étiquetées, placez soigneusement le morceau de papier dans la cassette ARG. Placez la cassette ouverte sur un plateau de glace carbonique pour geler la moelle épinière.
5. Une fois congelé, placez délicatement une pellicule plastique entre l’écran de stockage du phosphore numérique et la moelle épinière et placez l’écran sur les échantillons. Fermez immédiatement la cassette et placez-la au congélateur à -20 °C pendant environ 10 demi-vies (~127 h).
6. Lorsque le temps d’exposition est terminé, numérisez le film à l’aide d’un imageur au phosphore. Analysez l’image numérique résultante (voir la section 12 pour les instructions).

10. Analyse des données de biodistribution

1. Mettre en place une feuille de calcul « Correction de dose » pour déterminer mathématiquement la correction temporelle de la désintégration radioactive, normalisant ainsi les doses de rayonnement et permettant des comparaisons entre les sujets.
   1. Corriger la carie de toutes les doses jusqu’au moment de l’injection, en tenant compte de l’activité résiduelle laissée dans la seringue et le cathéter après l’injection.
   2. À l’aide des étalons préparés à l’étape 8.2, faites la moyenne de la quantité d’activité (μCi) et du nombre normalisé par minute (CPM). Divisez le CPM moyen par la quantité moyenne d’activité standard pour obtenir le CPM/μCi.
      REMARQUE : Assurez-vous que la quantité d’activité de chaque étalon est corrigée en fonction de la décroissance au moment où le compteur gamma compte le CPM des étalons. Le compteur gamma doit normaliser toutes les valeurs de CPM à l’heure de début du protocole.
2. Configurez la feuille de calcul « Résultats » pour calculer le pourcentage final de dose injectée par gramme de tissu (% ID/g) pour chaque échantillon.
   1. Corriger la décroissance du CPM normalisé à partir du compteur gamma pour chaque échantillon compté jusqu’au moment de l’injection de l’animal.
      REMARQUE : La correction de la décroissance peut être effectuée à n’importe quel moment ; s’assurer que toutes les doses et les valeurs de CPM sont corrigées de la décroissance au même point de temps.
   2. Normalisez le CPM corrigé de la décroissance à la masse de chaque échantillon pour déterminer le CPM par échantillon. Calculez le CPM total injecté en soustrayant le CPM dans la queue du CPM injecté calculé.
      REMARQUE : La queue n’a pas besoin d’être corrigée en masse car cette valeur de CPM sera simplement soustraite du CPM total injecté pour tenir compte de tout traceur extraveineux de l’injection.
   3. Divisez le CPM par masse par le CPM total injecté pour calculer le %ID/g.
3. Configurez une feuille de calcul « Résumé » pour afficher les résultats finaux à saisir dans un logiciel graphique, puis à visualiser les données et à effectuer des analyses statistiques.

