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Neuroscience

Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Wir haben zuvor Protokolle für Caenorhabditis elegans entwickelt, um kurz- und langfristige assoziative Erinnerungen durch massiertes bzw. räumliches Training zu bilden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Konditionierung von C. elegans beschrieben, indem 1-Propanol und Salzsäure als konditionierte bzw. unkonditionierte Stimuli gepaart werden, um ein aversives assoziatives Gedächtnis zu bilden.

Abstract

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist aufgrund der Einfachheit seines Nervensystems, dessen chemische und elektrische Schaltpläne vollständig aus seriellen elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Dünnschliffen rekonstruiert wurden, ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung von Lernen und Gedächtnis auf molekularer und zellulärer Ebene. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für die Konditionierung von C. elegans durch Massen- und Spaced-Training zur Bildung des Kurzzeitgedächtnisses (STM) bzw. des Langzeitgedächtnisses (LTM). Durch die Paarung von 1-Propanol und Salzsäure als konditionierte bzw. unkonditionierte Stimuli wurde C. elegans erfolgreich trainiert, aversive assoziative STM und LTM zu bilden. Während naive Tiere von 1-Propanol angezogen wurden, wurden die trainierten Tiere nicht mehr oder nur sehr schwach von 1-Propanol angezogen. Wie bei anderen Organismen wie Aplysia und Drosophila spielen "Lern- und Gedächtnisgene" eine wesentliche Rolle bei der Gedächtnisbildung. Insbesondere NMDA-Typ-Glutamatrezeptoren, die in C. elegans nur in sechs Paaren von Interneuronen exprimiert werden, sind für die Bildung von STM und LTM erforderlich, möglicherweise als Koinzidenzfaktor. Daher kann sich die Gedächtnisspur unter den Interneuronen befinden.

Introduction

Lernen und Gedächtnis sind für Tiere von entscheidender Bedeutung, um zu überleben und sich fortzupflanzen, indem sie effizient durch sich verändernde Umgebungen navigieren. C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung von Lernen und Gedächtnis auf molekularer und zellulärer Ebene aufgrund der Einfachheit seines Nervensystems, dessen chemische und elektrische Schaltpläne vollständig aus seriellen elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Dünnschliffen 1,2,3 rekonstruiert wurden.

C. elegans lernt, die Kultivierungstemperatur mit Hunger in Verbindung zu bringen und wandert von seiner Wachstumstemperatur mit einem aversiven Gedächtnis ab, das mehrere Stunden anhält 4,5. Die Konditionierung von C. elegans mit Natriumchlorid (NaCl) in Abwesenheit von Nahrung führt zu einer Verringerung der Chemotaxis in Richtung NaCl 6,7,8. In Kombination mit Nahrung wird die Butanon-Anziehung durch appetitives Lernen verstärkt 9,10,11. Obwohl diese Phänomene als assoziatives Lernen und Gedächtnis10,12 interpretiert werden, ist die Unterscheidung zwischen assoziativem Lernen und nicht-assoziativer Sensibilisierung, Gewöhnung und Anpassung im C. elegans-Lern- und Gedächtnisparadigma13,14 nicht klar. Tatsächlich zeigten Tiere, die mit Butanon und Nahrungsentzug konditioniert waren (aversive Konditionierung), eine depressive Kopplung des Butanon-sensorischen Neurons AWC ON an Zielneuronen durch Insulinsignale von anderen Neuronen, einschließlich AIA-Interneuronen, während Tiere, die mit Butanon und Nahrung konditioniert waren (appetitive Konditionierung), eine verstärkte Kopplung von AWCON an Zielneuronen zeigten15 . Die Insulinsignalisierung verursacht Genexpressionsänderungen, die durch nukleäre EGL-4 und andere Transkriptionsregulatoren induziertwerden 16,17. Somit weist dieses aversive und appetitive Lernen und Gedächtnis Analogien zur nicht-assoziativen Gewöhnung bzw. Sensibilisierung präsynaptischer sensorischer Neuronen im Kiemen-Entzugsreflex in Aplysia18,19 auf.

