Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Aversiv assosiativ læring og minnedannelse ved å parre to kjemikalier i Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Vi har tidligere utviklet protokoller for Caenorhabditis elegans for å danne kort- og langsiktige assosiative minner ved henholdsvis masse- og avstandstrening. Her beskrives detaljerte protokoller for kondisjonering av C. elegans ved å parre henholdsvis 1-propanol og saltsyre som betinget og ubetinget stimuli for å danne aversiv assosiativ hukommelse.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans er en attraktiv modellorganisme for å studere læring og minne på molekylære og cellulære nivåer på grunn av enkelheten i nervesystemet, hvis kjemiske og elektriske koblingsskjemaer ble fullstendig rekonstruert fra serielle elektronmikrografer av tynne seksjoner. Her beskriver vi detaljerte protokoller for kondisjonering av C. elegans ved masse- og avstandstrening for dannelse av henholdsvis korttidshukommelse (STM) og langtidsminne (LTM). Ved å parre 1-propanol og saltsyre som henholdsvis betinget og ubetinget stimuli, ble C. elegans vellykket trent til å danne aversiv assosiativ STM og LTM. Mens naive dyr ble tiltrukket av 1-propanol, var de trente dyrene ikke lenger eller veldig svakt tiltrukket av 1-propanol. Som i andre organismer som Aplysia og Drosophila, spiller "læring og minnegener" viktige roller i minnedannelse. Spesielt er NMDA-type glutamatreseptorer, uttrykt i bare seks par interneuroner i C. elegans, nødvendig for dannelsen av både STM og LTM, muligens som en tilfeldighetsfaktor. Derfor kan minnesporet ligge blant interneuronene.

Introduction

Læring og hukommelse er avgjørende for at dyr skal overleve og reprodusere seg ved å navigere effektivt i skiftende miljøer. C. elegans er en attraktiv modellorganisme for å studere læring og minne på molekylære og cellulære nivåer på grunn av enkelheten i nervesystemet, hvis kjemiske og elektriske koblingsskjemaer ble fullstendig rekonstruert fra serielle elektronmikrografer av tynne seksjoner 1,2,3.

C. elegans lærer å assosiere dyrkingstemperatur med sult og migrerer bort fra veksttemperaturen med et aversivt minne som varer i flere timer 4,5. Kondisjonering av C. elegans med natriumklorid (NaCl) i fravær av mat fører til en reduksjon i kjemotaksis mot NaCl 6,7,8. Når parret med mat, er butanon attraksjon forbedret som et resultat av appetittvekkende læring 9,10,11. Selv om disse fenomenene tolkes som assosiativ læring og hukommelse 10,12, er skillet mellom assosiativ læring og ikke-assosiativ sensibilisering, tilvenning og tilpasning ikke klart i C. elegans lærings- og minneparadigme13,14. Faktisk viste dyr betinget med butanon og matmangel (aversiv kondisjonering) deprimert kobling av butanon sensorisk nevron AWC ON for å målrette nevroner ved insulinsignaler fra andre nevroner, inkludert AIA interneuroner, mens dyr betinget med butanon og mat (appetitiv kondisjonering) viste forbedret kobling av AWCON for å målrette nevroner15 . Insulinsignaliseringen forårsaker genuttrykksendringer indusert av nukleær EGL-4 og andre transkripsjonsregulatorer16,17. Dermed har denne aversive og appetitive læringen og minnet analogier med henholdsvis ikke-assosiativ habituation og sensibilisering av presynaptiske sensoriske nevroner i gill-tilbaketrekningsrefleksen i Aplysia18,19.

Ved å koble to kjemikalier som betinget stimulus (CS) og ubetinget stimulus (US), har vi og andre utviklet protokoller for kondisjonering av C. elegans for å danne assosiativ læring og minne uten å bruke mat eller sult som USA20,21,22,23. I denne studien er protokollene modifisert for å kondisjonere dyr med 1-propanol og saltsyre (HCl, pH 4.0) som henholdsvis CS og USA for aversiv læring og korttidshukommelse (STM) og langtidsminne (LTM). Naive C. elegans tiltrekkes av 1-propanol24 og frastøtes av syre25. Når betinget med en blanding av 1-propanol og HCl (pH 4,0), var C. elegans ikke lenger eller svært svakt tiltrukket av 1-propanol.

