Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die differentielle Zentrifugation zur Isolierung und Charakterisierung repräsentativer EVs (Exosomen und Mikrovesikel) aus kultivierten humanen MSCs. Weitere Anwendungen dieser Elektrofahrzeuge werden ebenfalls in diesem Artikel erläutert.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind heterogene Membran-Nanopartikel, die von den meisten Zelltypen freigesetzt werden, und sie werden zunehmend als physiologische Regulatoren der organismischen Homöostase und wichtige Indikatoren für Pathologien anerkannt. In der Zwischenzeit zeichnet sich ihr immenses Potenzial ab, zugängliche und kontrollierbare Krankheitstherapeutika zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) können große Mengen an EVs in Kultur freisetzen, die eine effektive Geweberegeneration ankurbeln und umfangreiche therapeutische Anwendungen mit guter Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit ermöglichen. Es besteht eine wachsende Nachfrage nach einfachen und effektiven Protokollen für die Erfassung und Anwendung von MSC-EVs. Hier wird ein detailliertes Protokoll basierend auf der differentiellen Zentrifugation bereitgestellt, um repräsentative EVs aus kultivierten humanen MSCs, Exosomen und Mikrovesikeln für weitere Anwendungen zu isolieren und zu charakterisieren. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode wird für eine Reihe von nachgelagerten Ansätzen wie Markierung, lokale Transplantation und systemische Injektion gezeigt. Die Implementierung dieses Verfahrens wird dem Bedarf an einer einfachen und zuverlässigen Erfassung und Anwendung von MSC-EVs in der translationalen Forschung Rechnung tragen.
Introduction
Stammzellen sind undifferenzierte pluripotente Zellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit und translationalem Potenzial1. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) lassen sich im Labor leicht isolieren, kultivieren, expandieren und aufreinigen, was für Stammzellen auch nach mehreren Passagen charakteristisch bleibt. In den letzten Jahren hat sich die Evidenz für die Ansicht verdichtet, dass MSCs in therapeutischer Anwendung parakrin wirken 2,3. Insbesondere die Sekretion extrazellulärer Vesikel (EVs) spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der biologischen Funktionen von MSCs. Als heterogene membranöse Nanopartikel, die von den meisten Zelltypen freigesetzt werden, bestehen EVs aus Unterkategorien, die als Exosomen (Exos), Mikrovesikel (MVs) und noch größere apoptotische Körper bezeichnet werden 4,5. Unter ihnen ist Exos mit einer Größe von 40-150 nm das am besten untersuchte EV, das endosomalen Ursprungs ist und unter physiologischen Bedingungen aktiv sezerniert wird. MVs werden durch Abstoßen direkt von der Oberfläche der Zellplasmamembran mit einem Durchmesser von 100-1.000 nm gebildet, die sich durch eine hohe Expression von Phosphatidylserin und eine hohe Expression von Oberflächenmarkern von Spenderzellen auszeichnen6. EVs enthalten RNA, Proteine und andere bioaktive Moleküle, die ähnliche Funktionen wie die Elternzellen haben und eine wichtige Rolle bei der Zellkommunikation, der Immunantwort und der Reparatur von Gewebeschäden spielen7. MSC-EVs wurden in der regenerativen Medizin umfassend als leistungsfähiges zellfreies therapeutisches Werkzeug untersucht8.
Die Isolierung und Reinigung von MSC-abgeleiteten Elektrofahrzeugen ist ein häufiges Problem im Bereich der Forschung und Anwendung. Gegenwärtig sind die Differential- und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation9, der Ultrafiltrationsprozess 10, die immunmagnetische Trennung 11, der molekulare Ausschlusschromatograph12 und der mikrofluidische Chip13 weit verbreitete Methoden zur Isolierung und Reinigung von EVs. Bei den Vor- und Nachteilen der einzelnen Ansätze können die Menge, Reinheit und Aktivität der gesammelten Elektrofahrzeuge nicht gleichzeitig erfüllt werden14,15. In der vorliegenden Arbeit wird das differentielle Zentrifugationsprotokoll zur Isolierung und Charakterisierung von EVs aus kultivierten MSCs im Detail gezeigt, das eine effiziente therapeutische Nutzung unterstützt hat 16,17,18,19,20. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für eine Reihe von nachgelagerten Ansätzen, wie z. B. Fluoreszenzmarkierung, lokale Transplantation und systemische Injektion, wurde ebenfalls beispielhaft dargestellt. Die Implementierung dieses Verfahrens wird dem Bedarf an einer einfachen und zuverlässigen Sammlung und Anwendung von MSC-EVs in der translationalen Forschung Rechnung tragen.