Durch die Kombination von zwei Chemikalien als konditionierter Reiz (CS) und unkonditionierter Reiz (US) haben wir und andere Protokolle für die Konditionierung von C. elegans entwickelt, um assoziatives Lernen und Gedächtnis zu bilden, ohne Nahrung oder Hunger zu verwenden, wie die US20,21,22,23. In der vorliegenden Studie werden die Protokolle modifiziert, um Tiere mit 1-Propanol und Salzsäure (HCl, pH 4,0) wie CS bzw. US für aversives Lernen und Kurzzeitgedächtnis (STM) und Langzeitgedächtnis (LTM) zu konditionieren. Naive C. elegans wird von 1-Propanol24 angezogen und von Säure25 abgestoßen. Bei Konditionierung mit einer Mischung aus 1-Propanol und HCl (pH 4,0) wurde C. elegans nicht mehr oder nur sehr schwach von 1-Propanol angezogen.

Protocol

1. Rezepte

  1. NGM-Agarplatten (Schritt 2.1.)
    1. Zur Herstellung von 6 cm NGM-Platten werden 2,5 g Pepton, 3 g NaCl und 17 g Agar in 850 ml doppelt entionisiertemH2O(ddH2O) gelöst. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit ddH2O auf 972 ml.
    2. Nach dem Autoklavieren auf ~65 °C abkühlen und 1 ml 5 mg/ml in Ethanol gelöstes Cholesterin, jeweils 1 ml 1 MCaCl2 und 1 MMgSO4 und 25 ml 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0) hinzufügen. Nach dem guten Mischen 8 ml auf jeweils 6 cm (im Durchmesser) Petrischalen dosieren.
    3. Bewahren Sie die Teller mit Deckel 1 Tag lang bei Raumtemperatur (RT) auf einer Bank auf und bewahren Sie sie dann bis zur Verwendung in Kunststoffwaren in einem kalten Raum auf.
  2. Luria-Bertani (LB) -Medium (Schritt 2.1.) durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl in 1 LddH2Oherstellen. Stellen Sie den pH-Wert mit 5 N NaOH (mehrere Tropfen) auf 7,0 ein und sterilisieren Sie ihn durch Autoklavieren.
    1. Bereiten Sie LB-Platten vor, indem Sie 15 g Agar zu LB-Medium hinzufügen. Nach dem Autoklavieren auf ~60 °C abkühlen und jeweils 12 ml auf 9 cm (im Durchmesser) Petrischalen dosieren. Bewahren Sie Teller in Kunststoffwaren bis zum Gebrauch in einem kalten Raum auf.
  3. Um einen Tiersammler herzustellen (Schritt 2.4.), befestigen Sie ein Nylonnetz (30 μm Maschenweite) mit Klebstoff auf den Boden eines zylindrischen Acrylrohrs (3,5 cm Länge, 3 cm Außendurchmesser, 2 mm Wandstärke).
  4. Um 0,25% wässrige Gelatinelösung herzustellen (Schritt 2.4.), lösen Sie 0,25 g Gelatine in 100 mlddH2O. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren.
  5. Chemotaxis Assay Platten (Schritt 5.1.)
    1. Um Agarplatten für den Chemotaxis-Test herzustellen, werden 15 g Agar in 993 mLddH2Odurch Autoklavieren gelöst und die Lösung auf ~65 °C abgekühlt.
    2. Dann werden 5 ml autoklaviertes 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0), 1 ml 1 MCaCl2 und 1 ml 1 MMgSO4 zur Agarlösung gegeben. Alle diese Lösungen werden separat durch Autoklavieren sterilisiert.
    3. 10 ml der Mischlösung in eine 6 cm große Petrischale geben. Stellen Sie diese Teller mit Deckel für zwei Tage auf eine Bank bei RT und legen Sie sie dann bis zum Gebrauch auf nasse Papiertücher in Plastikgeschirr. Diese Platten können bis zu 10 Tage verwendet werden.
  6. Zur Herstellung eines Chemotaxis-Assay-Puffers (Schritt 5.4) mischen Sie 5 ml 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 und 993 ml ddH2O.
  7. Zur Herstellung einer 40 mL CS/US-Mischungslösung (1% wässriges 1-Propanol und HCl [pH 4,0]) (Schritt 3.1. und Schritt 4.1), werden 0,4 ml absolutes 1-Propanol und 4 μL 5 M HCl (0,1 mM bei Endkonzentration) zu 39,6 mlddH2Ogegeben.
  8. Um ddH2O herzustellen, behandeln Sie Leitungswasser 2x mit Wasseraufbereitungssystemen (siehe Materialtabelle).
  9. Bereiten Sie eine flüssige Kultur (OD600 = ~0,7) von Escherichia coli OP50 vor, indem Sie eine frische Kolonie mit einem Zahnstocher in 10 ml LB-Medium impfen und bei 37 °C für 7-8 h inkubieren. Bakterien, die über einen längeren Zeitraum kultiviert werden, können das Ergebnis der Konditionierung beeinflussen, möglicherweise aufgrund sekundärer Metaboliten.