Protocol

1. Oppskrifter

  1. NGM agarplater (trinn 2.1.)
    1. For å forberede 6 cm NGM-plater, oppløs 2,5 g pepton, 3 g NaCl og 17 g agar i 850 ml dobbelt avionisert H 2 O (ddH2O). Ta det totale volumet til 972 ml med ddH2O.
    2. Etter autoklavering, avkjøles til ~65 °C og tilsett 1 ml 5 mg/ml kolesterol oppløst i etanol, 1 ml hver av 1 M CaCl2 og 1 M MgSO4 og 25 ml 1 M kaliumfosfat (pH 6,0). Etter blanding godt, dispenser 8 ml hver til 6 cm (i diameter) petriskåler.
    3. Hold platene med lokk på en benk ved romtemperatur (RT) i 1 dag, og hold dem deretter i plastikk i et kaldt rom til bruk.
  2. Forbered Luria-Bertani (LB) medium (trinn 2.1.) ved å oppløse 10 g trypton, 5 g gjærekstrakt og 10 g NaCl i 1 L ddH2O. Juster pH til 7,0 med 5 N NaOH (flere dråper) og steriliser ved autoklavering.
    1. Forbered LB-plater ved å tilsette 15 g agar til LB-medium. Etter autoklavering, avkjøl til ~ 60 ° C og dispenser 12 ml hver til 9 cm (i diameter) petriskåler. Oppbevar plater i plastikk i et kaldt rom til bruk.
  3. For å lage en dyresamler (trinn 2.4.), fest nylonnett (30 μm maskestørrelse) til bunnen av et klart akryl sylindrisk rør (3,5 cm i lengde, 3 cm i utvendig diameter, 2 mm i veggtykkelse) med lim.
  4. For å lage 0,25% vandig gelatinoppløsning (trinn 2,4.), oppløs 0,25 g gelatin i 100 ml ddH2O. Steriliser ved autoklavering.
  5. Chemotaxis analyseplater (trinn 5.1.)
    1. For å lage agarplater for kjemotaksisanalyse, oppløs 15 g agar i 993 ml ddH2O ved autoklavering, og avkjøl løsningen til ~ 65 ° C.
    2. Tilsett deretter 5 ml autoklavert 1 M kaliumfosfat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2 og 1 ml 1 M MgSO4 til agaroppløsningen. Alle disse løsningene steriliseres separat ved autoklavering.
    3. Dispenser 10 ml av den blandede løsningen til en 6 cm petriskål. Legg disse tallerkenene med lokk på en benk på RT i to dager, og legg dem deretter på våte papirhåndklær i plasttøy på RT til bruk. Disse platene kan brukes i opptil 10 dager.
  6. For å lage kjemotaksisanalysebuffer (trinn 5,4.), bland 5 ml 1 M kaliumfosfat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO4 og 993 ml ddH2O. Steriliser alle disse løsningene separat ved autoklavering.
  7. For å lage en 40 ml CS/US-blandingsløsning (1 % vandig 1-propanol og HCl [pH 4,0]) (trinn 3,1 og trinn 4,1), tilsett 0,4 ml absolutt 1-propanol og 4 μL 5 M HCl (0,1 mM ved endelig konsentrasjon) til 39,6 ml ddH2O. Hold løsningen ved RT.
  8. For å lage ddH2O, behandle vann fra springen 2x med vannrensesystemer (se materialtabell).
  9. Forbered en flytende kultur (OD600 = ~ 0,7) av Escherichia coli OP50 ved å inokulere en frisk koloni med en tannpirker i 10 ml LB-medium og inkubere ved 37 ° C i 7-8 timer. Bakterier dyrket over lengre tid kan påvirke utfallet av kondisjonering, kanskje på grunn av sekundære metabolitter.