11. Analyse d’images TEP

1. Ouvrez le logiciel d’analyse TEP. lécher sur le fichier |Ouvrir les données locales | DICOM. Localisez le fichier souhaité (format DICOM). Ouvrez à la fois le PET et le CT.
2. Dans le gestionnaire de données, ajustez le contraste TEP et CT aux niveaux souhaités.
3. Enregistrez et recadrez des souris individuelles.
   1. Dans le menu Navigation , sélectionnez l’onglet Réorientation/Enregistrement .
   2. Allez dans le menu Rigide dans cet onglet. Désignez la tomodensitométrie (0) comme la tomodensitométrie fixe et la tomographie par émission de positons (1) comme la tomodensitométrie (1).
   3. Choisissez une transformation rigide et une qualité rapide . Cliquez sur S’inscrire.
   4. Une fois l’inscription terminée (5-10 min), cliquez sur la coche pour enregistrer l’inscription.
   5. Inspectez visuellement les données pour vous assurer que l’enregistrement a réussi. Exportez la session en cliquant sur Fichier | Séance | Exporter.
   6. Ensuite, recadrez chaque souris dans un recadrage complet du corps : allez dans le menu de navigation et cliquez sur Recadrage. Faites glisser les côtés de chaque coupe transversale du bord extérieur vers l’intérieur.
   7. Une fois que la souris souhaitée est bien recadrée, cliquez sur la coche et exportez la session à enregistrer.
   8. Ensuite, recadrez et redressez la tête de chaque souris pour l’analyse du cerveau à l’aide de la translation, des rotations et des retournements manuels dans le menu Enregistrement/Réorientation . Exportez pour enregistrer.
4. Analysez la moelle épinière.
   1. Pour commencer l’analyse des régions d’intérêt (ROI) dans la moelle épinière, ouvrez l’outil ROI 3D dans le menu de navigation .
   2. Sous l’en-tête ROI, utilisez le signe plus en bas du menu pour créer six ROI : ROI lombaire, ROI cervical/thoracique, Squelette lombaire, Squelette thoracique, Moelle épinière lombaire, Moelle épinière thoracique.
      REMARQUE : Les RCI lombaires et cervicaux/thoraciques sont des ROI généralisés de grande taille qui seront utilisés pour créer les ROI du squelette (Figure 4).
   3. Pour éviter les interférences visuelles du signal PET avec cette étape, cliquez sur F3 pour désactiver le PET.
   4. Accédez au haut de l’opérateur d’outil 3D ROI. Cliquez sur le point plein à droite du symbole du curseur pour ouvrir le menu Mode Peinture 3D et Éroder/Dilater .
   5. Sélectionnez Sphère et définissez la taille sur 20 pixels. Réglez Dilate sur +5.
      1. Avant de continuer, allez en bas du menu. Assurez-vous que le ROI lombaire est sélectionné, car il s’agit du premier ROI à être dessiné.
   6. Sur le scanner, trouvez la vertèbre L6 de la colonne vertébrale (là où la colonne vertébrale rencontre les hanches). En commençant par une vertèbre au-dessus de L6, dessinez un ROI lombaire approximatif sur les cinq vertèbres au-dessus des hanches (vertèbres L1-L5). Ensuite, passez au ROI cervical/thoracique et tracez le reste de la colonne vertébrale jusqu’à la base du crâne.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire que ce soit précis, car il est utilisé pour indiquer où le seuillage Otsu doit avoir lieu à l’étape 11.4.8.
   7. Après avoir dessiné les ROI généralisés, allez en haut de l’opérateur. Sélectionnez le menu Algorithmes de segmentation .
   8. Dans le menu déroulant, sélectionnez Otsu Thresholding. Pour l’entrée, sélectionnez Lumbar ROI. En bas du menu, assurez-vous que l’option Squelette lombaire est sélectionnée. Dans le menu déroulant à côté de Image, assurez-vous que la tomodensitométrie est sélectionnée et cliquez sur Appliquer. Répétez l’opération pour le ROI cervical/ thoracique et le squelette thoracique.
      1. Si le seuillage Otsu ne met pas suffisamment en évidence la colonne vertébrale, utilisez le seuillage global et remplacez la valeur Min par 350 et la valeur Max par 3 500 pour le seuillage manuel et ajustez-la si nécessaire pour isoler les vertèbres.
   9. Après avoir utilisé le seuillage Otsu pour créer les ROI squelettes, revenez au menu de navigation (icône du curseur). Supprimez ou cochez la colonne H (masquer) pour les ROI rugueux lombaires et cervicaux/thoraciques afin de les masquer. Cochez la colonne I (immuable) pour les deux ROI squelettes afin qu’ils ne puissent pas être modifiés.
   10. Enfin, revenez en haut de l’opérateur d’outil 3D ROI et accédez au menu Peinture 3D pour dessiner les ROI de la moelle épinière.
       1. Sélectionnez à nouveau l’outil Sphère et tracez la moelle épinière dans le squelette pour les zones lombaires et thoraciques, en veillant à ce que le retour sur investissement correct soit sélectionné en bas du menu.
       2. Pour effacer tout ROI, cliquez sur Commande/Contrôle et dessinez sur la partie à effacer.
       3. Vérifiez le ROI de la moelle épinière à partir des trois plans pour vous assurer qu’il n’y a pas de ROI tiré à l’extérieur de la colonne vertébrale.
5. Exportez les résultats de l’analyse de la moelle épinière.
   1. Si le signal PET a été désactivé à l’étape 11.4.3, appuyez sur F3 une fois que les ROI de la moelle épinière sont dessinés pour réactiver le TEP, ou sélectionnez le contrôleur visuel (VC) et cliquez sur la barre PET.
   2. Retournez dans le menu de navigation (icône en forme de curseur). Cliquez sur l’icône de la grille pour afficher le tableau. Copiez le tableau dans un tableur et enregistrez-le.
   3. Enfin, exportez le fichier dans un logiciel d’analyse TEP, comme décrit ci-dessus, pour enregistrer les ROI dessinés.
6. Analysez le cerveau à l’aide d’un atlas 3D semi-automatisé.
   1. Ouvrez le fichier de recadrage de la tête. Importez l’atlas du cerveau de la souris en accédant au menu Modules avancés et en sélectionnant l’outil Atlas du cerveau 3D. Assurez-vous que la référence est définie sur CT et que l’option de recadrage n’est pas cochée. Définissez un chemin d’accès pour le répertoire de sortie.
   2. Dans Paramètres avancés, remplacez Transformer par Versor-Affine. Conservez tous les autres paramètres par défaut. Cliquez sur Exécuter.
   3. Ajustez manuellement l’atlas dans le menu Réorientation/Enregistrement et utilisez la tomodensitométrie du crâne comme guide pour l’ajustement de l’atlas.
      1. Soyez très prudent si un détartrage est nécessaire, car cela peut affecter considérablement les volumes de la structure du cerveau. Cliquez sur la coche lorsque le réglage est terminé.
      2. Réexécutez l’atlas en sélectionnant l’option Importer des ROI 3D .
      3. Exportez le fichier pour enregistrer l’atlas adapté à la tête recadrée.
   4. Après avoir dessiné et exporté tous les ROI des organes souhaités, calculez une valeur de correction de liaison standard. Corrigez toutes les données et convertissez-les en %ID/g comme décrit précédemment⁶. Normaliser à l’organe qui convient au modèle animal, comme le cœur pour normaliser au radiotraceur présent dans le pool sanguin.