2. Vorbereitung von synchronisiertem C.  Elegans

  1. Tiere mit Standardmethoden26 auf 6 cm NGM-Platten kultivieren (Schritt 1.1.). NGM-Platten werden hergestellt, indem 0,2 ml einer E. coli OP50-Flüssigkultur in LB-Medium verteilt werden (siehe Schritt 1.9 .) und bei RT für nicht mehr als 24 h inkubiert werden (alte Bakterien können das Ergebnis der Konditionierung beeinflussen).
    HINWEIS: C. elegans Lernen und Gedächtnis sind extrem empfindlich gegenüber mechanischen, chemischen und Temperaturbelastungen. Daher wird dringend empfohlen, Tiere zu kultivieren, alle Reagenzien einschließlich Wasser zu pflegen und alle Tests bei RT zwischen 17 °C und 20 °C durchzuführen. Physikalische und mechanische Stimulationen wie Wirbeln, grobes Pipettieren und Zentrifugieren müssen vermieden werden. Frisches 1-Propanol sollte aus einem unbekannten Grund längstens alle 3 Monate verwendet werden. Wichtig ist, dass Tiere mit reichlich Nahrung gezüchtet werden müssen, da Hunger das Ergebnis der Konditionierung ernsthaft beeinträchtigen kann.
  2. Nehmen Sie an Tag 1 fünf gut genährte gravide Tiere auf (setzen Sie mehr mutierte Tiere, die langsam Eier legen) auf jede der vier 6 cm NGM-Platten mit einem Platinwurmpflücker und lassen Sie sie ~ 50 Eier für 3 h bei RT legen, um eine synchronisierte Population erwachsener Tiere zu erhalten. Stoppen Sie die Eiablage, indem Sie Elterntiere mit einem Platinwurmpflücker von den Tellern entfernen.
    HINWEIS: Saatplatten sollten bei RT gehalten werden, um den Stress für die Tiere zu minimieren.
  3. Kultivieren Sie die Tiere bei RT für etwa 5 Tage, was die Zeit ist, die die Tiere benötigen, um ihr reifes Erwachsenenstadium zu erreichen, nicht das junge Erwachsenenstadium.
    HINWEIS: Die Kultivierungsdauer zwischen 4,5 Tagen und 5,5 Tagen sollte je nach den Bedingungen angepasst werden, da jüngere erwachsene Tiere empfindlicher auf die zur Konditionierung verwendeten Chemikalien reagieren als reife erwachsene Tiere (ergänzende Abbildung 1). Nach der Konditionierung können jüngere erwachsene Tiere niedrigere Chemotaxisindex-Werte (C.I.) aufweisen.
  4. Sammeln Sie ~200 erwachsene Tiere in einem Tiersammler (siehe Schritt 1.4.), indem Sie jede Platte mit 1 ml 0,25% wässriger Gelatine waschen (Schritt 1.4). Diese wässrige Gelatine verhindert das Anhaften der Tiere an der Oberfläche von Kunststoffen wie Pipettenspitzen.
  5. Waschen Sie die Tiere im Kollektor mit ddH 2 O (Schritt 1.8.), indem Sie den Kollektor sehr vorsichtig 2x in ~10 mLddH2O auf und ab bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x mehr (insgesamt 3x) mit jeweils ~10 mL ddH2O, um eine bakterielle Kontamination zuvermeiden.
    HINWEIS: Bakterielle Kontamination beeinträchtigt die Chemotaxis von Tieren ernsthaft.