2. Forberedelse av synkronisert C.  elegans

  1. Ved hjelp av standardmetoder26, dyrk dyr på 6 cm NGM-plater (trinn 1.1.). NGM-plater fremstilles ved å spre 0,2 ml av en E. coli OP50 væskekultur i LB-medium (se trinn 1.9 .) og inkubere ved RT i ikke mer enn 24 timer (gamle bakterier kan påvirke utfallet av kondisjonering).
    MERK: C. elegans læring og minne er ekstremt følsomme for mekaniske, kjemiske og temperaturspenninger. Derfor anbefales det sterkt å dyrke dyr, vedlikeholde alle reagenser, inkludert vann, og utføre alle analyser ved RT mellom 17 ° C og 20 ° C. Fysisk og mekanisk stimulering som vortexing, grov pipettering og sentrifugering må unngås. Frisk 1-propanol bør brukes lengst hver 3. måned av ukjent grunn. Det er viktig at dyr dyrkes med rikelig med mat, da sult kan påvirke utfallet av kondisjonering alvorlig.
  2. På dag 1 plukker og plasserer du fem velfødde gravide dyr (legg flere mutante dyr som legger egg sakte) på hver av de fire 6 cm NGM-platene med en platinaormplukker, og la dem legge ~ 50 egg i 3 timer ved RT for å få en synkronisert populasjon av voksne dyr. Stopp eggleggingen ved å fjerne foreldredyr fra platene med en platinaormplukker.
    MERK: Seeded plater bør oppbevares på RT for å minimere stress for dyrene.
  3. Dyrk dyrene på RT i ca 5 dager, som er tiden det tar for dyr å nå sitt modne voksenstadium, ikke det unge voksne stadiet.
    MERK: Dyrkingsperioden mellom 4,5 dager og 5,5 dager bør justeres avhengig av forholdene, siden yngre voksne dyr er mer følsomme for kjemikaliene som brukes til kondisjonering enn modne voksne dyr (supplerende figur 1). Etter kondisjonering kan yngre voksne dyr vise lavere verdier for kjemotaksisindeks (C.I.).
  4. Samle ~ 200 voksne dyr i en dyresamler (se trinn 1.4.) ved å vaske hver tallerken med 1 ml 0,25% vandig gelatin (trinn 1.4.) Denne vandige gelatinen forhindrer vedheft av dyrene til overflaten av plast som pipettespisser.
  5. Vask dyrene i samleren med ddH 2 O (trinn 1.8.) ved å bevege samleren forsiktig opp og ned 2x i ~ 10 ml ddH 2 O. Gjenta denne prosessen 2x mer (3xtotalt) med ~ 10 ml ddH2O hver for å forhindre bakteriell forurensning.
    MERK: Bakteriell forurensning påvirker dyrs kjemotaksis alvorlig.

3. Massetrening for kortsiktig assosiativ læring og minne

MERK: Se figur 1 for den samlede opplæringsarbeidsflyten.

  1. Senk forsiktig dyresamleren som inneholder ~ 200 dyr i 40 ml av en blanding av 1% 1-propanol og HCl (pH 4,0 etter blanding med 1-propanol; se trinn 1.7.) i en krystalliserende tallerken for ~ 1 s.
    MERK: For kontrolldyrene, gjør det samme, men dypp bare i 1% vandig 1-propanol. Det ville være bedre å behandle dyr med HCl (pH 4,0) bare som en annen kontroll.
  2. Vask dyrene i samleren ved å senke samleren forsiktig 1x i 10 ml ddH2O i en brønn på en 6-brønns vevskulturplate.
    MERK: Dette vasketrinnet må være veldig forsiktig og bare gjøres 1x, da omfattende vask kan forhindre læring.
  3. Gjenta trinn 3.1. og 3.2. 10x uten avbrudd (intervall mellom studier [ITI], 0 min).
    MERK: Bruk fersk ddH2O hver gang på RT.
  4. Plasser kollektoren på en E. coli OP50 plen på en 6 cm NGM-plate i 10 min ved RT for at dyrene skal hvile.
  5. Vask dyrene i samleren med ddH 2 O ved å bevege samleren forsiktig opp og ned 2x i ~ 10 ml ddH 2 O. Gjenta denne prosessen 2x mer (3xtotalt) med ~ 10 ml ddH2O hver for å forhindre bakteriell forurensning.
  6. Fortsett til kjemotaksisanalyse som beskrevet nedenfor (trinn 5).