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Protocol
Alle Tierverfahren wurden vom Komitee für Tierpflege und -nutzung der Vierten Militärmedizinischen Universität genehmigt und in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Es wurden acht Wochen alte C57Bl/6-Mäuse (keine Präferenz für Weibchen oder Männchen) verwendet. Kryokonservierte MSCs aus menschlicher Nabelschnur (UCMSCs), die für die vorliegende Studie verwendet wurden, stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die Verwendung menschlicher Zellen wurde von der Ethikkommission der Vierten Medizinischen Militäruniversität genehmigt.
1. Kultur humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSCs)
- Bereiten Sie das für die experimentelle Arbeit erforderliche Zubehör und Lösungen vor, einschließlich Pipetten, Pipettenspitzen, 10-cm-Petrischale, Thermostatausrüstung (Wasserbad), Gummihandschuhe, 75%iger Alkohol, Nährmedium (inkubiert bei 37 °C), tödliches Kälberserum (FBS) und 100-fache Penicillin-Streptomycin (P/S)-Lösung (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie kommerziell erhältliches Alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) vor, indem Sie es mit 20 % FBS und 1 % P/S ergänzen.
Anmerkungen: Verdünnen Sie alle Lösungen, die für die Isolierung und Analyse von Elektrofahrzeugen verwendet werden, in hochreinem gefiltertem Wasser, das vom Reinstfilterwasserreinigungssystem hergestellt wird (siehe Materialtabelle). - Rückgewinnung der kryokonservierten MSCs aus der menschlichen Nabelschnur (UCMSCs) aus dem flüssigen Stickstoff, indem sie in einem 37 °C warmen Wasserbad geschmolzen werden.
- Die geschmolzene Zellsuspension wird schnell und schonend in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Nährmedium überführt (Schritt 1.2). Bei 4 °C, 500 x g für 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Pipette und halten Sie den Zellausfall zurück. Geben Sie 2 ml Nährmedium in das Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig.
- Säen Sie die Zellen in eine 10-cm-Petrischale und fügen Sie 8 ml Nährmedium zu insgesamt 10 ml hinzu.
- Kultivieren Sie MSCs bei 37 °C in 5% CO2 im Zellinkubator.
2. Differentialzentrifugation zur Isolierung von Exos und MVs
- Wenn die MSCs auf >90 % Konfluenz anwachsen, ersetzen Sie das Nährmedium durch α-MEM, das mit 20 % EV-depletiertem FBS und 1 % P/S für 8 ml jeder Schale ergänzt wird.
Anmerkungen: Zentrifugieren Sie FBS bei 4 °C, 1,50,000 x g über Nacht, um EVs und andere Verunreinigungen zu entfernen. - Nach 48 Stunden Kultur wird das Nährmedium (Schritt 2.1) in 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt.
- Zentrifugieren Sie das MSC-Nährmedium bei 4 °C, 800 x g für 10 min.
- Entfernen Sie die Zellfragmente und Zelltrümmer, indem Sie den Überstand in saubere konische 1,5-ml-Röhrchen übertragen.
HINWEIS: Die Verwendung von konischen 1,5-ml-Röhrchen ist erforderlich, um die EV-Ausbeute zu erhöhen. - Den Überstand bei 4 °C, 16.000 x g für 30 min zentrifugieren. Das Pellet besteht aus MVs. MVs aus jeder Zellschale wurden mit 50 μl PBS resuspendiert.