12. Analyse d’autoradiographie ex vivo

1. Ouvrez le fichier d’image numérique (.gel) à l’aide du logiciel d’analyse d’image. Ajustez la luminosité et le contraste au seuil souhaité. Appliquez une table de correspondance de couleur appropriée si vous le souhaitez.
   REMARQUE : Royal ou Grays sont recommandés pour faciliter la visualisation.

Representative Results

Le mAb hCD19 a été conjugué à la DOTA et radiomarqué avec ⁶⁴Cu, comme le montre la figure 2. Les EAE et les souris naïves ont subi une TEP/TDM (Figure 3) 18 à 24 h après l’injection de ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Les images TEP/TDM ont été co-enregistrées à l’aide du logiciel d’analyse TEP, et les tissus du SNC ont été analysés à l’aide de ROI manuels ou d’un atlas cérébral 3D semi-automatisé. La liaison des radiotraceurs dans les ROI (Figure 4) était plus élevée chez les souris EAE que chez les souris naïves. Le comptage gamma ex vivo et l’ARG ont montré une liaison accrue dans la moelle épinière (segments thoraciques lombaires et cervicaux) et le cerveau (ARG uniquement) des souris EAE par rapport aux souris naïves (Figure 5 et Figure 6). Le comptage gamma ex vivo de souris perfusées a également montré une diminution de la liaison des radiotraceurs dans les organes périphériques, y compris la rate, le fémur et la moelle osseuse (Figure 5), ce qui correspond au fait que les lymphocytes B quittent la périphérie et infiltrent le SNC dans ce modèle EAE.