4. Avstandstrening for langsiktig assosiativ læring og minne

MERK: Se figur 2 for opplæringsarbeidsflyt med mellomrom.

  1. Senk forsiktig en dyresamler som inneholder ~ 200 dyr i 40 ml av en blanding av 1% 1-propanol og HCl (pH 4,0 etter blanding med 1-propanol; se trinn 1,7.) i en krystalliserende tallerken for ~ 1,0 s.
    MERK: Gjør det samme med 1% vandig 1-propanol bare som en kontroll. Det ville være bedre å behandle dyr med HCl (pH 4,0) bare som en annen kontroll.
  2. Vask dyrene i samleren ved veldig kort å senke samleren 1x i 10 ml ddH2O i en brønn på en 6-brønns vevskulturplate.
    MERK: Denne vaskingen må være veldig kort, da omfattende vask kan forhindre læring.
  3. Plasser samleren på en E. coli OP50-plen på en NGM-agarplate i en 6 cm (i diameter) petriskål i 10 minutter ved RT for at dyrene skal hvile.
    MERK: Denne hvilen i 10 minutter som ITI er avgjørende for dyrene å konsolidere minner for dannelsen av LTM.
  4. Gjenta trinn 4.1.-4.3. 10x.
  5. Vask dyrene i samleren med ddH 2 O ved åbevege samleren forsiktig opp og ned 2x i ~ 10 ml ddH 2 O, som holdes på RT. Gjenta denne prosessen 2x mer (3x totalt) med ~ 10 ml ddH2O hver for å forhindre bakteriell forurensning.
  6. Fortsett til kjemotaksisanalyse som beskrevet nedenfor (trinn 5.).

5. Chemotaxis analyse

  1. Forbered agarplater for kjemotaksisanalyse i 6 cm plastiske petriskåler (se trinn 1.5.).
  2. Overfør dyr i samleren (trinn 2.5.), som er plassert på en flat overflate av et petriskållokk av plast, til et 2 ml mikrosentrifugerrør med 1 ml 0,25 % vandig gelatin ved hjelp av en avsagd pipettespiss med en åpning på >1 mm (indre diameter).
    MERK: Det er viktig å bruke en avsagd pipettespiss for å minimere skjærbelastning på dyr.
  3. Fjern supernatanten fra røret etter at dyrene har satt seg i bunnen av røret med tyngdekraften i ~ 1 minutter (ikke sentrifuger).
  4. Forsiktig resuspend dyrene i 1 ml kjemotaksis analysebuffer (se trinn 1.6.) og la dem slå seg ned ved tyngdekraften til bunnen av røret i ~ 1 min (ikke sentrifuge). Fjern så mye supernatant som mulig ved pipettering.
  5. I mellomtiden ser diagonalt 4 μL hver av 5% vandig 1-propanol på to steder og punkt 4 μL hver av ddH2O på to andre steder på samme måte, som vist i figur 3A. For kjemotaksisanalyse av mutanter som har lavere følsomhet overfor 1-propanol, se høyere konsentrasjoner av vandig 1-propanol som resulterer i ~ 0,6 kjemotakseindeks (C.I.) verdier av naive mutanter, som vist i tilleggstabell 1.
    MERK: Det er viktig å fullføre spotting prosedyrer så raskt som mulig. Spot 5% vandig 1-propanol siden 1% vandig 1-propanol er for svak til å tiltrekke seg dyr i kjemotaksis analysen. I motsetning til dette, bruk 1% vandig 1-propanol for kondisjonering siden dyr behandlet med høyere konsentrasjoner av vandig 1-propanol enn 1% viser lavere CI-verdier.
  6. Spot 6 μL deler av dyresuspensjonen i kjemotaksisanalysebuffer (trinn 5.4.) som inneholder ~60 dyr i midten av tre plater for kjemotaksisanalyse ved hjelp av en avsagd pipettespiss med en åpning på ~1,0 mm (indre diameter). Fjern væske så mye som mulig med en laboratorievevveke uten å berøre dyrene og legg et lokk på platen.
    MERK: Det er viktig å fullføre disse prosedyrene så raskt som mulig.
  7. La dyrene bevege seg fritt på tallerkenen i 10 minutter ved RT, og overfør deretter tallerkenen til en petriskål i glass på is i 3 minutter for å stoppe kjemotaksis. Hold deretter tallerkenen i kjøleskap til du teller antall dyr på tallerkenen.
  8. Tell antall dyr i fire seksjoner, bortsett fra de i midtsirkelen, under et stereomikroskop og beregn kjemotaksisindeksen (CI) ved hjelp av ligningen vist i figur 3B. Fra CI-verdiene beregner du læringsindeksverdier (L.I.) som forskjellen mellom C.I.-verdien til referansedyrene og C.I.-verdien til de betingede dyrene (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
    MERK: C.I.-verdien til referansedyrene (C.I.reference) er middelverdien av C.I.-verdiene til dyr som kun er betinget av 1 % vandig 1-propanol.