- Der durch Zentrifugation in Schritt 2.5 erhaltene Überstand wird mit einer Pipette in die gereinigten Ultrazentrifugenröhrchen übertragen. Bei 1,50,000 x g für 2 h bei 4 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie den Rest, bei dem es sich um Exos handelt. Resuspendieren Sie Exos aus sieben Zellschalen in 50 μl PBS.
HINWEIS: Die UCMSCs mit sechstem Durchgang werden für die EV-Isolierung verwendet. Um genügend MVs und Exos für den experimentellen Einsatz zu erhalten, werden in der Regel 7-8 Schalen mit kultivierten Zellen benötigt. Die EV-Proben werden sofort für die folgenden Charakterisierungsschritte oder für therapeutische Anwendungen verwendet, die besser nicht gelagert werden.
ACHTUNG: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Elektrofahrzeugen, und lagern Sie Elektrofahrzeuge am besten kurzfristig bei 4 °C und nicht bei -80 °C.
3. Detektion von Partikelanzahl und Größenverteilung von EVs aus MSCs
HINWEIS: Für die Bewertung der Größenverteilung wird die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) mit einem handelsüblichen Nanopartikel-Tracking-Analysator durchgeführt (siehe Materialtabelle).
- Verdünnen Sie 1 μl EVs (aus Schritt 2.5 und Schritt 2.7) in 1.499 μl PBS und mischen Sie genug in einem 15-ml-Röhrchen.
- Betreiben Sie den Tracking-Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Starten Sie zunächst die kompatible Software (siehe Materialtabelle).
- Füllen Sie die Probenzelle mit destilliertem Wasser und lassen Sie das Gerät dann mit der Zellprüfung beginnen.
- Kalibrieren Sie das Gerät mit einer vorbereiteten Standardlösung. Stellen Sie sicher, dass die Partikelanzahl, die auf der Software-Erkennungsschnittstelle angezeigt wird, zwischen 50 und 400 liegt (vorzugsweise etwa 200). Klicken Sie auf OK.
Anmerkungen: Bereiten Sie die Standardlösung vor, indem Sie 1 μl Kalibrierlösung (siehe Materialtabelle) in 1 ml destilliertem Wasser rekonstituieren, um eine primäre Lösung zu erzeugen, und nehmen Sie dann 100 μl der primären Lösung und fügen Sie 25 ml destilliertes Wasser hinzu, um eine Standardlösung (1:250.000) herzustellen. Lagern Sie dieses Arbeitsreagenz eine Woche lang bei 4 °C. - Spülen Sie die Probenzelle mit 5 ml destilliertem Wasser aus.
- Spülen Sie den Kanal vor der Probenanalyse mit 1 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die auf der Software-Erkennungsschnittstelle angezeigte Partikelanzahl kleiner als 10 ist.
- Injizieren Sie 1 ml der in Schritt 3.1 vorbereiteten EV-Probe. Führen Sie den Vesikeltest gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts durch.
VORSICHT: Die Probe und das destillierte Wasser werden mit einer 1-ml-Spritze mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,5 ml/s unter sorgfältiger manueller Kontrolle injiziert.
4. Charakterisierung der EV-Morphologie mittels Transmissionselektronenmikroskop (TEM)
- Verdünnen Sie 1 μl EVs aus Schritt 2.7 mit 199 μl PBS und mischen Sie ausreichend. Geben Sie 20 μl EV-Suspensionstropfen in das formvar/kohlenstoffbeschichtete quadratische Netz (siehe Materialtabelle) und lassen Sie es 3 Minuten lang einwirken.
- Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Filterpapier und lassen Sie sie 15 Sekunden einwirken, um die Oberfläche leicht zu trocknen.
- Negativfärbung von EV-Proben mit 1,5 % Phosphowolframsäuretröpfchen für 40 s.
- Entfernen Sie die überschüssige Phosphowolframsäure und lassen Sie sie 15 s stehen, um die Oberfläche leicht zu trocknen.
