Summary
Denna artikel beskriver metodik för radiomärkning av en humanspecifik anti-CD19 monoklonal antikropp och hur man använder den för att kvantifiera B-celler i centrala nervsystemet och perifera vävnader i en musmodell av multipel skleros med hjälp av in vivo PET-avbildning, ex vivo gammaräkning och autoradiografimetoder.
Abstract
Multipel skleros (MS) är den vanligaste demyeliniserande sjukdomen i centrala nervsystemet (CNS) som drabbar unga vuxna, vilket ofta leder till neurologiska brister och funktionshinder när sjukdomen fortskrider. B-lymfocyter spelar en komplex och kritisk roll i MS-patologi och är målet för flera terapier i kliniska prövningar. För närvarande finns det inget sätt att exakt välja ut patienter för specifika anti-B-cellsterapier eller att icke-invasivt kvantifiera effekterna av dessa behandlingar på B-cellsbelastningen i CNS och perifera organ. Positronemissionstomografi (PET) har en enorm potential att ge mycket specifik, kvantitativ information om den spatiotemporala fördelningen och bördan av B-celler in vivo hos levande försökspersoner.
Denna artikel rapporterar metoder för att syntetisera och använda ett PET-spårämne specifikt för humana CD19+ B-celler i en väletablerad B-cellsdriven musmodell av MS, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), som induceras med humant rekombinant myelinoligodendrocytglykoprotein 1-125. Här beskrivs optimerade tekniker för att detektera och kvantifiera CD19+ B-celler i hjärnan och ryggmärgen med hjälp av PET-avbildning in vivo . Dessutom rapporterar denna artikel strömlinjeformade metoder för ex vivo gammaräkning av sjukdomsrelevanta organ, inklusive benmärg, ryggmärg och mjälte, tillsammans med högupplöst autoradiografi av CD19-spårämnesbindning i CNS-vävnader.
Introduction
MS är en immunmedierad neurologisk sjukdom; Den unika presentationen hos varje patient kan göra hanteringen utmanande för både patienter och kliniker1. Själva sjukdomen kännetecknas av förekomst av demyeliniserande lesioner och infiltration av immunceller i hjärnan och ryggmärgen, vilket resulterar i fysisk och kognitiv försämring2. Det traditionella paradigmet att MS är en T-cellsmedierad sjukdom utmanades först i en banbrytande klinisk fas II-studie av rituximab3, en behandling som riktar sig mot CD20+ -undergruppen av B-celler. Ytterligare B-cellsterapier har sedan dess utvecklats som riktar sig mot CD194, en pan B-cellsbiomarkör som uttrycks på ett bredare spektrum av B-celler, vilket kan vara både diagnostiskt och terapeutiskt fördelaktigt. Dessutom ger befintliga metoder för att bedöma behandlingseffekten (dvs. övervakning av antalet skov och magnetisk resonanstomografi [MRT]-aktivitet) inte tidiga mått på svar, vilket utsätter patienter för betydande risk för CNS-skador på grund av suboptimalt val och optimering av behandling. Därför finns det ett kritiskt behov av strategier för att övervaka specifika immunceller, såsom CD19+ B-celler, i realtid i CNS och periferin hos MS-patienter.
PET-avbildning är en robust avbildningsteknik som möjliggör in vivo-visualisering av hela kroppen av ett givet mål av intresse, såsom CD19. Medan blodprover, register över återfallsfrekvenser och lesionsövervakning via MRT ger ögonblicksbilder av behandlingens effektivitet, kan PET-avbildning göra det möjligt för forskare och kliniker att övervaka effektiviteten av en behandling i hela kroppen. Detta proaktiva tillvägagångssätt för terapeutisk övervakning gör det möjligt för läkare att bedöma läkemedelseffektiviteten i realtid, vilket möjliggör snabba justeringar efter behov. Övervakning av placering och täthet av cellpopulationer associerade med sjukdom möjliggör också longitudinell bedömning av svårighetsgrad med hjälp av patientspecifik anatomisk information. Det är därför viktigt att etablera reproducerbara analysmetoder för att på ett tillförlitligt sätt utnyttja den fulla potentialen av PET-avbildning i kliniska och prekliniska miljöer.
Denna artikel beskriver metoder (figur 1) för att utföra PET-avbildning, ex vivo gammaräkning och autoradiografi (ARG) av CD19+ B-celler med en 64 Cu-märkt anti-human CD19 monoklonal antikropp (mAb), känd som 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), i den experimentella autoimmuna encefalomyelitmusmodellen (EAE) av MS inducerad i transgena möss som uttrycker human CD19 (hCD19) med användning av humant rekombinant myelinoligodendrocytglykoprotein 1-125 (MOG1-125). Vi tillhandahåller också metoder för att bedöma radiotracerbindning exakt och reproducerbart i hjärnan och ryggmärgen, båda kritiska platser för patogenes som ofta påverkas allvarligt i denna och andra neurodegenerativa modeller. Dessa tekniker möjliggör icke-invasiv undersökning av B-cellers roll i sjukdomspatologi och har potential att översättas kliniskt för att bedöma effekten av anti-B-cellsterapier vid MS.
Protocol
Figur 1: Studiedesign. En översikt över viktiga tekniker i den här artikeln. (A) Att placera mössen i skanningsbädden på rygg minskar rörelsen i ryggraden. B) PET/CT-avbildning av mössen. C) Gör ett snitt längs djurets ryggsida för att exponera ryggraden. D) Dela ryggraden i hals-/bröstkorgs- och ländryggsdelar och ta bort sektionerna efter de fem angivna snitten. E) Använd en spruta för att avlägsna ryggmärgen från ryggraden genom att göra en försegling med sprutan och ryggraden och spola ut från kranial- och stjärtändarna av ryggraden enligt bilden. F) Isolerade segment av hals-/bröstkorgs- och ländryggsryggmärg. Förkortning: PET/CT = Positronemissionstomografi/datortomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Alla djurstudier utfördes i enlighet med Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) vid Stanford University, ett program ackrediterat av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Mössen acklimatiserades till vivarium i minst 7 dagar före studiestart för att minimera stressen på mössen, eftersom stress kan påverka EAE-induktionen.
1. EAE-induktion hos honhumaniserade CD19-möss
- Inducera humaniserade CD19 C57BL/6J honmöss i åldern 9-13 veckor med EAE som tidigare beskrivits5 med MOG1-125.
2. Djurvård och poängsättning i EAE-musmodell
- Poängsätt sjukdomsprogression och vård av mössen som tidigare beskrivits5. I korthet, poängsätt denna modell på en skala från 1-5 enligt följande: 1 är svanssvaghet/slapphet, 2 är försvagade bakben, 3 är bakbensförlamning, 4 är bakbensförlamning med frambenssvaghet, 5 är döende.
3. mAb-konjugering, radiomärkning och karakterisering
- Konjugera den bifunktionella kelatorn 1,4,7,10-tetraazacykloddodekan-1,4,7,10-tetraättiksyramono-N-hydroxisuccinimidester (DOTA-NHS-ester) till hCD19-mAb till radiomärkning med 64Cu.
- Använd en avsaltningskolonn och byt ut lagringsbufferten hCD19-mAb mot HEPES-buffert (pH 8,5-9): konditionera avsaltningskolonnen/avsaltningskolonnerna med HEPES. Beräkna antalet kolonner som behövs baserat på avsaltning av kolonnprovvolymkapacitet och volym mAb som krävs: 0,5 ml rör: 30-130 μL provvolym, 300 μL tvätt; 2 ml rör: 200-700 μL provvolym, 1 ml tvätt.
- Kyl centrifugen till 4 °C för buffertutbyte via avsaltningskolonnen.
- Ta ut avsaltningskolonnen ur kylen. Ta bort botten av avsaltningskolonnen, lossa locket och placera kolonnen i ett uppsamlingsrör.
- Centrifugera vid 1 500 × g i 2 minuter för att avlägsna lagringslösningen; Kassera genomströmningen som innehåller förvaringslösningen och återanvänd uppsamlingsröret. Markera en linje på kolonnen där den högsta punkten på det avsaltningskomprimerade hartset lutar uppåt.
- Tillsätt HEPES-buffert på undersidan av avsaltningskolonnen. Placera avsaltningskolonnen i centrifugen med ledningen vänd utåt; Centrifugera med 1 500 × g i 2 minuter. Kassera genomströmningen och återanvänd uppsamlingsröret.
- Upprepa steg 3.1.4 och 3.1.5 2 gånger med samma uppsamlingsrör och kassera genomströmningen mellan stegen.
- Placera den konditionerade avsaltningskolonnen i ett nytt uppsamlingsrör och märk; detta rör kommer att innehålla hCD19-mAb.
- Tillsätt hCD19-mAb till toppen av den konditionerade avsaltningskolonnen/avsaltningskolonnerna och använd HEPES-buffert för att skölja den tomma mAb-injektionsflaskan. Lägg till detta högst upp på avsaltningskolonnen (total volym enligt tillverkarens rekommendation). Centrifugera med 1 500 × g i 2 minuter för att eluera hCD19-mAb. Behåll genomströmningen som innehåller hCD19-mAb.
- Mät koncentrationen av hCD19-mAb med en UV/Vis-spektrofotometer och justera till 0,5 μg/μL med HEPES-buffert vid behov.
- Tillsätt 1/50 av volymen av mAb-lösningen på 0,5 M EDTA till hCD19-mAb-lösningen för att göra den slutliga koncentrationenav EDTA 0,01 M i hCD19-mAb-lösningen. Låt hCD19-mAb-EDTA-lösningen stå i rumstemperatur i 15 minuter.
- Ta ut DOTA-NHS-estern ur frysen och låt den bli rumstempererad (10-15 min). Beräkna volymen DMSO som ska tillsättas till DOTA-NHS-estern för att göra en DOTA-koncentration som möjliggör tillsats av det önskade DOTA/mAb-molförhållandet (som vanligtvis är i storleksordningen 1-2 DOTA/mAb).
OBS: Volymen DMSO-DOTA-NHS-ester som tillsätts till hCD19-mAb bör inte överstiga 10 % av mAb-volymen. Detta bör göras med hjälp av ett kalkylblad så att det kan göras snabbt och upprepade gånger. - Baserat på det önskade förhållandet mellan DOTA och hCD19-mAb, beräkna mängden DOTA-NHS-ester som ska läggas till hCD19-mAb.
nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/ml DOTA/dmso → ml DMSO → spädningsfaktor för DOTA/DMSO-lösning - Väg upp 1-2 mg DOTA-NHS-estern och tillsätt försiktigt rätt volym (beräknad i steg 3.1.11) DMSO till DOTA-NHS-estern. Blanda och snurra ner.
- Pipettera den beräknade volymen av DOTA-NHS-esterlösningen (steg 3.1.12) till hCD19-mAb-lösningen. torka av utsidan av pipettspetsen före tillsats för att säkerställa att extra DOTA-NHS-ester inte tillsätts (utan att ändra mängden i pipetten). Blanda försiktigt och snurra ner.
- Ställ in i kylen (4 °C) för att reagera över natten (12-16 h).
- Rening och koncentrering
- Kyl centrifugen till 4 °C för buffertutbytesstegen i centrifugalkoncentratorn. placera ett PCR-rörblock av metall på torris för att snäppfrysa konjugatet.
- Ta bort DOTA-hCD19-mAb-reaktionen från kylen och släck genom att tillsätta TRIS-buffert av biologisk kvalitet: 10 % av den totala reaktionsvolymen. Ta bort 10–20 μg av provet för masspektrometrianalys.
- Konditionera avsaltningskolonnen/avsaltningskolonnerna enligt beskrivningen ovan (steg 3.1.1–3.1.5) med 0,1 M ammoniumacetatbuffert, pH 5,5.
- Buffertbyt ut DOTA-hCD19-mAb-lösningen mot ammoniumacetat (steg 3.1.1-3.1.8).
- Koncentra DOTA-hCD19-mAb-lösningen: tillsätt lösningen till en 50 kDa centrifugalkoncentrator med 50 kDa molekylvikt enligt tillverkarens rekommendationer om volym. Centrifugera vid 4 000 × g i 10 minuter (eller tills volymen minskas med 80%-90%); Ignorera genomströmningen.
- Upprepa ytterligare nio gånger (10 totalt): tillsätt tillräckligt med ammoniumacetat för att få tillbaka volymen till den maximala rekommenderade volymen.
Anm.: Totalsumman ska vara vad som ursprungligen tillsattes, inklusive det som finns kvar i kolonnen, vanligtvis 400–450 μl för en centrifugalkoncentrator med en kapacitet på 500 μL.- Skölj reaktionsflaskan med ammoniumacetatbuffert för att ta upp eventuella rester av DOTA-hCD19-mAb; Tillsätt tvätten i centrifugalkoncentratorn.
- Centrifugera vid 4 000 × g i 10 minuter.
OBS: Centrifugeringstiden kan minskas vid efterföljande snurr om volymen sänks till 80%-90% på kortare tid.
- Ta bort proteinlösningen från centrifugalkoncentratorn. Notera den totala volymen av DOTA-hCD19-mAb.
- Tillsätt tillräckligt med ammoniumacetatbuffert i centrifugalkoncentrater 2 för en total volym på 100 μL och pipettera för blandning. Täck centrifugalkoncentratorkolonnen och vänd upp. Centrifugera med 4 000 × g i 2 minuter för att samla upp lösningen. Överför till ett nytt rör.
- I centrifugalkoncentrator 500, använd en pipett för att samla upp mAb-lösningen från centrifugalkoncentratorn; Lägg i ett nytt rör.
- Mät koncentrationen med en UV-Vis-spektrofotometer. Om koncentrationen är högre än 2 mg/ml, späd med ammoniumacetat till 2 mg/ml.
- Alikvot 100 μg per PCR-rör (ca 50 μl). märk rören med DOTA-hCD19-mAb, datum, massa och koncentration. Snurra ner injektionsflaskorna.
- Snäpp-frys DOTA-hCD19-mAb på det kylda PCR-blocket på torris (eller frys på torris). När alla prover är frysta, placera dem i en frys på -80 °C.
- Mät antalet DOTA per hCD19-mAb med masspektrometri. Behåll ett prov av okonjugerade (rena) antikroppar från varje konjugering för att beräkna förhållandet. Använd ekvation (1) nedan; molekylvikt förkortas MW.
Nej (1)
- Radioaktiv märkning
OBS: Bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) för hantering av radioaktivitet, inklusive en labbrock, handskar och en personlig kropps- och ringdosimetrar, enligt institutionella bestämmelser. Undersök och byt handskar regelbundet för att förhindra radioaktiv kontamination. Använd blyskärmning och öka avståndet från den radioaktiva källan genom att hantera med tång när det är möjligt.- Överför radioaktivitet från transportflaskan till en ny injektionsflaska med hjälp av en pipett. Mät radioaktiviteten.
- Ta bort en alikvot för den första radioaktiva märkningsreaktionen. Tillsätt 50 μl ammoniumacetat (pH 5,5) per 1 mCi 64Cu-CuCl3. Mät pH-värdet genom att pipettera 1 μL på en pH-remsa med ett intervall som fångar 5,5 med tillräcklig upplösning för att skilja mellan 5 och 6.
- Om pH inte är 4-5,5, ändra det med 1 M NaOH eller 0,1 M HCl. Tillsätt små mängder, 1-5 μL, av 1 M NaOH om pH är mindre än 4 eller 0,1 M HCl om pH är större än 5,5 tills rätt pH uppnås. Blanda ordentligt med varje tillsats, snurra ner och mät pH-värdet enligt beskrivningen ovan. Notera varje tillsats och avlägsnande av eventuell lösning (inklusive för att kontrollera pH) så att den slutliga volymen kan beräknas.
- När det optimala pH-värdet har uppnåtts, tillsätt 10 μg DOTA-hCD19-mAb per 1 mCi 64Cu-CuCl3. Blanda försiktigt och centrifugera en kort stund.
- Placera reaktionsflaskan på en termomixer inställd på 37 °C och 400 varv per minut (rpm).
- Efter 30 minuter, släck reaktionen: dividera den totala reaktionsvolymen med 50 och tillsätt volymen på 0,5 M EDTA till reaktionsblandningen.
- Bestäm märkningseffektiviteten med hjälp av omedelbar tunnskiktskromatografi (ITLC) för att mäta procentandelen bunden och fri koppar i lösningen.
- Klipp 1 cm breda remsor av TLC-papper. Markera 1 cm från toppen och botten av remsan och förbered ett rör (50 ml E-kolv) med mobil fas mindre än 1 cm av 0,1 M citronsyra (nivån på den mobila fasen bör vara under 1 cm-märket på remsan när den placeras i röret).
- Pipettera över 1 μL av reaktionslösningen på remsan vid den nedre 1 cm markeringen (lösningsmedelsfronten) och placera remsan i röret. Titta tills lösningsmedelsfronten når den översta 1 cm-markeringen, ta bort remsan och linda in den i en bit plastfolie.
- Placera remsan på plattformen och kör den genom en radio-TLC-bildskanner. Leta efter den radioaktivt märkta mAb vid ursprunget och fria 64Cu som färdas med den mobila fasfronten (figur 2). Om andelen fri koppar är mindre än 5 % (95 % märkningseffektivitet), fortsätt med injektion i djur. Om andelen fri koppar är större än 5 %, fortsätt med reningen.
OBS: Procententage av fri koppar beror i allmänhet på förhållandet mellan DOTA-mAb och 64Cu, reaktionstid, pH och temperatur. Reaktionsbetingelserna bör optimeras av varje användare för varje ny mAb för att säkerställa konsekventa resultat.
- Rening via en gravitationskolonn av DNA-kvalitet för engångsbruk
- Konditionera en gravitationsflödeskolonn av DNA-kvalitet för engångsbruk (avsaltnings-/buffertutbyteskolonn) enligt tillverkarens anvisningar. Placera gravitationskolonnen av DNA-kvalitet för engångsbruk på ett ringstativ eller annat instrument bakom lämplig blyavskärmning; Se till att apparaten är stabil och lätt att flytta. Placera röret under pelaren.
- Pipettera den råa reaktionsblandningen på gravitationsflödeskolonnhartset. Vänta tills all vätska har runnit in i hartset. Pipettera så mycket att PBS som möjligt bringas till 500 μL för hela volymen (råprodukt plus PBS). Kassera genomströmningen.
- Placera kolonnen över 1.5 ml centrifugrör märkta 1-10. Tillsätt 1 ml PBS till kolonnen. Samla upp fem droppar i varje rör tills flödet har stannat.
OBS: Färre än 10 rör kan behövas. - Täck kolonnens botten och mät den kvarvarande radioaktiviteten. Mät varje injektionsflaska med genomströmning. För varje injektionsflaska med mer än 50 μCi, förbered en ITLC per steg 3.3.7 för att mäta den procentuella andelen bunden koppar i varje fraktion.
OBS: De första en eller två fraktionerna kommer endast att innehålla mobil fas; den radiomärkta mAb kommer att eluera först (vanligtvis fraktionerna 2 eller 3 till 5 eller 6) och den fria 64Cu kommer att eluera sist (vissa kommer att fastna på kolonnen). Den procentuella bindningen 64Cu kan variera mellan fraktioner. - Kombinera fraktionerna med mer än 95 % bindning (mindre än 5 % fri koppar); Använd injektionsvätskan. Om så önskas, utför storleksuteslutning HPLC för att bekräfta radiomärkning5 och beräkna molaktiviteten. Spara en alikvot för att mäta koncentrationen på en UV-Vis-spektrofotometer efter att den har sönderfallit med 10 halveringstider (127 timmar eller 5,3 dagar).
Nej (1)4. Beredning av dosering
OBS: Innan du hanterar dosen, använd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive labbrock, kropps- och fingerdosimetrar och handskar.
- Injicera 64Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 timmar före PET-skanning för att möjliggöra tillräcklig cirkulation av det radioaktiva spårämnet i kroppen.
- Placera omedelbart blybehållaren med 64Cu-DOTA-hCD19-mAb bakom blyskärmningen. Slå på geigermätaren för att övervaka potentiell kontaminering.
OBS: Byt handskar ofta vid hantering av radioaktivt material. Dubbla handskar under appliceringsdoser rekommenderas för att underlätta snabba handskbyten. Placera alltid förorenade vassa föremål och skräp i det avsedda avskärmade sopområdet. - Späd 64Cu-DOTA-hCD19-mAb till en lämplig koncentration i ett lågbindande 1.5 ml plastcentrifugrör.
OBS: 64Cu-DOTA-hCD19-mAb kommer att binda till plast om den inte har låg bindning; 64Cu kommer att binda till glas.- Späd det radioaktiva spårämnet i koksaltlösning för att förhindra radiolys och förenkla uttaget av konsekventa doser.
- Bered doser för att om möjligt administrera mellan 75 och 150 μCi i 100 μL. Se till att den maximala totala injicerade volymen inte överstiger 10 % av musens kroppsvikt.
- Använd en 500 μL (50 cc) insulinspruta för att dra upp dosen från plasttuben med låg bindning. Se till att det inte finns några bubblor i sprutan eftersom den kommer att injiceras intravenöst.
- Förmärk sprutorna med motsvarande djurnummer.
- Anteckna dosaktivitet och tid i en labbanteckningsbok för dataanalys.
- Ha doserna redo för injektion så snart djuren kateteriseras för att minska tiden under narkos.
- Efter att doserna har beretts, förbered en standard (fantom) för skanning för att generera en kalibreringsfaktor.
- Fyll ett 15 ml koniskt rör med 50-75 μCi aktivitet utspädd i vatten (eller PBS).
OBS: Se till att lösningen blandas noggrant. Standarden kan vara gratis 64Cu som blir över från märkning.- Mät aktivitetsmängden i standarden och registrera tiden.
- Fyll ett 15 ml koniskt rör med 50-75 μCi aktivitet utspädd i vatten (eller PBS).
5. Kanylering och injektion
OBS: Se tidigare beskrivna metoder 6 för intravenös kanylering av möss för injektion av radiotracer6.
- Väg och poängsätt mössen med avseende på sjukdomens svårighetsgrad enligt beskrivningen i avsnitt 2.1 innan mössen bedövas i en knockdown-box fylld med 1,5-3 % isofluran som förberedelse för administrering av radioaktivt spårämne.
OBS: Dessa möss kommer att injiceras på bänkskivan, inte på PET-skannern som tidigare beskrivits. Det finns inget behov av att limma fast katetrarna för injektion, eftersom mössen inte flyttas mellan kanylering och injektion. - När musen har kanylerats, stick in nålen i änden av katetern och injicera långsamt. Efter injektionen följer du upp med en liten spolning med koksaltlösning genom katetern för att säkerställa att hela dosen injiceras.
OBS: Volymen bör ungefär motsvara kateterns dödvolym, vilket är 50 μL för de katetrar som används av författarna.- Injicera över en bit laboratorieservett för att samla upp eventuella droppar av radioaktivt spårämne; Inkludera detta när du mäter restdosen.
- Registrera tidpunkten för inmatningen i en labbanteckningsbok.
- Ta bort kanylen omedelbart efter injektionen. Mät kanylen, dossprutan och vävnaden med hjälp av en doskalibrator för att bestämma den restdos som inte injicerades i musen.
- Registrera aktiviteten och tiden i en labbanteckningsbok.
- Efter att mössen har injicerats, märk deras burar med ett burkort som indikerar att mössen är radioaktiva. Registrera och logga burarna enligt institutionens riktlinjer. Placera sedan mössen i ett särskilt radioaktivt förvaringsområde.
6. PET/CT-avbildning
- Utför PET-avbildning 18-24 timmar efter injektion av 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Väg och poängsätt mössen före skanning.
OBS: Skannerns bruksanvisning beror på vilken skanner som används.- Se till att PET/CT-skannerns röntgendel är uppvärmd och klar för insamling.
- Öppna programvaran för insamling av PET-skanner på datorn.
- I rullgardinsmenyn Investigator Login (Investigator Login ) klickar du på lämplig labbinformation.
- På sidan Projekt skapar du antingen ett nytt projekt eller väljer ett befintligt projekt i listrutan.
- När initieringsprompten automatiskt visas på skärmen klickar du på Home Bed och väntar på att sängen ska komma hem. Klicka sedan på Värm upp CT.
- Se till att CT-skärmningsdörren är stängd så att CT kan värmas upp.
- Medan skannern värms upp, gör EAE-mössen och injicera dem subkutant med 0,2-0,4 ml varm koksaltlösning i flanken för återfuktning.
- När skannern har värmts upp, gå tillbaka till datorn för att ställa in PET-skanningarna för studien.
OBS: Dessa kan ställas in före skanningsdagen.- Under rubriken Senaste studier klickar du på Skapa ny studie. Fyll i studiens namn, protokoll, förening och ämnesinformation.
- Om du utför en PET/CT, välj PET-protokoll först och välj sedan CT-protokoll.
OBS: Vanligtvis räcker det med en standard-CT för att skanna EAE-musmodellen. En datortomografi är 1 minut lång och tas med binning vid 2 x 2 vid spänning 80 kVp, ström 150 μA och 720 projektioner. CT-bilder rekonstrueras med hjälp av en modifierad Feldkamp-algoritm. - För PET-protokollet, välj en 10-15 minuters statisk 64-kopparskanning. Om den här genomsökningen inte redan finns i listan över tillgängliga protokoll lägger du till den genom att klicka på fliken Protokoll i Standard-menyn , Skapa nytt protokoll | Rullgardinsmenyn Isotoper . Om den önskade isotopen inte finns med i listan, klicka på Mer | Lägg till från biblioteket och lägg till önskad isotop. Definiera skanningens varaktighet, klicka på alternativknappen för statisk skanning, namnge protokollet och klicka på Spara.
- Gå tillbaka till fliken Studier och fortsätt att namnge och ställa in alla önskade skanningar för dagen.
OBS: Det rekommenderas att även ställa in en "CT Test"-skanning med endast en standard CT för att kontrollera sängpositionen för den första skanningen för att säkerställa optimal placering. Detta bör vara den första skanningskörningen för studien.
- Om du utför en PET/CT, välj PET-protokoll först och välj sedan CT-protokoll.
- Under rubriken Senaste studier klickar du på Skapa ny studie. Fyll i studiens namn, protokoll, förening och ämnesinformation.
- När skannern är klar, bedöva mössen i en knockdown-låda för att förbereda dem för skanningen.
OBS: I detta skede är mössen sannolikt mycket sjuka; Det är bästa praxis att minimera tiden under narkos.- Applicera ögongel.
- Se till att skanningsbädden med fyra möss är utrustad med värmeelement, t.ex. värmedynor eller uppvärmd luft, med isofluran inställt på 1,5–2 % och värmedynan påslagen (bild 3). Placera mössen på rygg på skanningsbädden.
- När EAE-sjukdomen fortskrider blir musens ryggrad kraftigt krökt. Skanna mössen medan de ligger på rygg för att räta ut ryggraden så mycket som möjligt, vilket förbättrar analysen nedströms. Dra försiktigt i mussvansen för att hjälpa till att räta ut ryggraden.
- När du är i ryggläge, tejpa säkert varje mus på plats med mjuk mikroskoptejp. Använd en tejpremsa över huvudet och en annan försiktigt över magen för att minimera rörelse på grund av andningen.
- Anteckna i en labbanteckningsbok vilken mus som är i vilken skanningsposition.
- När mössen är säkrade går du tillbaka till skannerdatorn för att använda skannern.
- Öppna menyn Rörelsestyrenhet . Klicka på PET Center FOV för att flytta mössen på skanningsbädden in i PET-ringen. För dagens första skanning, klicka på CT Center FOV. När du väl är på plats, kör CT-testskanningen för att säkerställa att positionen är korrekt; Upprepa tills sängpositionen är tillfredsställande.
- Placera en liten bit vit tejp på skanningsbädden för att markera rätt sängplacering för resten av studien.
- När sängen är på plats för PET-skanningen, starta skanningssekvensen genom att klicka på Kör.
- Vänta tills skannern automatiskt flyttas från PET-ringen till CT:n.
- Kontrollera alltid visuellt om djuren har flyttat sig till rätt position för både PET och CT.
- Anteckna skanningens starttid i en labbanteckningsbok för att korrigera karies av den injicerade dosen under dataanalysen.
- När genomsökningen är klar låter du avbildningen rekonstrueras. Kontrollera uppgifterna innan du tar bort djuren.
3D-sorterade OSEM-rekonstruktion (Subsets Expectation-Maximization) tar cirka 5 minuter för en statisk genomsökning. - Kontrollera och godkänn data visuellt, med mjälten som en positiv kontroll eftersom denna vävnad innehåller ett stort antal B-celler. Ta bort djuren från undersökningsbädden och placera dem i en isofluranfylld knockdown-låda som förberedelse för perfusion och efterföljande dissektion.
- Upprepa steg 6.5-6.12 för de återstående mössen i studien.
- När alla möss är skannade eller när du skannar en grupp som har en öppen plats i skanningsbädden, skanna standarden som förberetts i steg 4.6.
7. Dissektion för ex vivo gammaräkning och autoradiografi
- Innan du dissekerar, se till att alla gammaräknings- och centrifugrör har vägts i förväg.
- Utför eutanasi via perfusion, som tidigare beskrivits6, med PBS och torakotomi medan mössen är djupt sövda (kontinuerlig inhalation av 4% isofluran, 2 L/min 100% O2).
- För att ta bort benmärgen, skär båda lårbenen vid knäet och bäckenet. Se till att båda huvudena är borttagna från lårbenet.
- Placera båda lårbenen i ett 0,5 ml centrifugrör som har ett hål i botten (med en 20 G nål) och har locket avklippt.
- Placera 0.5 ml-slangen som innehåller lårbenen inuti en 1.5 ml centrifugslang med locket avskuret.
- Placera hela rörinstallationen i en minicentrifug. Centrifugera i 4 minuter med 4 500 × g.
OBS: Benmärgen ska lossna genom hålet i 0.5 ml centrifugröret och sätta sig i botten av 1.5 ml centrifugröret.- Separera rören. Väg de tomma lårbenen i 0,5 ml centrifugröret. Väg benmärgen i 1,5 ml centrifugröret. Placera varje centrifugrör i gammaräkningsrör.
- Ta bort hjärnan med en pincett och sax, var noga med att hålla hjärnstammen intakt. Placera hjärnan i ett gammaräknerör. Registrera torrvikten, spola med PBS och håll på is tills du är redo att räkna.
- Utför följande steg för att ta bort ryggmärgen.
- Ta bort skinnet och pälsen genom att göra ett snitt längs djurets ryggsida för att exponera ryggraden (Figur 1).
- Separera ländryggen (L) från halsregionen (C) och bröstkorgsregionen genom att skära längs tre tvärplan runt och genom ryggraden: vid basen av nacken (C1-kotan) (Figur 1D, nummer 1); vid basen av bröstkorgen (L1-kotan) (figur 1D, nummer 2); vid basen av bäckenet (L5-kotan) (Figur 1D, Nummer 3).
- Skär under bröstkorgen (Figur 1D, Nummer 2).
- Skär direkt ovanför korsbenet för att separera ländryggen. Trimma försiktigt ryggraden från bäckenänden tills ländryggmärgen är synlig (Figur 1D, Nummer 3). Klipp av de omgivande vävnaderna för att isolera ländryggen och hals-/bröstkorgsregionerna i ryggraden (Figur 1D, nummer 4 och 5).
- För att driva ut ryggmärgen, använd en spruta med glidspets (3-10 ml) fylld med PBS. Skapa en tätning mellan sprutan och ryggraden med tummen och pekfingret.
- Tryck försiktigt PBS genom sprutan för att driva ut ryggmärgen på en absorberande dyna (Figur 1E). Upprepa för båda ryggradsregionerna. Placera ryggmärgsvävnaderna i ett gammaräknerör.
- Registrera torrvikten och tillsätt PBS för att säkerställa att vävnaden är i botten av röret för att undvika uttorkning. Lägg röret på is tills det är klart för räkning.
- Stöt ut hals-/bröstryggmärgen från kranialänden och ländryggmärgen från den kaudala änden av ryggraden (Figur 1E).
8. Ex vivo gammaräkning
- Öppna programvaran för gammaräknare. Navigera till arbetslistan och välj önskat protokoll, till exempel ett 30 s räkneprotokoll för 64Cu.
- Bered minst tre standarder i separata rör. Kör dem nu för användning i analys (steg 10.2). Sikta på att göra tre replikationsvolymer och aktivitetsmängder i tre separata rör.
OBS: En volym på 500 μL ger bra resultat. Även om aktiviteten bestäms av den maskin som används, fungerar 10 μCi i allmänhet bra. - Placera standarderna i ett ställ märkt med streckkoden som motsvarar det önskade protokollet som ska köras. Placera gallret på gammaräknaren.
- Efter att ha registrerat organvikterna, placera rören som innehåller organen på gammaräkningsstället efter rören som innehåller standarderna.
OBS: Organ av intresse för denna modell kan inkludera axiella lymfkörtlar, blod, benmärg, hjärna, livmoderhalslymfkörtlar, lårben, hjärta, lever, ländryggmärg, muskel, mjälte, svans och livmoderhals/bröstryggmärg. - Placera ett ställ med en stoppstreckkod på baksidan av gammaräknaren.
- Tryck på uppspelningsknappen på datorn. Om möjligt, tryck inte på Play förrän det finns flera rack eller organ som ska köras så att alla rör kan räknas kontinuerligt i en file. Se till att ett ställ med en stoppstreckkod finns på baksidan av gammaräknaren för varje körning.
- Kör tills alla prover har räknats. Spara och exportera filen.
9. Ex vivo autoradiografi (ARG) av CNS-vävnad
- Följ tidigare publicerade steg för både hjärn- och ryggmärgs-ARG (men exkludera steg 2-6 som beskrivs av Chaney et al., eftersom mössen redan är injicerade med radiotracer från PET-skanningen)6.
OBS: Specifika instruktioner för att förbereda ryggmärgens ARG-kassett listas här6. - Efter att gammaräkningen är klar för ryggmärgen i ländryggen och hals-/bröstkorgen, lägg omedelbart rören på is tills alla CNS-vävnader har räknats.
OBS: Se den tidigare publicerade metoden för ARG i hjärnan6. - Tippa försiktigt rören så att ryggmärgen faller ut på en absorberande dyna. Om ryggmärgen fastnar på sidan av slangen, spola försiktigt med kall PBS och tippa slangen igen. Torka försiktigt varje ryggmärg genom att försiktigt torka med en laboratorieservett. Lägg de torkade ryggmärgen på ett organiserat sätt på ett tjockt svart papper.
- Märk bredvid ryggmärgen med en vit penna för enkel identifiering.
- Lämna utrymme i hörnen och i mitten av det svarta pappret för att placera högar med tre mikroskopglas som fungerar som distanser för att förhindra kompression av ryggmärgen när ARG-kassetten är stängd. Använd 5-7 staplar.
- När alla ryggmärg i ländryggen och hals-/bröstkorgen är placerade på det svarta pappret och märkta, placera försiktigt pappersbiten i ARG-kassetten. Placera den öppna kassetten på en bricka med torris för att frysa ryggmärgen.
- När den är frusen, placera försiktigt plastfolie mellan den digitala fosforlagringsskärmen och ryggmärgen och placera skärmen ovanpå proverna. Stäng omedelbart kassetten och placera den i frysen -20 °C i cirka 10 halveringstider (~127 timmar).
- När exponeringstiden är klar, skanna filmen med en fosforkamera. Analysera den resulterande digitala bilden (se avsnitt 12 för instruktioner).
10. Analys av biodistributionsdata
- Ställ in ett "Dose Correction"-kalkylblad för att matematiskt bestämma tidskorrigeringen för det radioaktiva sönderfallet, och på så sätt normalisera stråldoser och möjliggöra jämförelser mellan försökspersoner.
- Sönderfallskorrigera alla doser av injektionstiden, med hänsyn till kvarvarande aktivitet som finns kvar i sprutan och katetern efter injektionen.
- Med hjälp av de standarder som utarbetats i steg 8.2 anger du medelvärdet av aktivitetsmängden (μCi) och normaliserade antal per minut (CPM). Dividera den genomsnittliga CPM med den genomsnittliga standardaktivitetsmängden för att få CPM/μCi.
OBS: Se till att aktivitetsmängden för varje standard är avklingningskorrigerad till den tidpunkt då gammaräknaren räknar standardernas CPM. Gammaräknaren ska normalisera alla CPM-värden till protokollets starttid.
- Ställ in kalkylbladet "Resultat" för att beräkna den slutliga procentuella injicerade dosen per gram vävnad (%ID/g) för varje prov.
- Sönderfallskorrigera den normaliserade CPM från gammaräknaren för varje prov räknat till injektionstiden för djuret.
OBS: Decay-korrigering kan ske när som helst; se till att alla doser och CPM-värden är sönderfallskorrigerade till samma tidpunkt. - Normalisera den sönderfallskorrigerade CPM till massan för varje prov för att bestämma CPM per prov. Beräkna den totala CPM som injiceras genom att subtrahera CPM i svansen från den beräknade injicerade CPM.
OBS: Svansen behöver inte masskorrigeras eftersom detta CPM-värde helt enkelt kommer att subtraheras från den totala injicerade CPM för att ta hänsyn till eventuella extravenösa spårämnen från injektionen. - Dividera CPM per massa med den totala CPM som injiceras för att beräkna %ID/g.
- Sönderfallskorrigera den normaliserade CPM från gammaräknaren för varje prov räknat till injektionstiden för djuret.
- Ställ in ett "Summary"-kalkylblad för att visa de slutliga resultaten för inmatning i ett grafprogram och efterföljande datavisualisering och statistisk analys.
11. Analys av PET-bilder
- Öppna programvaran för PET-analys. slicka på fil |Öppna lokala data | DICOM. Leta reda på önskad fil (DICOM-format). Öppna både PET och CT.
- I Datahanteraren justerar du PET- och CT-kontrasten till önskade nivåer.
- Registrera och beskär enskilda möss.
- I navigeringsmenyn väljer du fliken Omorientering/registrering .
- Gå till menyn Stel på den här fliken. Ange datortomografin (0 ) som den fasta skanningen och PET-skanningen (1) som den rörliga skanningen.
- Välj Stel omvandling och Snabb kvalitet. Klicka på Registrera.
- När registreringen är klar (5-10 min), klicka på bocken för att spara registreringen.
- Inspektera data visuellt för att säkerställa att registreringen lyckades. Exportera sessionen genom att klicka på Arkiv | Sammanträde | Exportera.
- Beskär sedan varje mus i en helkroppsbeskärning: gå till navigeringsmenyn och klicka på Beskärning. Dra sidorna på varje tvärsnitt från ytterkanten inåt.
- När den önskade musen är ordentligt beskuren klickar du på bocken och exporterar sessionen för att spara.
- Beskär och räta sedan ut huvudena på varje mus för hjärnanalys med hjälp av den manuella översättningen, rotationerna och vändningarna i menyn Registrering/omorientering . Exportera för att spara.
- Analysera ryggmärgen.
- För att påbörja analys av intresseområden (ROI) i ryggmärgen, öppna 3D ROI-verktyget från navigeringsmenyn .
- Under rubriken ROI använder du plustecknet längst ned i menyn för att skapa sex ROI: Ländryggs-ROI, Cervikal/Thorax-ROI, Ländryggsskelett, Thoraxskelett, Ländryggmärg, Thoraxryggmärg.
OBS: Avkastningen på ländryggen och livmoderhalsen/bröstkorgen är generaliserade stora ROI som kommer att användas för att skapa skelettets ROI (figur 4). - För att undvika visuell störning från PET-signalen med detta steg, klicka på F3 för att stänga av PET.
- Gå till toppen av 3D ROI-verktygsoperatören. Klicka på den heldragna pricken till höger om markörsymbolen för att öppna menyn 3D-målningsläge och erodera/vidga .
- Välj Sfär och ändra storleken till 20 pixlar. Ställ in Vidga på +5.
- Innan du fortsätter, gå till botten av menyn. Se till att ländryggen ROI är vald, eftersom detta är den första ROI som ska dras.
- På CT hittar du L6-kotan i ryggraden (där ryggraden möter höfterna). Börja en kota ovanför L6 och rita en grov ROI Lumbal ROI över de fem kotorna ovanför höfterna (L1-L5 kotor). Byt sedan till cervikal/thorax ROI och spåra resten av ryggraden till skallbasen.
OBS: Detta behöver inte vara exakt, eftersom det används för att indikera var Otsu-trösklar ska ske i steg 11.4.8. - När du har ritat de generaliserade ROI:erna går du till toppen av operatorn. Välj menyn Segmenteringsalgoritmer .
- I rullgardinsmenyn väljer du Otsu Thresholding. För inmatningen väljer du Lumbar ROI. Längst ner i menyn, se till att Ländryggsskelett är valt. I rullgardinsmenyn bredvid Bild, se till att CT-skanningen är vald och klicka på Verkställ. Upprepa för cervikal/thorax ROI och Thoraxskelett.
- Om Otsu-trösklarna inte framhäver ryggraden tillräckligt, använd Global Thresholding och ändra Min-värdet till 350 och Max till 3 500 för manuell trösklar och justera vid behov för att isolera kotorna.
- När du har använt Otsu Thresholding för att skapa Skeleton ROI:er går du tillbaka till navigeringsmenyn (markörikonen). Ta antingen bort eller markera kolumnen H (dölj) för både grov ländrygg och livmoderhals/bröstkorg för att dölja dem. Markera kolumnen I (oföränderlig) för båda skelett-ROI:erna så att de inte kan redigeras.
- Slutligen, gå tillbaka till toppen av 3D ROI Tool Operator och gå till 3D Paint-menyn för att rita ryggmärgs-ROI:erna.
- Välj sfärverktyget igen och spåra ryggmärgen i skelettet för både ländryggen och bröstkorgen, och se till att rätt ROI väljs längst ner på menyn.
- För att radera eventuell ROI, klicka på Kommando/Ctrl och rita över den del som ska raderas.
- Kontrollera ryggmärgens ROI från alla tre planen för att se till att det inte finns någon ROI utanför ryggraden.
- Exportera resultat från ryggmärgsanalys.
- Om PET-signalen stängdes av i steg 11.4.3, tryck på F3 efter att ryggmärgs-ROI har ritats för att slå på PET igen, eller välj Visual Controller (VC) och klicka på PET-fältet.
- Gå tillbaka till navigeringsmenyn (markörikonen). Klicka på rutnätsikonen för att visa tabell. Kopiera tabellen till kalkylprogram och spara.
- Slutligen, exportera filen i PET-analysprogramvara, enligt beskrivningen ovan, för att spara de ROI:er som dragits.
- Analysera hjärnan med hjälp av en halvautomatisk 3D-atlas.
- Öppna huvudbeskärningsfilen. Importera musens hjärnatlas genom att gå till menyn Avancerade moduler och välja 3D Brain Atlas Tool. Se till att referensen är inställd på CT och att beskärningsalternativet är avmarkerat. Ange en sökväg för utdatakatalogen.
- I Avancerad inställning ändrar du Transformera till Versor-Affine. Behåll alla andra standardinställningar. Klicka på Kör.
- Justera atlasen manuellt i menyn Omorientering/Registrering och använd CT av skallen som en riktlinje för att anpassa atlasen.
- Var mycket försiktig om skalning är nödvändig, eftersom detta i hög grad kan påverka hjärnans strukturvolymer. Klicka på bocken när justeringen är klar.
- Kör atlasen igen med Importera 3D-ROI markerat.
- Exportera filen för att spara atlasen som är monterad på det beskurna huvudet.
- Efter att ha ritat och exporterat alla ROI:er från de önskade organen, beräkna ett standardbindningskorrigeringsvärde. Decay-korrigera alla data och konvertera till %ID/g som tidigare beskrivits6. Normalisera till det organ som passar djurmodellen, till exempel hjärtat för att normalisera till radiotracer som finns i blodpoolen.
12. Ex vivo autoradiografianalys
- Öppna den digitala bildfilen (.gel) med hjälp av bildanalysprogrammet. Justera ljusstyrka och kontrast till önskat tröskelvärde. Använd en lämplig färguppslagstabell om så önskas.
OBS: Royal eller Grays rekommenderas för enkel visualisering.
Representative Results
hCD19-mAb var DOTA-konjugerad och radiomärkt med 64Cu som visas i figur 2. EAE och naiva möss genomgick PET/CT-skanning (Figur 3) 18-24 timmar efter injektion med 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. PET/CT-bilder samregistrerades med hjälp av PET-analysmjukvaran, och CNS-vävnaderna analyserades med hjälp av manuella ROI eller en halvautomatiserad 3D-hjärnatlas. Bindningen av radioaktiva spårämnen i ROI (Figur 4) var högre hos EAE-möss än hos naiva möss. Ex vivo gammaräkning och ARG visade ökad bindning i ryggmärgen (både ländryggs- och cervikala bröstsegment) och hjärnan (endast ARG) hos EAE-möss jämfört med naiva (Figur 5 och Figur 6). Ex vivo gammaräkning av perfunderade möss visade också minskad bindning av radioaktivt spårämne i perifera organ, inklusive mjälte, lårben och benmärg (Figur 5), vilket överensstämmer med att B-celler lämnar periferin och infiltrerar CNS i denna EAE-modell.
Figur 2: Konjugerings- och radiomärkningsschema för generering av 64 Cu-märkt humanspecifik monoklonal CD19-antikropp, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), utöver kvalitetskontrolldata. (A) Reaktion av DOTA-NHS-ester med hCD19 monoklonal antikropp för att producera hCD19-DOTA-konjugat (ej i skala) och radiomärkning med 64 Cu-CuCl3 för att producera 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. B) Representativ ITLC-kromatograf. Toppen vid 40-60 cm är den radioaktivt märkta antikroppen; obundet 64Cu-CuCl3 färdas med den mobila fasen och skulle vara närvarande från 200 till 240 cm. Det finns inget detekterbart fritt 64Cu-CuCl3 i denna kromatograf. C) Specifikationerna för kvalitetskontroll av den radioaktivt märkta antikroppen. Förkortningar: DOTA-NHS-ester = 1,4,7,10-tetraazacykloddodekan-1,4,7,10-tetraättiksyramono-N-hydroxisuccinimidester; ITLC/HPLC = omedelbar tunnskiktskromatografi/högpresterande vätskekromatografi; MALDI/LC-MS = matrisassisterad laserdesorption/jonisering/vätskekromatografi-masspektrometri CPM = antal per minut. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fotografier som visar hur man fäster möss i en 3D-printad säng i PET-skannern för att möjliggöra högkvalitativ avbildning av ryggmärgen och hjärnan samtidigt som rörelse minimeras. (A) 3D-printad skannersäng med fyra möss (även känd som "mushotell") utrustad med värmeelement och anestesislang. (B) Sövda möss i ryggläge för att maximera rakheten i ryggraden; Sängpositionen för varje mus registreras. (C) Möss tejpas säkert över huvudet för att minimera rörelser i hjärnan och över magen för att minimera rörelse från andningen, utan att påverka andningen. (D) Musbädd placerad i skannern och fasttejpad på skanningsbädden. Anestesislangen anslöts från skannern till sängen och isofluran sattes till 2 %. Musens andning övervakades för att säkerställa lämplig isoflurannivå innan skannerluckan stängdes. Förkortning: PET = Positronemissionstomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ryggmärgsbild och hjärnanalys och resultat med hjälp av PET-analysprogram . (A) i) ROI (rosa och brun) ritade på ryggraden för att separera ländryggen från bröst- och halskotorna och förbereda bilden för Otsu-trösklar. ii ) Ryggkotor (turkos och röda) segmenterades ut med hjälp av Otsu Thresholding. iii ) Kotorna gjordes sedan oföränderliga i 3D ROI-menyn, och ryggmärgen delades in i cervikal/thorax (lila) och ländrygg (marinblå) ROI. iv) Vertebral ROI togs bort, vilket lämnade ryggmärgs-ROI och representativ hjärnatlas applicerad. (B) Representativ analys av PET-resultat från olika CNS-regioner representerade som %ID/g normaliserat till hjärtats ROI inom varje djur. PET-insamlingen var en 10 minuters statisk skanning via PET/CT-avbildning. Hjärnregioner kvantifierade med hjälp av en halvautomatiserad hjärnatlasmetod, som visas i panel A. iv) Representativa resultat visar antingen signifikans eller trend mot signifikant ökning av spårämnesbindning i hjärnan och bröstryggmärgen. Statistik utförd med Students t-test (*: p < 0,0332). Förkortningar: PET = positronemissionstomografi; ROI = regioner av intresse; CNS = centrala nervsystemet; CT = datortomografi; %ID/g = procentuell injicerad dos per gram vävnad, EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativ kvantifiering av ex vivo gammaräkning i olika organ hos EAE och naiva möss uttryckt som %ID/g. Efter PET-skanning perfunderades möss med PBS för att avlägsna det radioaktiva spårämne som fanns i blodet, antingen fritt eller bundet till blodresidenta CD19+ B-celler, och organen dissekerades snabbt och vägdes för att få en korrekt vikt av varje organ. Spårämnesbindningen är signifikant minskad i mjälte och benmärg hos EAE-möss jämfört med naiva. Ökad bindning av radioaktivt spårämne observeras i ryggmärgssegmenten både i ländryggen och i halsen/bröstkorgen hos EAE-möss. Hjärnan visar ingen signifikant ökning av radiotracersignalen, även om den trendar mot en signifikant ökning. Statistik utförd med Students t-test (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Förkortningar: PET = positronemissionstomografi; %ID/g = procentuell injicerad dos per gram vävnad, EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Ex vivo ARG-bilder visar 64Cu-DOTA-hCD19-mAb-bindning i sagittala hjärnsnitt och hela ryggmärg från EAE jämfört med naiva möss. Digitala fosforlagringsfilmer skannades med hjälp av en fosforkamera efter att ha exponerats för radioaktiva vävnadsprover under cirka 10 halveringstider (127 timmar eller 5 dagar). De resulterande bilderna avslöjar visuellt högre signal i hjärnan hos EAE-möss jämfört med hjärnsnitt från naiva möss, vilket förväntas på grund av de regioner som är kända för att innehålla B-celler i denna modell5. Specifikt finns det en ökad spårarsignal i hjärnstammen, lillhjärnan och ventriklarna i EAE-musens hjärnsnitt. Denna ökning av signalen för EAE-mushjärnsnitt speglar vad som hittades i PET-kvantifieringen av hela hjärnan som beskrivs ovan. På samma sätt finns det en ökning av bindningen av radioaktivt spårämne i både hals-/bröstkorgs- och ländryggssegmenten jämfört med naiva ryggmärgsband, vilket återspeglar vad som hittades med hjälp av ex vivo gammaräkning. Förkortningar: PET = positronemissionstomografi; EAE = experimentell autoimmun encefalomyelit; Vent = ventriklar; Cb = lillhjärnan; BS = hjärnstammen; TSc = bröstkorgs- och halsryggmärg kombinerat; LSc = ländryggmärg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Färgning av CNS-vävnader från naiv och EAE-mushjärnvävnad med CD45R/B220. B-celler observeras i hjärnstam, hjärnhinnor och vit substans hos EAE-möss (n = 7 EAE, n = 5 naiva möss, i genomsnitt fyra skivor per djur). Denna siffra är från 5. Skalstreck = 5 mm (låg förstoring [1x]) i sagittala hjärnbilder, 100 μm (hög förstoring [20x]) i hjärnstammen, hjärnhinnorna och lillhjärnans vita substans. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Den här artikeln beskriver en strömlinjeformad metod för att avbilda human-CD19+ B-celler i en musmodell av MS med hjälp av CD19-PET. På grund av den heterogena presentationen av MS och varierande svar på behandlingar kan dess hantering i kliniken vara utmanande och det finns ett stort behov av nya metoder för val och övervakning av behandling. PET-avbildning kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att övervaka sjukdomsprogression och individuellt svar på B-cellsutarmande behandling. Förutom MS kan CD19-PET-avbildning användas för att övervaka utarmning av B-celler efter behandling i subtyper av lymfom och leukemi eller andra B-cellsmedierade sjukdomar. Detta protokoll och representativa data visar nyttan av att avbilda B-celler vid neurologiska sjukdomar.
För att studera humana CD19+ B-celler i samband med MS valde vi B-cellsberoende MOG1-125 EAE modell7. I likhet med andra EAE-modeller uppvisar denna modell symtom på progressiv förlamning och infiltration av immunceller i CNS. MOG1-125-modellen är dock unik genom att den är en B-cellsdriven modell: möss innehåller varierande antal B-celler i subaraknoidalrummet i hjärnhinnorna, hjärnstammen, parenkymet och ventriklarna. Dessa lymfocyter kan vara glest utspridda i dessa regioner och/eller bilda follikelliknande strukturer, vilket också observeras hos människor med MS 8,9. Förutom att använda naiva möss som kontroller, kan ett komplett Freunds adjuvans (CFA)-induktionskit användas (dvs. en identisk induktionsemulsion som ges till EAE-möss utan MOG-proteinet). I EAE-musmodellen är blod-hjärnbarriären (BBB) dysfunktionell och tillåter större enheter, såsom antikroppar, att passera. CD19-mAb-radiotracern kommer endast att binda och stanna kvar i CNS om B-celler är närvarande; Spårämnet kommer att cirkulera tillbaka in i blodpoolen om B-celler inte är närvarande. Vi har demonstrerat detta med hjälp av gammaräkning och ex vivo autoradiografi av CNS-vävnader genom perfundering innan man mäter radioaktivitetsnivåerna i vävnaderna. Vi har också visat detta i tidigare publikationer som rapporterat användningen av mAb-baserade PET-radiotracers (dvs. immunoPET-avbildningsmetoder) för att detektera B-celler i CNS 1,2.
DOTA-kelatorn användes eftersom den har använts i klinisk PET-avbildning med koppar-64-märkta peptider och antikroppar, och vi strävar efter att översätta hCD19-mAb för klinisk avbildning av MS-patienter. DOTA har adekvat bindningsaffinitet till koppar-64 in vivo. Stabiliteten in vivo är mycket viktig eftersom fritt 64Cu går till levern och kan skymma signalen från bundet radiotracer. Därför är det viktigt att mäta signalen i levern för att beräkna den relativa signalen jämfört med andra organ. Muskler tas vanligtvis som en kontrollvävnad, men när det gäller EAE kan det finnas inflammation i musklerna. Halveringstiden för 64Cu är 12,7 timmar, vilket ger gott om tid för DOTA-hCD19-mAb att binda till sitt mål samtidigt som signalen kan mätas med PET. Vid beredning av konjugatet bör småskaliga (75-125 μg) testreaktioner utföras för att bestämma mängden DOTA som ska tillsättas till mAb för att producera det önskade DOTA/mAb-förhållandet (t.ex. kan en reaktion med 6-10-faldigt överskott av DOTA-NHS-ester per mol mAb ge ett konjugat på 1-2 DOTA/mAb). Reaktionstiden och temperaturen (t.ex. 2-4 timmar eller över natten vid 4 °C eller rumstemperatur) påverkar också DOTA/mAb-förhållandet och bör optimeras. En titrering med icke-radioaktiv koppar kan utföras för att beräkna antalet DOTA per mAb; Vi rekommenderar dock att du utför MALDI-MS och/eller LC-MS för mer tillförlitliga och exakta resultat.
Det beräknade DOTA/mAb-förhållandet är ett medelvärde för ett visst prov och en viss variation förväntas. För MALDI tas flera sprutor per prov för de konjugerade och okonjugerade mAbs. Vi beräknar sedan förhållandet mellan konjugerade och okonjugerade för att bestämma det genomsnittliga antalet DOTA/mAb. DOTA/mAb-förhållandet är viktigt eftersom för många kelatorer kommer att störa antikroppsbindningen och för få kommer att leda till inkonsekvent radiomärkning och låg signal. Förhållandet bör vara mycket nära mellan konjugatsatser för att upprätthålla konsekvent signalintensitet och bindningskinetik; Helst bör samma sats konjugat användas för alla experiment inom en viss studie. En lovande teknik för att minska potentiella effekter på immunreaktivitet på grund av eventuell överkonjugering är att använda platsspecifik konjugering10 där kelatorkonjugeringen är platsselektiv på antikroppens tunga glykaner, vilket garanterar tillsats av 1 kelator per mAb.
De radioaktiva reaktionsförhållandena bör optimeras för att säkerställa högsta märkningseffektivitet och utbyte eftersom skillnader i bland annat antikropp, DOTA/mAb-förhållande och 64Cu molaraktivitet kommer att påverka radiomärkningen. Genom att använda det optimala konjugatförhållandet på 64Cu till mAb kan det radioaktiva spårämnet användas utan rening, vilket minskar den tid som krävs för radiomärkning och förlust på grund av gravitationsflödeskolonnen och det radioaktiva sönderfallet. En konsekvent och tillförlitlig molaktivitet kan också uppnås när samma 64Cu till mAb-konjugatförhållande används, vilket är särskilt viktigt när man jämför resultat över flera kohorter av möss eller avbildningsstudier. ITLC-villkoren kan också ändras för att passa varje användare. Om rening är nödvändig bör en alikvot sparas för antingen HPLC- och/eller UV/Vis-spektrofotometri så att molaktiviteten kan beräknas.
Det är viktigt att notera att det kan vara utmanande att använda radioaktivt märkta antikroppar för avbildning. Det är viktigt att den antikropp som används för det radioaktiva spårämnet är biologiskt inert för att inte ha någon fysiologisk effekt. Dessutom, eftersom antikroppar har en lång uppehållstid i blodet, måste man vänta tillräckligt länge på cirkulation, bindning och eliminering av en given mAb för att säkerställa en lämplig signal-till-bakgrund utan att kompromissa med bildkvaliteten. Vanligtvis räcker det med att vänta i 20-48 timmar för en 64 Cu-märkt mAb, men man bör avbilda vid 2, 4, 6, 12, 24, 48 timmar efter injektion när man bedömer ett nytt mAb PET-spårämne för att bestämma den bästa tidpunkten för avbildning i en given gnagarmodell. Detsamma gäller för att hämta ARG-bilder med det högsta signal-till-bakgrundsförhållandet. De representativa bilderna i detta protokoll togs 18-20 timmar efter injektionen, även om andra tidpunkter kan användas beroende på vilken radioisotop som används. Olika antikroppar som binder till olika epitoper av CD19 kommer att ge varierande resultat och bör karakteriseras noggrant.
Vid analys av ryggmärgssignalen är det viktigt att placera möss på rygg i skanningsbädden för att minska rörelser orsakade av andningen. Dessutom kan ryggläge hjälpa till att räta ut ryggraden hos möss som har ökad ryggradskrökning på grund av utvecklingen av EAE-sjukdomen. En annan viktig aspekt att ta hänsyn till när man försöker detektera signal i ryggraden och ryggmärgen är att undvika att injicera MOG1-125 på flanken eftersom injektionsställena kan binda spårämnet på grund av det associerade immunsvaret i dessa områden. Närheten till injektionsstället kan störa ryggmärgsanalysen. Injektioner i bröstet är därför att föredra för den applikation som beskrivs här.
De bildanalystekniker som används är specifika för CNS-avbildning. Ett hjärnatlasverktyg i bildanalysprogrammet ger reproducerbara och tillförlitliga resultat så länge registreringen av PET och CT är korrekt. Genom att använda den halvautomatiska 3D-hjärnatlasen och justera den så att den passar skallen på varje mus kan man få en konsekvent avkastning på investeringen mellan djuren. Eftersom det för närvarande inte finns någon automatiserad eller halvautomatisk metod för att analysera signalen i ryggmärgen måste manuella ROI tas fram. Vid kvantifiering av CD19+ B-celler (eller någon celltyp som finns i både benmärgen och ryggmärgen) är det viktigt att eliminera signalen som kommer från ryggraden och benmärgen så mycket som möjligt. Anledningen till detta är att naiva möss är kända för att innehålla fler CD19+ B-celler i benmärgen än EAE-möss, där B-celler lämnar periferin för att infiltrera CNS 5,11. Denna benmärgssignal kan skymma den sanna signalen i ryggmärgen.
För att avgränsa den sanna ryggmärgssignalen och samtidigt minimera signalen från ryggraden och benmärgen, kan Otsu-trösklar av CT-bilden användas för att göra en oföränderlig ROI för ryggraden. En separat ryggmärgs-ROI kan sedan enkelt ritas i ryggraden. Samma teknik kan också användas för att mäta benmärgen i lårbenet. Detta är en mycket användbar metod för att få insikter om spårämnesbindning i ryggmärgen. På grund av den relativt låga rumsliga upplösningen hos PET och problem som rör den partiella volymeffekten vid skanning av små anatomiska regioner hos möss, möjliggör användning av ytterligare ex vivo-konfirmeringstekniker (t.ex. gammaräkning, ARG) validering av bindning av radioaktivt spårämne i ryggmärgen utan närvaro av blod, cerebrospinalvätska eller spillover-signal från ryggraden.
Signalen i hals-/bröstryggmärgen tenderar att variera hos EAE-mössen beroende på sjukdomens svårighetsgrad och hur många B-celler som infiltrerar under det adaptiva immunsvaret. Denna variation i antalet B-celler som infiltrerar, liksom den lilla mängden B-celler i CNS jämfört med de i bäckenet/ryggmärgen hos naiva möss, kan göra det svårt att kvantifiera ryggmärgsvävnad in vivo hos möss. Med tanke på den rumsliga upplösningen av PET vid avbildning av smådjur kan signalen från benmärgen spilla över på ryggmärgssignalen. Ex vivo biodistribution och autoradiografi som slutförts här hjälper till att validera PET-signalen från kotorna kontra ryggmärgsvävnaden. Möss perfunderas före dissektion för att avlägsna eventuella obundna spårämnen i blodpoolen så att gammaräknings- och autoradiograferingsresultaten återspeglar det spårämne som faktiskt är bundet i varje organ snarare än det spårämne som finns i blodpölen i det organet.
Radiotracers cirkulerar genom blodet, och när det gäller antikroppsspårämnen finns det ofta obundet radiotracer i blodet i flera veckor efter den första injektionen. Eftersom vi avbildar hjärnan och ryggmärgen, som har många blodkärl, är det viktigt att förstå vilken del av signalen som verkligen beror på spårämnesbindning i hjärna/vävnad av intresse jämfört med den som finns i blodpoolen. Det är därför nödvändigt att dela upp hjärnsignalen för signalen i hjärt-/blodpoolen. I den kliniska miljön kan samma bildanalystekniker för Otsu-trösklar av kotor och ROI av ryggmärgsvävnader användas för kvantifiering. Med tanke på de större vävnadsvolymerna hos människor jämfört med möss bör det vara betydligt mindre påverkan från partiella volymeffekter, vilket leder till förbättrad noggrannhet och eliminerar behovet av ex vivo-tekniker för att bekräfta in vivo-fynd. Användningen av PET på kliniken kommer att göra det möjligt för kliniker att anpassa behandlingen för varje patient beroende på deras individuella B-cellsbörda.
ARG är särskilt användbart för att ta högupplösta bilder för att möjliggöra en mer exakt avgränsning av den rumsliga placeringen av spårämnesbindning i små regioner som hjärnstammen och lillhjärnan. Samma snitt och/eller intilliggande snitt kan sparas för immunhistokemiska infärgningar för att bekräfta förekomsten av B-celler. Vi har tidigare färgat CNS-vävnader med CD45R/B220 (tilläggsfigur S1) för att korrelera antalet B-celler med PET- och ARG-signal 5,9. Färgningen kan sedan jämföras rumsligt med ARG-resultaten för att verifiera att radiotracersignalen matchar färgningsmönstret. B-celler kan finnas i kluster eller diffust i hela hjärnstammen; PET-känsligheten är tillräckligt hög för att mäta signalen, vilket är uppmuntrande för klinisk translation. För ryggmärgs-ARG säkerställer avlägsnandet av ryggmärgen från kotorna att den uppmätta signalen beror på spårämnesbindning i ryggmärgsvävnaden snarare än benmärgen och/eller blodet, vilket kan skymma PET-bilder på grund av partiella volymeffekter.
I likhet med ARG möjliggör ex vivo gammaräkning kvantifiering av radioaktiva signaler i enskilda organ. För just denna teknik är det viktigt att mäta vävnadernas våtvikt och se till att de ligger i botten av sina respektive rör innan rören placeras i gammaräknaren. Rören måste märkas med musnummer och vävnad så att rätt rör används. Röret vägs sedan på en kalibrerad våg och organ förs in med en noggrannhet av en tiondels mikrogram (0,0001 mg). Vissa vävnader är extremt små och skillnaden i rörmassan före och efter kommer att vara i storleksordningen 0,0001 mg. Vävnaderna bör vägas omedelbart efter dissektion för att förhindra förlust av fukt, vilket resulterar i en lägre massa. Efter vägning bör hjärn- och ryggmärgsrören fyllas med PBS för att förhindra att de torkar ut innan dessa vävnader fryses för ARG.
Disclosures
CD19-antikroppen tillhandahölls av Horizon Therapeutics.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för stödet från SCi3-anläggningen för avbildning av smådjur vid Stanford och Dr. Frezghi Habte för hans tekniska assistans med PET/CT. LC-MS utförs av kärnpersonalen vid Stanford University Mass Spectrometry (SUMS) core facility och vi uppskattar personalen för att de tillhandahåller denna tjänst. Vi tackar Horizon Therapeutics för att de har varit mycket vänliga och tillhandahållit hCD19-mAb och Jodi Karnell i synnerhet för hennes tekniska vägledning och support. Detta arbete finansierades av NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter | MiliporeSigma | UFC505008 | centrifugal filter |
| 64Cu-CuCl3 | Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor | ||
| AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner | Eckert & Ziegler | AR-2000 | |
| Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
| Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only |
| Butterfly Needle Catheter | SAI Infusion Technologies | BLF-24 | |
| DOTA-NHS-ester | Macrocyclics | B-280 | |
| EAE Induction Kit | Hooke Laboratories | EK-2160 | |
| Geiger Counter | Ludlum | 14C | |
| GNEXT PET/CT Scanner | Sofie | GNEXT | |
| Hidex Automatic Gamma Counter | Hidex | AMG | |
| HPLC Column | Phenomenex | 00H-2146-K0 | 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm |
| Illustra NAP-5 column | Cytiva | 17085301 | DNA gravity column |
| Image J | NIH | ARG analysis software | |
| Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | PI90410 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840281400 | UV-Vis micro/nano-spectrophotometer |
| PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade | Eppendorf | 30124707 | |
| Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
| VivoQuant | Invicro | Version 4 Patch 3 | PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | PI89882 | Desalting column |
References
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).
- Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies. Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107 (2016).
- Stevens, M. Y., et al. Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275 (2020).
- Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke. Journal of Visualized Experiments. (136), e57243 (2018).
- Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein. European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).
- Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor. Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).
- James, M. L., et al. Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).
- Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
- Lyons, J. -A., et al. B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide. European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).