Representative Results

C. elegans ble betinget av massetrening for å danne kortsiktig aversiv assosiativ hukommelse ved å parre 1% vandig 1-propanol og HCl (pH 4,0) som henholdsvis CS og US. I henhold til protokollen beskrevet ovenfor ble synkroniserte dyr dyrket på en benk ved en RT på 18 °C i 5 dager og ble veldig forsiktig vasket 2x med ddH2O ved en RT på 18 °C. Deretter ble dyrene betinget med en blanding av 1% vandig 1-propanol og HCl (pH 4,0) i 1 s. Vi trente også dyr med ddH2O bare, 1% vandig 1-propanol bare, og HCl (pH 4,0) bare som referanser. Etter kondisjoneringen ble dyrene vasket 1x med ddH2O. Vi gjentok kondisjoneringen 10x uten avbrudd (ingen ITIer). Vellykket kondisjonering ble oppnådd ved å gjenta prosedyren mer enn 7x opp til 10x. Kondisjonering mer enn 10x resulterte i mindre effektiv læring21. Etter treningen hvilte dyrene på bakteriemat i 10 minutter ved RT (18 °C). Etter å ha blitt vasket med ddH2O 3x, ble dyrene overført til et mikrosentrifugerrør ved å suspendere i 0,25% vandig gelatin og slå seg ned til bunnen av tyngdekraften. Etter å ha fjernet supernatanten så mye som mulig, ble dyrene forsiktig resuspended i kjemotaksisanalysebuffer og deretter lov til å slå seg ned til bunnen av røret ved tyngdekraften.

Etter å ha fjernet så mye supernatant som mulig, ble dyresuspensjonen oppdaget på midtsirkelen av en kjemotaksisanalyseplate, som ble holdt ved en RT på 18 ° C, og deretter fikk dyrene bevege seg fritt på platen i 10 minutter ved en RT på 18 ° C. C.I. verdier ble beregnet ved hjelp av ligningen vist i figur 3B. Som vist i figur 4A, ble dyr betinget med blandingen av 1% 1-propanol og HCl ikke lenger tiltrukket av 5% 1-propanol flekket på agarplater for kjemotaksisanalyse, mens naive og referansedyr på samme måte ble tiltrukket av 5% 1-propanol. Etter den massive treningen (trinn 3) ble minnet ikke lenger observert innen 3 timer20. Videre var minnet dannet av den massive treningen følsom for kuldesjokk20. Disse resultatene viser at C. elegans vellykket dannet aversive STM ved massetrening.

Dyrene ble også kondisjonert av trening 10x med en 10 min ITI mellom treningstrinnene (trinn 4.). Under ITI ble oppsamleren med dyr plassert på en bakterieplen på en 6 cm NGM-plate ved en RT på 18 °C. Dyr betinget av trening med en blanding av 1% vandig 1-propanol og HCl (pH 4,0) ble ikke lenger tiltrukket av 5% 1-propanol sammenlignet med dyr behandlet med 1% 1-propanol bare, HCl (pH 4,0) bare, eller ddH2O bare (figur 4B). Etter den spredte treningen beholdt dyrene minnet i mer enn 12 timer20,21. Videre ble minnet ikke dannet når dyr ble behandlet med oversettelses- eller transkripsjonshemmere og var motstandsdyktig mot kaldt sjokk20,21. Derfor dannet C. elegans vellykket aversive LTM ved avstandstrening.