Figure 2 : Schéma de conjugaison et de radiomarquage pour la génération de 64 anticorps monoclonaux CD19 spécifiques à l’homme, 16C4-TM mAb (⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb), en plus des données de contrôle ^dela qualité. (A) Réaction de l’ester DOTA-NHS avec l’anticorps monoclonal hCD19 pour produire le conjugué hCD19-DOTA (pas à l’échelle) et radiomarquage avec 64 Cu-CuCl₃ pour produire ⁶⁴anticorps monoclonaux Cu-DOTA-hCD19. (B) Chromatographe représentatif de l’ITLC. Le pic à 40-60 cm est l’anticorps radiomarqué ; ⁶⁴Cu-CuCl₃ non lié se déplace avec la phase mobile et serait présent de 200 à 240 cm. Il n’y a pas de ⁶⁴Cu-CuCl₃ libre détectable dans ce chromatographe. (C) Les spécifications de contrôle de la qualité de l’anticorps radiomarqué. Abréviations : ester DOTA-NHS = ester d’acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique mono-N-hydroxysuccinimide ; ITLC/HPLC = chromatographie instantanée sur couche mince/chromatographie liquide à haute performance ; MALDI/LC-MS = désorption/ionisation/chromatographie liquide assistée par laser matriciel-spectrométrie de masse ; CPM = nombre de points par minute. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Photographies montrant comment fixer des souris dans un lit imprimé en 3D à l’intérieur du scanner TEP pour permettre une imagerie de haute qualité de la moelle épinière et du cerveau tout en minimisant les mouvements. (A) Lit de scanner à quatre souris imprimé en 3D (également connu sous le nom d'« hôtel à souris ») équipé d’éléments chauffants et d’une tubulure d’anesthésie. (B) Souris anesthésiées en position couchée sur le dos pour maximiser la rectitude de la colonne vertébrale ; La position du lit de chaque souris est enregistrée. (C) Des souris collées solidement sur leur tête pour minimiser les mouvements dans le cerveau et sur le ventre pour minimiser les mouvements de la respiration, sans affecter la respiration. (D) Lit de souris positionné à l’intérieur du scanner et collé au lit de numérisation. La tubulure d’anesthésie a été connectée du scanner au lit et l’isoflurane a été réglé à 2 %. La respiration de la souris a été surveillée pour s’assurer que le niveau d’isoflurane était approprié avant de fermer la porte du scanner. Abréviation : TEP = tomographie par émission de positons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Image de la moelle épinière et analyse du cerveau et résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse TEP. (A) i) ROI (rose et feu) dessiné sur la colonne vertébrale pour séparer les vertèbres lombaires des vertèbres thoraciques et cervicales et préparer l’image pour le seuillage Otsu. ii) Les vertèbres vertébrales (turquoise et rouge) ont été segmentées à l’aide du seuillage Otsu. iii) Les vertèbres ont ensuite été rendues immuables dans le menu ROI 3D, et la moelle épinière divisée en ROI cervical/thoracique (violet) et lombaire (marine). iv) Le ROI vertébral a été supprimé, laissant les ROI de la moelle épinière et l’atlas représentatif du cerveau appliqués. (B) Analyse représentative des résultats de TEP de diverses régions du SNC représentées en % ID/g normalisés au ROI du cœur chez chaque animal. L’acquisition de la TEP a consisté en un balayage statique de 10 minutes par imagerie TEP/TDM. Régions cérébrales quantifiées à l’aide d’une approche semi-automatisée de l’atlas cérébral, illustrée dans le panneau A. iv) Les résultats représentatifs montrent soit une augmentation significative de la liaison des traceurs dans le cerveau et la moelle épinière thoracique, soit une tendance à une augmentation significative. Statistiques réalisées à l’aide du test t de Student (* : p < 0,0332). Abréviations : TEP = tomographie par émission de positons ; ROI = régions d’intérêt ; SNC = système nerveux central ; TDM = tomodensitométrie ; %ID/g = pourcentage de dose injectée par gramme de tissu ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Quantification représentative du comptage gamma ex vivo dans divers organes chez l’EAE et la souris naïve, exprimée en %ID/g. Après la TEP, des souris ont été perfusées avec du PBS pour éliminer le radiotraceur présent dans le sang, libre ou lié aux lymphocytes B CD19⁺ résidents dans le sang, et les organes ont été rapidement disséqués et pesés pour avoir un poids précis de chaque organe. La liaison du traceur est significativement diminuée dans la rate et la moelle osseuse chez les souris EAE par rapport aux souris naïves. Une augmentation de la liaison des radiotraceurs est observée dans les segments de la moelle épinière lombaire et cervicale/thoracique des souris EAE. Le cerveau ne montre pas d’augmentation significative du signal radiotraceur, bien qu’il ait tendance à augmenter de manière significative. Statistiques réalisées à l’aide du test t de Student (* : p < 0,0332 ; **** : p < 0,0001). Abréviations : TEP = tomographie par émission de positons ; %ID/g = pourcentage de dose injectée par gramme de tissu ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Les images ex vivo de l’ARG montrent la liaison de ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb dans des coupes cérébrales sagittales et des moelles épinières entières de l’EAE par rapport à des souris naïves. Les films numériques de stockage de phosphore ont été scannés à l’aide d’un imageur au phosphore après avoir été exposés à des échantillons de tissus radioactifs pendant environ 10 demi-vies (127 h ou 5 jours). Les images résultantes révèlent un signal visuellement plus élevé dans le cerveau des souris EAE par rapport aux coupes cérébrales des souris naïves, ce qui est attendu en raison des régions connues pour contenir des cellules B dans ce modèle⁵. Plus précisément, il y a une augmentation du signal de traceur dans le tronc cérébral, le cervelet et les ventricules des sections cérébrales de souris EAE. Cette augmentation du signal pour les coupes cérébrales de souris EAE reflète ce qui a été trouvé dans la quantification TEP du cerveau entier détaillée ci-dessus. De même, il y a une augmentation de la liaison des radiotraceurs dans les segments cervicaux/thoraciques et lombaires de la moelle épinière par rapport aux moelles épinières naïves, ce qui reflète ce qui a été trouvé en utilisant le comptage gamma ex vivo. Abréviations : TEP = tomographie par émission de positons ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; Évent = ventricules ; Cb = cervelet ; BS = tronc cérébral ; TSc = moelle épinière thoracique et cervicale combinée ; LSc = moelle épinière lombaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Coloration des tissus du SNC des tissus cérébraux de souris naïves et EAE avec CD45R/B220. Les lymphocytes B sont observés dans le tronc cérébral, les méninges et la substance blanche des souris EAE (n = 7 EAE, n = 5 souris naïves, en moyenne quatre tranches par animal). Ce chiffre est tiré de ⁵. Barres d’échelle = 5 mm (faible grossissement [1x]) dans les images cérébrales sagittales, 100 μm (fort grossissement [20x]) dans le tronc cérébral, les méninges et la substance blanche cérébelleuse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cet article décrit une méthode simplifiée d’imagerie des lymphocytes B CD19⁺ humains dans un modèle murin de SEP à l’aide de CD19-PET. En raison de la présentation hétérogène de la SEP et des réponses variables aux traitements, sa prise en charge en clinique peut être difficile et de nouvelles approches pour la sélection et le suivi des thérapies sont grandement nécessaires. L’imagerie TEP pourrait servir d’outil puissant pour surveiller la progression de la maladie et la réponse individuelle au traitement d’appauvrissement des cellules B. En plus de la SEP, l’imagerie TEP-CD19 pourrait être utilisée pour surveiller l’épuisement des lymphocytes B après le traitement de sous-types de lymphomes et de leucémies ou d’autres maladies à médiation par les lymphocytes B. Ce protocole et des données représentatives montrent l’utilité de l’imagerie des lymphocytes B dans les maladies neurologiques.