- Geben Sie die Probe mit formvar/kohlenstoffbeschichtetem quadratischem Netz in eine saubere, mit Filterpapier bedeckte Schale. Beobachten und erfassen Sie Bilder mit einem Transmissionselektronenmikroskop.
HINWEIS: In diesem Prozess werden Exos als Beispiel genommen.
5. Kennzeichnung von aus MSCs abgeleiteten Elektrofahrzeugen
- Nach der Extraktion der EVs (Schritt 2.5) mit 250 μl PBS in einem konischen 1,5-ml-Röhrchen resuspendieren.
- Verwenden Sie ein weiteres konisches 1,5-ml-Röhrchen zur Herstellung der Arbeitslösung des PKH26-Farbstoffs. Verwenden Sie 1 μl PKH26-Markierungsreagenz, verdünnt mit 250 μl Verdünnungsmittel C (eine Komponente des kommerziell erhältlichen EV-Markierungskits, das für die vorliegende Studie verwendet wurde, siehe Materialtabelle).
Anmerkungen: Bereiten Sie die Arbeitslösung unmittelbar vor Gebrauch vor.
VORSICHT: Bei übermäßigem PKH26-Farbstoff oder -Kennzeichnung ohne Vorverdünnung besteht die Gefahr, dass die EVs beschädigt werden. - Mischen Sie die resuspendierten Elektrofahrzeuge mit der Arbeitslösung. Lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen und fügen Sie dann 500 μl EV-abgereichertes FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
- Bei MVs bei 4 °C, 16.000 x g für 30 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Rückstände zu spülen.
- Bei 4 °C, 16.000 x g für 30 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen, um den ungebundenen Farbstoff zu entfernen.
- Resuspendieren Sie den Rückstand mit 200 μl PBS. Geben Sie 20 μl Suspension auf den Objektträger und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
HINWEIS: In diesem Prozess werden MVs als Beispiel genommen.
6. Lokale Transplantation und systemische Injektion von MSC-EVs
Anmerkungen: Legen Sie die EVs bei den folgenden Verfahren vor der Injektion auf Eis.
- Führen Sie eine lokale Transplantation durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Betäuben Sie die Mäuse mit 4% (vol/vol) Isofluran. Halten Sie die Anästhesie während des Eingriffs bei 1%-3% Isofluran.
- Verabreichen Sie vor der Operation 5 mg/kg Carprofen (IP) zur Analgesie, um die Schmerzen nach dem Eingriff zu minimieren.
- Rasieren Sie vor der Wundentfernung das Rückenhaar und sterilisieren Sie die Rückenfläche, indem Sie abwechselnd 3 Runden von 10 % Povidon-Jod und 75 % Ethanol auftragen.
- Erzeugen Sie mit einer Biopsiestanze ( siehe Materialtabelle) eine Wunde mit einem Durchmesser von 1 cm in voller Dicke auf der Rückenhaut.
- Resuspendieren Sie die MSC-abgeleiteten EVs aus zwei Schalen in 100 μl PBS und verabreichen Sie die Injektion in die subkutane Schicht des Wundbetts, um jede Wunde mit vier Stellen.
HINWEIS: Es werden durchschnittlich 100 μg EVs pro Maus (EVs aus zwei 10-cm-Zellschalen) injiziert. Zehn 10-cm-Schalen mit MSCs werden benötigt, um genügend EVs zu liefern, um ein Experiment von n = 5 in einem Mausmodell durchzuführen. - Wickeln Sie die Mäuse nach der Behandlung mit steriler Gaze ein und legen Sie sie bis zum Aufwachen auf Wärmedämmkissen (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben. Bringen Sie die Mäuse erst dann in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn sie sich vollständig erholt haben.
- Verabreichen Sie je nach Bedarf zusätzliche Dosen der Analgesie an Tag 2 und Tag 3 nach der Operation.
- Führen Sie eine systemische Injektion durch.
- Resuspendieren Sie MSC-abgeleitete EVs in 200 μl PBS und mischen Sie sie dann mit Heparinlösung in einem Volumenverhältnis von 10:1.