Vi undersøkte også effekten av mutasjoner i "lærings- og minnegener" på dannelsen av STM og LTM. Crh-1-genet koder for den allestedsnærværende transkripsjonsfaktoren cAMP-respons elementbindende protein (CREB), glr-1 og nmr-1 koder for henholdsvis α-amino-3-hydroksyl-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre (AMPA)-type og N-metyl-D-aspartat (NMDA)-type glutamatreseptorunderenheter, og stau-1 koder for det dobbeltstrengede RNA-bindende proteinet Staufen-isoformen. Disse genene spiller viktige roller i klassisk kondisjonering i C. elegans, Drosophila, Aplysia og mus. Ved å bruke en blanding av 1% vandig 1-propanol og HCl (pH 4,0), var dannelsen av STM og LTM avhengig av alle genene (figur 5A, B).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt skjema for massetrening. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentelt skjema for avstandstrening. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Chemotaxis assay og chemotaxis index . (A) Skjematisk fremstilling av en kjemotaksis-analyseplate. Petriskåler (6 cm i diameter) ble delt inn i fire områder som vist, og 4 μL hver av 5% vandig 1-propanol eller ddH 2 O ble diagonalt oppdaget på to steder hver,2cm fra midten. (B) Chemotaxis indeksverdier ble beregnet fra ligningen vist ved å telle antall dyr i områdene "a" og "b" etter ferdigstillelse av kjemotaksis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Chemotaxis indeksverdier for dyr betinget av kjemikalier. Synkroniserte villtype N2-dyr ble kondisjonert med kjemikalier indikert ved (A) massetrening 10x eller (B) avstandstrening 10x. Flytskjemaer for de brukte treningsprotokollene med masse og avstand er vist i henholdsvis figur 1 og figur 2. Etter kondisjoneringen var dyrene frie til å bevege seg i 10 minutter på en 6 cm agarplate for kjemotaksisanalyse ved en RT på 18 °C. C.I. verdier ble beregnet ved hjelp av ligningen vist i figur 3B. Data for dette tallet er gitt i supplerende tabell 1. Data fra de naive dyrene ble replottet i begge figurpanelene. Barplottet viser 1. kvartil, median og 3. kvartil. Stjerner (*P < 0,05) indikerer statistisk signifikante forskjeller bestemt av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multiple comparison test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Læringsindeksverdier for betingede mutante dyr. Synkroniserte villtype N2 og mutante dyr indikert var betinget med en blanding av 1% vandig 1-propanol og HCl (pH 4,0) ved (A) massetrening 10x eller (B) avstandstrening 10x. Flytskjemaer for de brukte treningsprotokollene med masse og avstand er vist i henholdsvis figur 1 og figur 2. Etter kondisjoneringen var dyrene frie til å bevege seg i 10 minutter på en 6 cm agarplate for kjemotaksisanalyse ved en RT på 18 °C. Data for dette tallet er gitt i supplerende tabell 2. Barplottet viser 1. kvartil, median og 3. kvartil. Stjerner (*P < 0,05) indikerer statistisk signifikante forskjeller bestemt av enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multiple sammenligningstest. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Unge voksne dyr er følsomme for kjemisk behandling. Dag 4 og dag 5 villtype N2-dyr etter klekking ble massetrent 10x med HCl, pH 4,0, uten avbrudd og ble deretter analysert for kjemotaksis til 5% vandig 1-propanol. Barer er midler ± S.E.M. (n = 19). Stjerner (*P < 0,05) indikerer statistisk signifikante forskjeller bestemt av toveis ANOVA etterfulgt av Tukey-Kramer post-hoc test. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Data tilsvarende figur 4. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Data tilsvarende figur 5. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