Pour étudier les lymphocytes B CD19⁺ humains dans le contexte de la SEP, nous avons choisi^{le modèle 7} de l’EAE MOG_1-125 dépendant des lymphocytes B. Semblable à d’autres modèles EAE, ce modèle présente des symptômes de paralysie progressive et d’infiltration de cellules immunitaires dans le SNC. Cependant, le modèle MOG_1-125 est unique en ce sens qu’il s’agit d’un modèle piloté par les cellules B : les souris contiennent un nombre variable de cellules B dans l’espace sous-arachnoïdien des méninges, du tronc cérébral, du parenchyme et des ventricules. Ces lymphocytes peuvent être dispersés dans ces régions et/ou former des structures de type follicule, qui sont également observées chez les humains atteints de SEP ^8,9. En plus d’utiliser des souris naïves comme témoins, il est possible d’utiliser un kit d’induction complet contenant uniquement un adjuvant de Freund (CFA) (c’est-à-dire une émulsion d’induction identique à celle administrée aux souris EAE sans la protéine MOG). Dans le modèle murin EAE, la barrière hémato-encéphalique (BHE) est dysfonctionnelle et permet à des entités plus grandes, telles que les anticorps, de se croiser. Le radiotraceur CD19-mAb ne se liera et ne restera dans le SNC que si des lymphocytes B sont présents ; le traceur circulera à nouveau dans le pool sanguin si les lymphocytes B ne sont pas présents. Nous l’avons démontré en utilisant le comptage gamma et l’autoradiographie ex vivo des tissus du SNC par perfusion avant de mesurer les niveaux de radioactivité dans les tissus. Nous l’avons également démontré dans des publications antérieures faisant état de l’utilisation de radiotraceurs TEP à base d’ORPC (c’est-à-dire des approches d’imagerie immunoTEP) pour détecter les lymphocytes B dans le SNC ^1,2.

Le chélateur DOTA a été utilisé depuis qu’il a été utilisé dans l’imagerie clinique TEP avec des peptides et des anticorps marqués au cuivre-64, et nous visons à traduire le hCD19-mAb pour l’imagerie clinique des patients atteints de SEP. DOTA a une affinité de liaison adéquate avec le cuivre-64 in vivo. La stabilité in vivo est très importante car le ⁶⁴Cu libre va au foie et peut obscurcir le signal du radiotraceur lié ; Ainsi, il est important de mesurer le signal dans le foie pour calculer le signal relatif par rapport à d’autres organes. Le muscle est généralement pris comme tissu témoin, mais dans le cas de l’EAE, il peut y avoir une inflammation présente dans les muscles. La demi-vie de ⁶⁴Cu est de 12,7 h, ce qui laisse suffisamment de temps au DOTA-hCD19-mAb pour se lier à sa cible tout en garantissant que le signal peut être mesuré par TEP. Lors de la préparation du conjugué, des réactions d’essai à petite échelle (75-125 μg) doivent être effectuées pour déterminer la quantité de DOTA à ajouter aux anticorps monoclonaux pour produire le rapport DOTA/anticorps monoclonaux souhaité (par exemple, une réaction de 6 à 10 fois plus d’ester DOTA-NHS par mAb molaire peut donner un conjugué de 1 à 2 anticorps monoclonaux à base de DOTA/anticorps monoclonaux). Le temps de réaction et la température (par exemple, 2-4 h ou la nuit à 4 °C ou à température ambiante) influencent également le rapport DOTA/mAb et doivent être optimisés. Un titrage avec du cuivre non radioactif peut être effectué pour calculer le nombre de DOTA par mAb ; cependant, nous recommandons d’effectuer une MALDI-MS et/ou une LC-MS pour obtenir des résultats plus fiables et plus précis.

Le ratio DOTA/mAb calculé est une valeur moyenne pour un échantillon particulier et une certaine variation est attendue. Pour MALDI, plusieurs injections sont effectuées par échantillon pour les anticorps monoclonaux conjugués et non conjugués. Nous calculons ensuite le rapport entre le conjugué et le non conjugué pour déterminer le nombre moyen de DOTA/mAb. Le rapport DOTA/anticorps monoclonaux est important car un trop grand nombre de chélateurs perturbera la liaison aux anticorps et un nombre insuffisant entraînera un radiomarquage incohérent et un signal faible. Le rapport doit être très serré entre les lots de conjugués pour maintenir une intensité du signal et une cinétique de liaison constantes ; Idéalement, le même lot de conjugué devrait être utilisé pour toutes les expériences d’une étude particulière. Une technique prometteuse pour réduire les effets potentiels sur l’immunoréactivité dus à une éventuelle surconjugaison consiste à utiliser la conjugaison spécifique au site¹⁰ , dans laquelle la conjugaison chélatrice est sélective sur les glycanes à chaîne lourde de l’anticorps, garantissant ainsi l’ajout de 1 chélateur par anticorps monoclonal.

Les conditions de réaction de radiomarquage doivent être optimisées pour assurer l’efficacité et le rendement de marquage les plus élevés, car les différences d’anticorps, de rapport DOTA/mAb et d’activité molaire de ⁶⁴Cu, entre autres conditions, auront un impact sur le radiomarquage. L’utilisation du rapport conjugué optimal de ⁶⁴Cu/mAb peut permettre d’utiliser le radiotraceur sans purification, ce qui réduit le temps nécessaire au radiomarquage et les pertes dues à la colonne d’écoulement gravitaire et à la désintégration radioactive. Une activité molaire cohérente et fiable peut également être obtenue lorsque le même rapport conjugué ⁶⁴Cu/mAb est utilisé, ce qui est particulièrement important lors de la comparaison des résultats de plusieurs cohortes de souris ou d’études d’imagerie. Les conditions ITLC peuvent également être modifiées pour convenir à chaque utilisateur. Si une purification est nécessaire, une aliquote doit être conservée pour la spectrophotométrie HPLC et/ou UV/Vis afin que l’activité molaire puisse être calculée.

Il est important de noter que l’utilisation d’anticorps radiomarqués pour l’imagerie peut être difficile. Il est essentiel que l’anticorps utilisé pour le radiotraceur soit biologiquement inerte afin de ne pas avoir d’effet physiologique. De plus, étant donné que les anticorps ont une longue résidence dans le sang, il faut attendre suffisamment longtemps pour la circulation, la liaison et la clairance d’un anticorps monoclonal donné pour assurer un signal de fond approprié sans compromettre la qualité de l’image. En règle générale, il suffit d’attendre 20 à 48 h pour obtenir un anticorps monoclonal marqué au Cu 64, mais il faut prendre une image 2, 4, 6, 12, ²⁴ou 48 h après l’injection lors de l’évaluation d’un nouveau traceur TEP anticorps monoclonal afin de déterminer le meilleur moment pour l’imagerie dans un modèle de rongeur donné. Il en va de même pour l’acquisition d’images ARG avec le rapport signal/bruit de fond le plus élevé. Les images représentatives de ce protocole ont été prises 18 à 20 h après l’injection, bien que d’autres points temporels puissent être utilisés en fonction du radio-isotope utilisé. Différents anticorps se liant à différents épitopes de CD19 produiront des résultats variables et doivent être rigoureusement caractérisés.

Lors de l’analyse du signal de la moelle épinière, il est important de positionner les souris sur le dos dans le lit de balayage pour réduire les mouvements causés par la respiration. De plus, le placement en décubitus dorsal peut aider à redresser la colonne vertébrale chez les souris qui ont une courbure accrue de la colonne vertébrale en raison de la progression de la maladie EAE. Un autre aspect important à prendre en compte lorsque l’on cherche à détecter un signal dans la colonne vertébrale et la moelle épinière est d’éviter d’injecter MOG_1-125 sur le flanc, car les sites d’injection peuvent lier le traceur en raison de la réponse immunitaire associée dans ces zones. La proximité du site d’injection peut interférer avec l’analyse de la moelle épinière ; Ainsi, les injections dans le thorax sont préférables pour l’application décrite ici.

Les techniques d’analyse d’images utilisées sont spécifiques à l’imagerie du SNC. Un outil d’atlas cérébral intégré au logiciel d’analyse d’images permet d’obtenir des résultats reproductibles et fiables tant que l’enregistrement de la TEP et de la TDM est précis. L’utilisation de l’atlas cérébral 3D semi-automatisé et son ajustement pour qu’il s’adapte au crâne de chaque souris permettent d’obtenir des retours sur investissement cohérents entre les animaux. Étant donné qu’il n’existe actuellement aucune approche automatisée ou semi-automatisée pour analyser le signal dans la moelle épinière, des ROI manuels doivent être établis. Notamment, lors de la quantification des lymphocytes B CD19⁺ (ou de tout type de cellule présent à la fois dans la moelle osseuse et la moelle épinière), il est essentiel d’éliminer autant que possible le signal provenant de la colonne vertébrale et de la moelle osseuse. La raison en est que les souris naïves sont connues pour contenir plus de lymphocytes B CD19⁺ dans leur moelle osseuse que les souris EAE, chez lesquelles les lymphocytes B quittent la périphérie pour infiltrer le SNC ^5,11. Ce signal de la moelle osseuse peut obscurcir le véritable signal dans la moelle épinière.

Pour délimiter le signal réel de la moelle épinière tout en minimisant la contribution du signal de la colonne vertébrale et de la moelle osseuse, le seuillage Otsu de l’image CT peut être utilisé pour obtenir un retour sur investissement immuable pour la colonne vertébrale. Un ROI séparé de la moelle épinière peut alors être facilement dessiné dans la colonne vertébrale. La même technique peut également être appliquée pour mesurer la moelle osseuse dans le fémur. Il s’agit d’une méthode très utile pour mieux comprendre la liaison du traceur dans la moelle épinière. Cependant, en raison de la résolution spatiale relativement faible de la TEP et des problèmes liés à l’effet de volume partiel lors du balayage de petites régions anatomiques de souris, l’utilisation de techniques de confirmation ex vivo supplémentaires (par exemple, le comptage gamma, ARG) permet de valider la liaison des radiotraceurs dans la moelle épinière sans la présence de sang, de liquide céphalo-rachidien ou de signal de débordement de la colonne vertébrale.

Le signal dans la moelle épinière cervicale/thoracique a tendance à varier chez les souris EAE en fonction de la gravité de la maladie et du nombre de lymphocytes B qui s’infiltrent au cours de la réponse immunitaire adaptative. Cette variation du nombre de lymphocytes B qui s’infiltrent, ainsi que la faible quantité de lymphocytes B dans le SNC par rapport à ceux de la moelle osseuse pelvienne/spinale de souris naïves, peuvent rendre difficile la quantification in vivo du tissu de la moelle épinière chez la souris. Compte tenu de la résolution spatiale de la TEP dans l’imagerie des petits animaux, le signal de la moelle osseuse peut se répercuter sur le signal de la moelle épinière. La biodistribution ex vivo et l’autoradiographie réalisées ici aident à valider le signal TEP des vertèbres par rapport au tissu de la moelle épinière. Les souris sont perfusées avant la dissection pour éliminer tout traceur non lié dans la piscine de sang afin que les résultats de la numération gamma et de l’autoradiographie reflètent le traceur qui est réellement lié dans chaque organe plutôt que le traceur qui se trouve dans la piscine de sang de cet organe.

Les radiotraceurs circulent dans le sang, et avec les traceurs d’anticorps, en particulier, il y a souvent un radiotraceur non lié présent dans le sang pendant des semaines après l’injection initiale. Étant donné que nous imageons le cerveau et la moelle épinière, qui ont de nombreux vaisseaux sanguins, il est important de comprendre quelle partie du signal est vraiment due à la liaison du traceur dans le cerveau/tissu d’intérêt par rapport à celle présente dans le pool sanguin. Il est donc nécessaire de diviser le signal cérébral par signal dans le pool cœur/sang. En milieu clinique, les mêmes techniques d’analyse d’images que le seuillage Otsu des vertèbres et les ROI des tissus de la moelle épinière peuvent être utilisées pour la quantification. Compte tenu des volumes de tissus plus importants chez l’homme que chez la souris, il devrait y avoir beaucoup moins d’impact des effets de volume partiel, ce qui améliorerait la précision et annulerait le besoin de techniques ex vivo pour confirmer les résultats in vivo . L’utilisation de la TEP en clinique permettra aux cliniciens de personnaliser le traitement pour chaque patient en fonction de sa charge individuelle en lymphocytes B.

L’ARG est particulièrement utile pour l’acquisition d’images à haute résolution afin de permettre une délimitation plus précise de l’emplacement spatial de la liaison du traceur dans de petites régions telles que le tronc cérébral et le cervelet. Les mêmes sections et/ou les sections adjacentes peuvent être conservées pour les colorations immunohistochimiques afin de confirmer la présence de lymphocytes B. Nous avons précédemment coloré les tissus du SNC avec CD45R/B220 (Figure supplémentaire S1) pour corréler le nombre de lymphocytes B avec le signal TEP et ARG ^5,9. La coloration peut ensuite être comparée spatialement aux résultats de l’ARG pour vérifier que le signal du radiotraceur correspond au motif de coloration. Les lymphocytes B peuvent être présents en grappes ou de manière diffuse dans tout le tronc cérébral ; La sensibilité TEP est suffisamment élevée pour mesurer le signal, ce qui est encourageant pour la traduction clinique. Dans le cas de l’ARG de la moelle épinière, l’ablation de la moelle épinière des vertèbres garantit que le signal mesuré est dû à la liaison du traceur dans le tissu de la moelle épinière plutôt que dans la moelle osseuse et/ou le sang, ce qui peut obscurcir les images TEP en raison d’effets de volume partiel.

À l’instar de l’ARG, le comptage gamma ex vivo permet de quantifier le signal radioactif dans des organes individuels. Pour cette technique particulière, il est important de mesurer le poids humide des tissus et de s’assurer qu’ils sont au fond de leurs tubes respectifs avant de placer les tubes dans le compteur gamma. Les tubes doivent être étiquetés avec le numéro de la souris et le tissu, afin que le bon tube soit utilisé ; Le tube est ensuite pesé sur une balance calibrée et les organes sont insérés au dixième de microgramme (0,0001 mg) près. Certains tissus sont extrêmement petits et la différence de masse du tube avant et après sera de l’ordre de 0,0001 mg. Les tissus doivent être pesés immédiatement après la dissection pour éviter la perte d’humidité, ce qui entraîne une masse plus faible. Après la pesée, les tubes du cerveau et de la moelle épinière doivent être remplis de PBS pour éviter qu’ils ne sèchent avant de congeler ces tissus pour l’ARG.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter	MiliporeSigma	UFC505008	centrifugal filter
64Cu-CuCl3	Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner	Eckert & Ziegler	AR-2000
Autoradiography cassette	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film	GE Life Sciences	28-9564-78	Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only
Butterfly Needle Catheter	SAI Infusion Technologies	BLF-24
DOTA-NHS-ester	Macrocyclics	B-280
EAE Induction Kit	Hooke Laboratories	EK-2160
Geiger Counter	Ludlum	14C
GNEXT PET/CT Scanner	Sofie	GNEXT
Hidex Automatic Gamma Counter	Hidex	AMG
HPLC Column	Phenomenex	00H-2146-K0	5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm
Illustra NAP-5 column	Cytiva	17085301	DNA gravity column
Image J	NIH		ARG analysis software
Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	PI90410
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Scientific	840281400	UV-Vis micro/nano-spectrophotometer
PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade	Eppendorf	30124707
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
VivoQuant	Invicro	Version 4 Patch 3	PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	PI89882	Desalting column