- Setzen Sie die Mäuse in das Bildgebungssystem der Schwanzvene ein (siehe Materialtabelle). Drücken Sie den Schalter, um den Hebel anzuheben.
- Desinfizieren Sie die Schwanzvene vor der intravenösen Injektion mit einem Alkoholpad. Dann injizieren Sie den Mäusen systematisch die in Schritt 6.2.1 hergestellte Suspension durch die Schwanzvene. Das Verfahren wird von einem Schwanzvenen-Illustrator unterstützt.
Anmerkungen: Injizieren Sie die EV-Suspension sofort nach dem Mischen mit Heparin. Durchschnittlich werden 100 μg EVs pro Maus (EVs aus zwei 10-cm-Zellschalen) injiziert. Zehn 10-cm-Schalen mit MSCs werden benötigt, um genügend EVs zu liefern, um ein Experiment von n = 5 in einem Mausmodell durchzuführen.
ACHTUNG: Die Injektion von Schwanzvenen aus Mäusen ist in der Regel auf ein Volumen von 200 μl begrenzt. Die Injektion sollte langsam erfolgen und aufhören, wenn Sie eine Beule oder einen Widerstand sehen, was darauf hindeutet, dass die Nadel aus der Vene heraus ist. Wenn die Mäuse unerwünschte klinische Symptome wie Kräuseln und Zittern zeigen, könnte dies eine Schockreaktion auf eine großvolumige Injektion, eine schnelle Injektion oder Toxizität/Anaphylaxie sein.
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Representative Results
MVs und Exos aus kultivierten humanen UCMSCs werden nach dem experimentellen Workflow isoliert (Abbildung 1). Die NTA-Ergebnisse zeigen, dass die Größe von Exos aus humanen MSCs von 40 nm bis 335 nm mit einer Peakgröße von etwa 100 nm und die Größe von MVs von 50 nm bis 445 nm mit einer Peakgröße von 150 nm reicht (Abbildung 2). Die morphologische Charakterisierung von MSC-abgeleiteten Exos zeigt eine typische Schalenform (Abbildung 3). EVs werden effizient durch PKH26 markiert, was sowohl in der Bruttoansicht als markierte Pellets als auch durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wird (Abbildung 4). Lokale und systemische Injektionen von MSC-abgeleiteten EVs werden um die Hautwunde herum oder durch die Schwanzvene durchgeführt (Abbildung 5). So werden die Exos und MVs erfolgreich isoliert und für nachfolgende Experimente eingesetzt.
Abbildung 1: Isolierung von MVs und Exos aus kultivierten humanen MSCs. Nährmedien werden gesammelt und eine Differentialzentrifugation durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: NTA-Analyse von Exos und MVs von MSCs. Dargestellt wird die Partikelgrößenverteilung mit repräsentativen Bildern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung der Morphologie von Exos aus MSCs mittels TEM. Becherförmige Exos werden angezeigt. Maßstabsbalken: 200 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Markierung von MSC-abgeleiteten MVs durch PKH26. PKH26-markierte MV-Pellets werden grob beobachtet und unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Maßstabsleiste: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Verabreichung von MSC-abgeleiteten Elektrofahrzeugen. (A) Lokale Transplantation um die Hautwunde herum und (B) Systemische Injektion über die Schwanzvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
EVs spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Aktivitäten, darunter die Präsentation von Antigenen, der Transport von genetischem Material, die Modifikation der Zellmikroumgebung und andere. Darüber hinaus bringt ihre breite Anwendung neue Ansätze und Möglichkeiten für die Diagnose und Behandlung von Krankheitenmit sich 21. Die Implementierung therapeutischer Anwendungen von EVs basiert auf der erfolgreichen Isolierung und Charakterisierung. Aufgrund des Fehlens standardisierter Isolations- und Reinigungsmethoden und der geringen Extraktionseffizienz wurde die EV-Forschung jedoch behindert. In diesem Artikel wird hauptsächlich ein leicht durchführbares Extraktions- und Charakterisierungsprotokoll von EVs aus kultivierten humanen MSCs und weitere Anwendungen vorgestellt, das markiert und verwendet werden kann, um die Gewebereparatur durch lokale Injektion zu fördern und systemische Erkrankungen durch intravenöse Injektion zu behandeln. Die Reproduzierbarkeit von MSCs für die EV-Isolierung wird durch die Verwendung des neonatalen Ursprungs der UCMSCs, der Standardkultur der Zellen und des Verzichts auf späte Passagen erhalten. Obwohl die Begriffe Exos und MVs in diesem Manuskript jeweils verwendet werden, um sich auf EVs zu beziehen, die aus unterschiedlichen Zentrifugationsgeschwindigkeiten gewonnen wurden, werden in zukünftigen Studien weitere Assays benötigt, um ihre Herkunft zu unterscheiden, wie es in der Leitlinie Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV2018)22 empfohlen wird, z. B. durch Live-Cell-Imaging zur Beobachtung des Produktionsprozesses und durch Immunelektronenmikroskop zum Nachweis der spezifischen Marker. Insgesamt ist die Methode einfach und daher leicht skalierbar und reproduzierbar, was für das Feld nützlich sein wird.
In der vorliegenden Studie werden physiologische EVs aus MSCs durch differentielle Zentrifugation und Ultrazentrifugation schrittweise in MVs und Exos getrennt. Hier wird die Bedeutung des Ersatzes von α-MEM, ergänzt durch 20% EV-depletiertes FBS, für die Sammlung des Nährmediums betont. Dieser Schritt stellt sicher, dass die extrahierten Elektrofahrzeuge nur von MSCs stammen, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass Elektrofahrzeuge von anderen störenden Substanzen stammen könnten. Es ist auch wichtig, vor der systemischen Injektion 10%ige Heparinlösung in die EV-Lösung zu mischen. In den letzten Jahren haben mehrere Studien gezeigt, dass EVs eine gerinnungsfördernde Wirkung haben, so dass die Zugabe von Heparin während der systemischen Injektion notwendig ist, um die Bildung von Thromben nach der Injektion zu vermeiden, die sonst zu einer akuten Letalität der Mäuse führt23. Möglicherweise gibt es bei dieser Protokollimplementierung einige Probleme, die behoben werden müssen. Ein prominentes Beispiel: Wenn die Extraktionsmenge von EVs nicht ausreicht, sollten die Forscher sie auf den Schritt der Zellüberstandssammlung zurückführen. Während der Überstandsentnahme müssen die Zellen gleichmäßig geblasen werden, um die freigesetzten EVs, die in der extrazellulären Matrix der MSCs zurückgehalten werden, vollständig zu sammeln. Ein weiterer potenzieller Fehler tritt auf, wenn Mäuse kurz nach der Injektion von Elektrofahrzeugen sterben. Neben der Zugabe von Heparin vor der Injektion, wie oben erwähnt, muss die Konzentration der injizierten EVs (durchschnittlich 100 μg EVs pro Maus) angepasst werden. Um den Erfolg der Injektion zu überprüfen, kann eine In-vivo-Bildgebung der Bioverteilung von fluoreszenzmarkierten EVs oder gefrorenen Schnitten bestimmter Gewebestellen (Leber, Milz usw.) durchgeführt werden, über die bereits berichtet wurde24. Außerdem wird empfohlen, EVs so schnell wie möglich nach der Isolierung zu verwenden, und das Einfrieren der Lagerung führt zu Partikelverlust, Reinheitsminderung und Fusionsphänomenen, die zu Artefaktpartikeln führen25. Außerdem erhöht die allgemein angenommene PKH26-Kennzeichnung die EV-Größe26, und andere Kennzeichnungsmethoden können zum Vergleich verwendet werden.
Die bestehenden Protokolle zur Isolierung von EVs werden hauptsächlich wie folgt angegeben: Differential- und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation9, Ultrafiltrationsverfahren10, immunmagnetische Trennung 11, molekularer Ausschlusschromatograph 12, Mikrofluidik-Chip 13 und polymerbasierte Fällungstechnologie27. Im Vergleich zur Ultrazentrifugation ist das Ultrafiltrationsverfahren eine bequeme Extraktionsmethode und förderlich für die Anreicherung von EVs in großvolumigen Proben 9,10, während der Nachteil darin besteht, dass es zu einer Membranverschmutzung kommt, die leicht zu Probenverlusten führen kann. Die immunmagnetische Trennung eignet sich zur Trennung verschiedener Subtypen von EVs, und die erhaltenen EVs weisen eine hohe Reinheit auf. Der Nachteil dieser Methode sind die hohen Kosten bei geringer Ausbeute11. Die durch molekularen Ausschlusschromatographen getrennten EVs haben eine hohe Reinheit und eine hohe Ausbeute. Der Nachteil besteht darin, dass spezielle Geräte erforderlich sind und nicht für mehrere Proben gleichzeitig verwendet werden können12. Mikrofluidische Chips stellen hohe Anforderungen an Materialien und Technologie, sind mit hohen Kosten verbunden, und es ist schwierig, große Probenzu verarbeiten 13. Die EVs, die durch polymerbasierte Fällungstechnologie getrennt werden, enthalten Nicht-EV-Verunreinigungen, die die EV-Aktivität beeinflussen14. Unter ihnen ist die Differentialzentrifugation und Ultrazentrifugation nach wie vor die am weitesten verbreitete Methode zur Trennung und Reinigung von EVs und gilt als Goldstandard für die MSC-EV-Extraktion. Die Trennung und Anreicherung von EVs aus MSC-Nährmedien erfolgt Schritt für Schritt durch die Kombination unterschiedlicher Zentrifugationszeiten und -geschwindigkeiten, was eine optimierte Methode darstellt. Es ist bemerkenswert, dass Exos und MVs, die in diesem Manuskript isoliert wurden, ähnliche Größenverteilungen aufweisen, obwohl MVs tendenziell größer sind, was auf eine differentielle Zentrifugation zurückzuführen sein könnte, die dazu neigt, eine Aggregation von Nanopartikeln zu induzieren. Obwohl modifizierte Verfahren bei der Größenerhaltung von EVs besser abschneiden können, ist die differentielle Zentrifugation vorteilhaft in Bezug auf einen hohen Wirkungsgrad für die EV-Trennung28. Obwohl diese Methode für die Großserienproduktion von Elektrofahrzeugen und die GMP-Produktion durch die Menge der Medien, die in einem Isolationslauf verarbeitet werden können, begrenzt ist, ist das technische System einfach einzurichten und wurde in translationalen Projekten an Großtieren angewendet29,30. Wie auch immer, die oben genannten Trennmethoden haben ihre Vor- und Nachteile, und die Forscher können die geeignete Methode entsprechend den verschiedenen Quellen von EVs und dem Forschungsziel auswählen.
In den letzten Jahren haben Elektrofahrzeuge ein großes Potenzial für klinische Anwendungen gezeigt, z. B. für die Diagnosevon Krankheiten 31, die Behandlung und als Träger der Medikamentenabgabe32,33. Aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften haben verschiedene Länder EVs als Therapeutika umfassend untersucht. In diesem Zusammenhang wurden Studien zu EVs in der Krankheitsbehandlung und dem Mechanismus, der der Rolle von EVs in der Pathogenese der Krankheit zugrunde liegt, durchgeführt. Das aktuelle Protokoll der Isolierung, Charakterisierung und therapeutischen Anwendung von EVs aus kultivierten MSCs wurde gut angewendet. So fördert beispielsweise die lokale Verabreichung von MSC-Exos in Hautwunden die Heilung durch Entzündungsmodulation, und die Schwanzveneninjektion von MSC-abgeleiteten EVs kann die hepatische Insulinresistenz und Steatose bei Diabetes mellitus Typ24 verbessern. Darüber hinaus zeichnen sich therapeutische Anwendungen ab, die eine höhere Ausbeute und Reinheit von MSC-EVs beinhalten, um praktikable translationale Strategien zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 und 82170988) und der China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 und BX20190380) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung des National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) und des Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center der Air Force Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al.
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F.
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