I denne studien ble alle reagensene holdt på en RT på ~ 18 ° C i gjennomsnitt, og dyr ble dyrket på en benk ved RT for å unngå stress for dyrene. Videre ble alle eksperimentelle prosedyrer utført ved RT. Dyr ble opprinnelig dyrket i en inkubator ved 20 ° C og deretter kondisjonert på en benk ved ~ 24 ° C ved bruk av reagenser ved RT. Under disse forholdene var resultatene av kondisjoneringen svært varierende. Ved lav RT vokser C. elegans sakte og bør dyrkes lenger enn ved 20 ° C til dyrene når det modne voksenstadiet, da yngre voksne dyr er mer følsomme for kjemikaliene som brukes til kondisjonering enn modne voksne dyr og kan vise lavere CI-verdier.

Det mest kritiske trinnet for vellykket kondisjonering er vasking av dyr med ddH2O umiddelbart etter hver kjemisk behandling. Derfor bør mekaniske spenninger og temperaturspenninger minimeres ved å bruke avsagde pipetspisser, holde reagenser ved RT og vaske dyrene veldig forsiktig ved å bevege dyresamleren veldig sakte opp og ned i ddH2O. Grundig vask av dyrene hver gang etter kondisjonering kan påvirke læring og hukommelse. Betingelsene for kjemotaksisanalyseplatene påvirker også resultatene alvorlig. For tørre eller for våte plater hindrer jevn bevegelse av dyrene. Plater ble tilberedt som beskrevet i trinn 1.; en god plate er en som de 4 μL flekkene av ddH2O eller 5% vandig 1-propanol absorberes fullstendig av agar på omtrent 5 minutter etter spotting. Som beskrevet ovenfor er dyrs alder også kritisk for vellykket kondisjonering. Unge voksne dyr er følsomme for mekanisk og kjemisk behandling, noe som resulterer i variable resultater, selv om svært gamle dyr kanskje heller ikke er egnet for kondisjonering.

Holdbarheten til 1-propanol avhenger av merker og partier og er mindre enn 3 måneder ved RT. Når CI-verdiene til naive dyr blir verre, anbefales det å bruke fersk 1-propanol til kondisjonering og kjemotaksisanalyse.

Dannelsen av minne ved massetrening ble ikke påvirket av behandling av dyr med oversettelseshemmere (cykloheksimid og anisomycin) og en transkripsjonshemmer (aktinomycin D), mens dannelsen av minne ved avstandstreningen ble markert hemmet av hemmerne20,21. Videre forfalt det tidligere minnet av kuldesjokk, mens sistnevnte ble beholdt i en lengre periode enn førstnevnte og var motstandsdyktig mot kuldesjokk. Disse resultatene viser at førstnevnte er STM og sistnevnte er LTM, henholdsvis20,21. Imidlertid kan minnet dannet av den masserte treningen bestå av STM og mellomlangsiktig (mellomtids) minne siden STM er svakt avhengig av CREB-transkripsjonsfaktoren (figur 5A). Dette er i samsvar med resultatet at STM ble beholdt i mer enn 1 time20,21. Dannelsen av både STM og LTM er svært avhengig av nmr-1, som bare uttrykkes i seks par nevroner (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG og PVC) i C. elegans27,28. I disse nevronene kan derfor NMDA-reseptorer fungere som en molekylær tilfeldighetsdetektor av 1% vandige 1-propanol- og HCl (pH 4.0) signaler for synaptisk plastisitet, hvor den synaptiske forsterkningen som kreves for både STM og LTM, kan skyldes tilfeldig avfyring av pre- og postsynaptiske nevroner 29,30,31,32,33. Derfor kan det aversive assosiative minnet dannes blant interneuronene.

Metodene beskrevet i denne studien skal være anvendelige for appetitiv olfaktorisk læring og kortsiktig og langsiktig assosiativt minne ved bruk av 1-nonanol som CS og kaliumklorid som US21. Det er interessant å sammenligne nevronkretsene som er involvert i dannelsen av appetittvekkende og aversive minner.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang og Hitomi Ohtaki for teknisk assistanse og kommentarer til manuskriptet. Stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Tags

Nevrovitenskap utgave 184
Aversiv assosiativ læring og minnedannelse ved å parre to kjemikalier i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter