Denna artikel beskriver metodik för radiomärkning av en humanspecifik anti-CD19 monoklonal antikropp och hur man använder den för att kvantifiera B-celler i centrala nervsystemet och perifera vävnader i en musmodell av multipel skleros med hjälp av in vivo PET-avbildning, ex vivo gammaräkning och autoradiografimetoder.
Multipel skleros (MS) är den vanligaste demyeliniserande sjukdomen i centrala nervsystemet (CNS) som drabbar unga vuxna, vilket ofta leder till neurologiska brister och funktionshinder när sjukdomen fortskrider. B-lymfocyter spelar en komplex och kritisk roll i MS-patologi och är målet för flera terapier i kliniska prövningar. För närvarande finns det inget sätt att exakt välja ut patienter för specifika anti-B-cellsterapier eller att icke-invasivt kvantifiera effekterna av dessa behandlingar på B-cellsbelastningen i CNS och perifera organ. Positronemissionstomografi (PET) har en enorm potential att ge mycket specifik, kvantitativ information om den spatiotemporala fördelningen och bördan av B-celler in vivo hos levande försökspersoner.
Denna artikel rapporterar metoder för att syntetisera och använda ett PET-spårämne specifikt för humana CD19+ B-celler i en väletablerad B-cellsdriven musmodell av MS, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), som induceras med humant rekombinant myelinoligodendrocytglykoprotein 1-125. Här beskrivs optimerade tekniker för att detektera och kvantifiera CD19+ B-celler i hjärnan och ryggmärgen med hjälp av PET-avbildning in vivo . Dessutom rapporterar denna artikel strömlinjeformade metoder för ex vivo gammaräkning av sjukdomsrelevanta organ, inklusive benmärg, ryggmärg och mjälte, tillsammans med högupplöst autoradiografi av CD19-spårämnesbindning i CNS-vävnader.
MS är en immunmedierad neurologisk sjukdom; Den unika presentationen hos varje patient kan göra hanteringen utmanande för både patienter och kliniker1. Själva sjukdomen kännetecknas av förekomst av demyeliniserande lesioner och infiltration av immunceller i hjärnan och ryggmärgen, vilket resulterar i fysisk och kognitiv försämring2. Det traditionella paradigmet att MS är en T-cellsmedierad sjukdom utmanades först i en banbrytande klinisk fas II-studie av rituximab3, en behandling som riktar sig mot CD20+ -undergruppen av B-celler. Ytterligare B-cellsterapier har sedan dess utvecklats som riktar sig mot CD194, en pan B-cellsbiomarkör som uttrycks på ett bredare spektrum av B-celler, vilket kan vara både diagnostiskt och terapeutiskt fördelaktigt. Dessutom ger befintliga metoder för att bedöma behandlingseffekten (dvs. övervakning av antalet skov och magnetisk resonanstomografi [MRT]-aktivitet) inte tidiga mått på svar, vilket utsätter patienter för betydande risk för CNS-skador på grund av suboptimalt val och optimering av behandling. Därför finns det ett kritiskt behov av strategier för att övervaka specifika immunceller, såsom CD19+ B-celler, i realtid i CNS och periferin hos MS-patienter.
PET-avbildning är en robust avbildningsteknik som möjliggör in vivo-visualisering av hela kroppen av ett givet mål av intresse, såsom CD19. Medan blodprover, register över återfallsfrekvenser och lesionsövervakning via MRT ger ögonblicksbilder av behandlingens effektivitet, kan PET-avbildning göra det möjligt för forskare och kliniker att övervaka effektiviteten av en behandling i hela kroppen. Detta proaktiva tillvägagångssätt för terapeutisk övervakning gör det möjligt för läkare att bedöma läkemedelseffektiviteten i realtid, vilket möjliggör snabba justeringar efter behov. Övervakning av placering och täthet av cellpopulationer associerade med sjukdom möjliggör också longitudinell bedömning av svårighetsgrad med hjälp av patientspecifik anatomisk information. Det är därför viktigt att etablera reproducerbara analysmetoder för att på ett tillförlitligt sätt utnyttja den fulla potentialen av PET-avbildning i kliniska och prekliniska miljöer.
Denna artikel beskriver metoder (figur 1) för att utföra PET-avbildning, ex vivo gammaräkning och autoradiografi (ARG) av CD19+ B-celler med en 64 Cu-märkt anti-human CD19 monoklonal antikropp (mAb), känd som 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), i den experimentella autoimmuna encefalomyelitmusmodellen (EAE) av MS inducerad i transgena möss som uttrycker human CD19 (hCD19) med användning av humant rekombinant myelinoligodendrocytglykoprotein 1-125 (MOG1-125). Vi tillhandahåller också metoder för att bedöma radiotracerbindning exakt och reproducerbart i hjärnan och ryggmärgen, båda kritiska platser för patogenes som ofta påverkas allvarligt i denna och andra neurodegenerativa modeller. Dessa tekniker möjliggör icke-invasiv undersökning av B-cellers roll i sjukdomspatologi och har potential att översättas kliniskt för att bedöma effekten av anti-B-cellsterapier vid MS.
Den här artikeln beskriver en strömlinjeformad metod för att avbilda human-CD19+ B-celler i en musmodell av MS med hjälp av CD19-PET. På grund av den heterogena presentationen av MS och varierande svar på behandlingar kan dess hantering i kliniken vara utmanande och det finns ett stort behov av nya metoder för val och övervakning av behandling. PET-avbildning kan fungera som ett kraftfullt verktyg för att övervaka sjukdomsprogression och individuellt svar på B-cellsutarmande behandling. Förutom MS kan CD19-PET-avbildning användas för att övervaka utarmning av B-celler efter behandling i subtyper av lymfom och leukemi eller andra B-cellsmedierade sjukdomar. Detta protokoll och representativa data visar nyttan av att avbilda B-celler vid neurologiska sjukdomar.
För att studera humana CD19+ B-celler i samband med MS valde vi B-cellsberoende MOG1-125 EAE modell7. I likhet med andra EAE-modeller uppvisar denna modell symtom på progressiv förlamning och infiltration av immunceller i CNS. MOG1-125-modellen är dock unik genom att den är en B-cellsdriven modell: möss innehåller varierande antal B-celler i subaraknoidalrummet i hjärnhinnorna, hjärnstammen, parenkymet och ventriklarna. Dessa lymfocyter kan vara glest utspridda i dessa regioner och/eller bilda follikelliknande strukturer, vilket också observeras hos människor med MS 8,9. Förutom att använda naiva möss som kontroller, kan ett komplett Freunds adjuvans (CFA)-induktionskit användas (dvs. en identisk induktionsemulsion som ges till EAE-möss utan MOG-proteinet). I EAE-musmodellen är blod-hjärnbarriären (BBB) dysfunktionell och tillåter större enheter, såsom antikroppar, att passera. CD19-mAb-radiotracern kommer endast att binda och stanna kvar i CNS om B-celler är närvarande; Spårämnet kommer att cirkulera tillbaka in i blodpoolen om B-celler inte är närvarande. Vi har demonstrerat detta med hjälp av gammaräkning och ex vivo autoradiografi av CNS-vävnader genom perfundering innan man mäter radioaktivitetsnivåerna i vävnaderna. Vi har också visat detta i tidigare publikationer som rapporterat användningen av mAb-baserade PET-radiotracers (dvs. immunoPET-avbildningsmetoder) för att detektera B-celler i CNS 1,2.
DOTA-kelatorn användes eftersom den har använts i klinisk PET-avbildning med koppar-64-märkta peptider och antikroppar, och vi strävar efter att översätta hCD19-mAb för klinisk avbildning av MS-patienter. DOTA har adekvat bindningsaffinitet till koppar-64 in vivo. Stabiliteten in vivo är mycket viktig eftersom fritt 64Cu går till levern och kan skymma signalen från bundet radiotracer. Därför är det viktigt att mäta signalen i levern för att beräkna den relativa signalen jämfört med andra organ. Muskler tas vanligtvis som en kontrollvävnad, men när det gäller EAE kan det finnas inflammation i musklerna. Halveringstiden för 64Cu är 12,7 timmar, vilket ger gott om tid för DOTA-hCD19-mAb att binda till sitt mål samtidigt som signalen kan mätas med PET. Vid beredning av konjugatet bör småskaliga (75-125 μg) testreaktioner utföras för att bestämma mängden DOTA som ska tillsättas till mAb för att producera det önskade DOTA/mAb-förhållandet (t.ex. kan en reaktion med 6-10-faldigt överskott av DOTA-NHS-ester per mol mAb ge ett konjugat på 1-2 DOTA/mAb). Reaktionstiden och temperaturen (t.ex. 2-4 timmar eller över natten vid 4 °C eller rumstemperatur) påverkar också DOTA/mAb-förhållandet och bör optimeras. En titrering med icke-radioaktiv koppar kan utföras för att beräkna antalet DOTA per mAb; Vi rekommenderar dock att du utför MALDI-MS och/eller LC-MS för mer tillförlitliga och exakta resultat.
Det beräknade DOTA/mAb-förhållandet är ett medelvärde för ett visst prov och en viss variation förväntas. För MALDI tas flera sprutor per prov för de konjugerade och okonjugerade mAbs. Vi beräknar sedan förhållandet mellan konjugerade och okonjugerade för att bestämma det genomsnittliga antalet DOTA/mAb. DOTA/mAb-förhållandet är viktigt eftersom för många kelatorer kommer att störa antikroppsbindningen och för få kommer att leda till inkonsekvent radiomärkning och låg signal. Förhållandet bör vara mycket nära mellan konjugatsatser för att upprätthålla konsekvent signalintensitet och bindningskinetik; Helst bör samma sats konjugat användas för alla experiment inom en viss studie. En lovande teknik för att minska potentiella effekter på immunreaktivitet på grund av eventuell överkonjugering är att använda platsspecifik konjugering10 där kelatorkonjugeringen är platsselektiv på antikroppens tunga glykaner, vilket garanterar tillsats av 1 kelator per mAb.
De radioaktiva reaktionsförhållandena bör optimeras för att säkerställa högsta märkningseffektivitet och utbyte eftersom skillnader i bland annat antikropp, DOTA/mAb-förhållande och 64Cu molaraktivitet kommer att påverka radiomärkningen. Genom att använda det optimala konjugatförhållandet på 64Cu till mAb kan det radioaktiva spårämnet användas utan rening, vilket minskar den tid som krävs för radiomärkning och förlust på grund av gravitationsflödeskolonnen och det radioaktiva sönderfallet. En konsekvent och tillförlitlig molaktivitet kan också uppnås när samma 64Cu till mAb-konjugatförhållande används, vilket är särskilt viktigt när man jämför resultat över flera kohorter av möss eller avbildningsstudier. ITLC-villkoren kan också ändras för att passa varje användare. Om rening är nödvändig bör en alikvot sparas för antingen HPLC- och/eller UV/Vis-spektrofotometri så att molaktiviteten kan beräknas.
Det är viktigt att notera att det kan vara utmanande att använda radioaktivt märkta antikroppar för avbildning. Det är viktigt att den antikropp som används för det radioaktiva spårämnet är biologiskt inert för att inte ha någon fysiologisk effekt. Dessutom, eftersom antikroppar har en lång uppehållstid i blodet, måste man vänta tillräckligt länge på cirkulation, bindning och eliminering av en given mAb för att säkerställa en lämplig signal-till-bakgrund utan att kompromissa med bildkvaliteten. Vanligtvis räcker det med att vänta i 20-48 timmar för en 64 Cu-märkt mAb, men man bör avbilda vid 2, 4, 6, 12, 24, 48 timmar efter injektion när man bedömer ett nytt mAb PET-spårämne för att bestämma den bästa tidpunkten för avbildning i en given gnagarmodell. Detsamma gäller för att hämta ARG-bilder med det högsta signal-till-bakgrundsförhållandet. De representativa bilderna i detta protokoll togs 18-20 timmar efter injektionen, även om andra tidpunkter kan användas beroende på vilken radioisotop som används. Olika antikroppar som binder till olika epitoper av CD19 kommer att ge varierande resultat och bör karakteriseras noggrant.
Vid analys av ryggmärgssignalen är det viktigt att placera möss på rygg i skanningsbädden för att minska rörelser orsakade av andningen. Dessutom kan ryggläge hjälpa till att räta ut ryggraden hos möss som har ökad ryggradskrökning på grund av utvecklingen av EAE-sjukdomen. En annan viktig aspekt att ta hänsyn till när man försöker detektera signal i ryggraden och ryggmärgen är att undvika att injicera MOG1-125 på flanken eftersom injektionsställena kan binda spårämnet på grund av det associerade immunsvaret i dessa områden. Närheten till injektionsstället kan störa ryggmärgsanalysen. Injektioner i bröstet är därför att föredra för den applikation som beskrivs här.
De bildanalystekniker som används är specifika för CNS-avbildning. Ett hjärnatlasverktyg i bildanalysprogrammet ger reproducerbara och tillförlitliga resultat så länge registreringen av PET och CT är korrekt. Genom att använda den halvautomatiska 3D-hjärnatlasen och justera den så att den passar skallen på varje mus kan man få en konsekvent avkastning på investeringen mellan djuren. Eftersom det för närvarande inte finns någon automatiserad eller halvautomatisk metod för att analysera signalen i ryggmärgen måste manuella ROI tas fram. Vid kvantifiering av CD19+ B-celler (eller någon celltyp som finns i både benmärgen och ryggmärgen) är det viktigt att eliminera signalen som kommer från ryggraden och benmärgen så mycket som möjligt. Anledningen till detta är att naiva möss är kända för att innehålla fler CD19+ B-celler i benmärgen än EAE-möss, där B-celler lämnar periferin för att infiltrera CNS 5,11. Denna benmärgssignal kan skymma den sanna signalen i ryggmärgen.
För att avgränsa den sanna ryggmärgssignalen och samtidigt minimera signalen från ryggraden och benmärgen, kan Otsu-trösklar av CT-bilden användas för att göra en oföränderlig ROI för ryggraden. En separat ryggmärgs-ROI kan sedan enkelt ritas i ryggraden. Samma teknik kan också användas för att mäta benmärgen i lårbenet. Detta är en mycket användbar metod för att få insikter om spårämnesbindning i ryggmärgen. På grund av den relativt låga rumsliga upplösningen hos PET och problem som rör den partiella volymeffekten vid skanning av små anatomiska regioner hos möss, möjliggör användning av ytterligare ex vivo-konfirmeringstekniker (t.ex. gammaräkning, ARG) validering av bindning av radioaktivt spårämne i ryggmärgen utan närvaro av blod, cerebrospinalvätska eller spillover-signal från ryggraden.
Signalen i hals-/bröstryggmärgen tenderar att variera hos EAE-mössen beroende på sjukdomens svårighetsgrad och hur många B-celler som infiltrerar under det adaptiva immunsvaret. Denna variation i antalet B-celler som infiltrerar, liksom den lilla mängden B-celler i CNS jämfört med de i bäckenet/ryggmärgen hos naiva möss, kan göra det svårt att kvantifiera ryggmärgsvävnad in vivo hos möss. Med tanke på den rumsliga upplösningen av PET vid avbildning av smådjur kan signalen från benmärgen spilla över på ryggmärgssignalen. Ex vivo biodistribution och autoradiografi som slutförts här hjälper till att validera PET-signalen från kotorna kontra ryggmärgsvävnaden. Möss perfunderas före dissektion för att avlägsna eventuella obundna spårämnen i blodpoolen så att gammaräknings- och autoradiograferingsresultaten återspeglar det spårämne som faktiskt är bundet i varje organ snarare än det spårämne som finns i blodpölen i det organet.
Radiotracers cirkulerar genom blodet, och när det gäller antikroppsspårämnen finns det ofta obundet radiotracer i blodet i flera veckor efter den första injektionen. Eftersom vi avbildar hjärnan och ryggmärgen, som har många blodkärl, är det viktigt att förstå vilken del av signalen som verkligen beror på spårämnesbindning i hjärna/vävnad av intresse jämfört med den som finns i blodpoolen. Det är därför nödvändigt att dela upp hjärnsignalen för signalen i hjärt-/blodpoolen. I den kliniska miljön kan samma bildanalystekniker för Otsu-trösklar av kotor och ROI av ryggmärgsvävnader användas för kvantifiering. Med tanke på de större vävnadsvolymerna hos människor jämfört med möss bör det vara betydligt mindre påverkan från partiella volymeffekter, vilket leder till förbättrad noggrannhet och eliminerar behovet av ex vivo-tekniker för att bekräfta in vivo-fynd. Användningen av PET på kliniken kommer att göra det möjligt för kliniker att anpassa behandlingen för varje patient beroende på deras individuella B-cellsbörda.
ARG är särskilt användbart för att ta högupplösta bilder för att möjliggöra en mer exakt avgränsning av den rumsliga placeringen av spårämnesbindning i små regioner som hjärnstammen och lillhjärnan. Samma snitt och/eller intilliggande snitt kan sparas för immunhistokemiska infärgningar för att bekräfta förekomsten av B-celler. Vi har tidigare färgat CNS-vävnader med CD45R/B220 (tilläggsfigur S1) för att korrelera antalet B-celler med PET- och ARG-signal 5,9. Färgningen kan sedan jämföras rumsligt med ARG-resultaten för att verifiera att radiotracersignalen matchar färgningsmönstret. B-celler kan finnas i kluster eller diffust i hela hjärnstammen; PET-känsligheten är tillräckligt hög för att mäta signalen, vilket är uppmuntrande för klinisk translation. För ryggmärgs-ARG säkerställer avlägsnandet av ryggmärgen från kotorna att den uppmätta signalen beror på spårämnesbindning i ryggmärgsvävnaden snarare än benmärgen och/eller blodet, vilket kan skymma PET-bilder på grund av partiella volymeffekter.
I likhet med ARG möjliggör ex vivo gammaräkning kvantifiering av radioaktiva signaler i enskilda organ. För just denna teknik är det viktigt att mäta vävnadernas våtvikt och se till att de ligger i botten av sina respektive rör innan rören placeras i gammaräknaren. Rören måste märkas med musnummer och vävnad så att rätt rör används. Röret vägs sedan på en kalibrerad våg och organ förs in med en noggrannhet av en tiondels mikrogram (0,0001 mg). Vissa vävnader är extremt små och skillnaden i rörmassan före och efter kommer att vara i storleksordningen 0,0001 mg. Vävnaderna bör vägas omedelbart efter dissektion för att förhindra förlust av fukt, vilket resulterar i en lägre massa. Efter vägning bör hjärn- och ryggmärgsrören fyllas med PBS för att förhindra att de torkar ut innan dessa vävnader fryses för ARG.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för stödet från SCi3-anläggningen för avbildning av smådjur vid Stanford och Dr. Frezghi Habte för hans tekniska assistans med PET/CT. LC-MS utförs av kärnpersonalen vid Stanford University Mass Spectrometry (SUMS) core facility och vi uppskattar personalen för att de tillhandahåller denna tjänst. Vi tackar Horizon Therapeutics för att de har varit mycket vänliga och tillhandahållit hCD19-mAb och Jodi Karnell i synnerhet för hennes tekniska vägledning och support. Detta arbete finansierades av NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).
0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter | MiliporeSigma | UFC505008 | centrifugal filter |
64Cu-CuCl3 | Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor | ||
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner | Eckert & Ziegler | AR-2000 | |
Autoradiography cassette | Cole Palmer | EW-21700-34 | Aluminum, 8" x 10" |
Autoradiography film | GE Life Sciences | 28-9564-78 | Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only |
Butterfly Needle Catheter | SAI Infusion Technologies | BLF-24 | |
DOTA-NHS-ester | Macrocyclics | B-280 | |
EAE Induction Kit | Hooke Laboratories | EK-2160 | |
Geiger Counter | Ludlum | 14C | |
GNEXT PET/CT Scanner | Sofie | GNEXT | |
Hidex Automatic Gamma Counter | Hidex | AMG | |
HPLC Column | Phenomenex | 00H-2146-K0 | 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm |
Illustra NAP-5 column | Cytiva | 17085301 | DNA gravity column |
Image J | NIH | ARG analysis software | |
Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | PI90410 | |
NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840281400 | UV-Vis micro/nano-spectrophotometer |
PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade | Eppendorf | 30124707 | |
Typhoon phosphor imager 9410 | GE Healthcare | 8149-30-9410 | |
VivoQuant | Invicro | Version 4 Patch 3 | PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | PI89882 | Desalting column |