3. Massentraining für kurzfristiges assoziatives Lernen und Gedächtnis

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für den Massentrainingsworkflow.

  1. Tauchen Sie den Tiersammler mit ~200 Tieren vorsichtig in 40 ml einer Mischung aus 1% 1-Propanol und HCl (pH 4,0 nach Mischen mit 1-Propanol; siehe Schritt 1.7.) für ~1 s in eine Kristallisationsschale.
    HINWEIS: Für die Kontrolltiere tun Sie dasselbe, tauchen Sie jedoch nur in 1% wässriges 1-Propanol. Es wäre besser, Tiere mit HCl (pH 4,0) nur als weitere Kontrolle zu behandeln.
  2. Waschen Sie die Tiere im Kollektor, indem Sie den Kollektor sehr vorsichtig 1x in 10 mLddH2Oin eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte tauchen.
    HINWEIS: Dieser Waschschritt muss sehr schonend sein und nur 1x durchgeführt werden, da ausgiebiges Waschen das Lernen verhindern kann.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1. und 3.2. 10x ohne Unterbrechung (Inter-Trial-Intervall [ITI], 0 min).
    HINWEIS: Verwenden Sie jedes Mal frische ddH2O bei RT.
  4. Stellen Sie den Kollektor für 10 min bei RT auf einen E. coli OP50-Rasen auf einer 6 cm langen NGM-Platte, damit sich die Tiere ausruhen können.
  5. Waschen Sie die Tiere im Kollektor mit ddH 2 O, indem Sie den Kollektor sehr vorsichtig 2x in ~10 mLddH2O auf und ab bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x mehr (insgesamt 3x) mit jeweils ~10 mL ddH2O, um eine bakterielle Kontaminationzu vermeiden.
  6. Fahren Sie mit dem Chemotaxis-Test wie unten beschrieben fort (Schritt 5).

4. Spaced Training für langfristiges assoziatives Lernen und Gedächtnis

HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für den Schulungsworkflow.

  1. Tauchen Sie einen Tiersammler mit ~200 Tieren in 40 ml einer Mischung aus 1% 1-Propanol und HCl (pH 4,0 nach Mischen mit 1-Propanol; siehe Schritt 1.7.) vorsichtig in eine Kristallisationsschale für ~1,0 s.
    HINWEIS: Machen Sie dasselbe mit 1% wässrigem 1-Propanol nur als Kontrolle. Es wäre besser, Tiere mit HCl (pH 4,0) nur als weitere Kontrolle zu behandeln.
  2. Waschen Sie die Tiere im Kollektor, indem Sie den Kollektor 1x kurz in 10 mLddH2Oin eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte tauchen.
    HINWEIS: Diese Wäsche muss sehr kurz sein, da ausgiebiges Waschen das Lernen verhindern kann.
  3. Stellen Sie den Kollektor auf einen E. coli OP50-Rasen auf einer NGM-Agarplatte in einer Petrischale von 6 cm (im Durchmesser) für 10 Minuten bei RT, damit sich die Tiere ausruhen können.
    HINWEIS: Diese Ruhezeit von 10 Minuten als ITI ist entscheidend für die Tiere, um Erinnerungen für die Bildung von LTM zu festigen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.-4.3. 10x.
  5. Waschen Sie die Tiere im Kollektor mitddH2O, indem Sie den Kollektor sehr vorsichtig 2x in ~10 mLddH2Oauf und ab bewegen, was bei RT gehalten wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x mehr (insgesamt 3x) mit jeweils ~10 mL ddH2O, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden.
  6. Fahren Sie mit dem Chemotaxis-Test wie unten beschrieben fort (Schritt 5.).

5. Chemotaxis Assay

  1. Agarplatten für den Chemotaxis-Test in 6 cm Kunststoff-Petrischalen vorbereiten (siehe Schritt 1.5.).
  2. Die Tiere in den Kollektor (Schritt 2.5.), der auf einer ebenen Oberfläche eines Kunststoff-Petrischalendeckels platziert wird, in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 0,25% wässriger Gelatine mit einer abgesägten Pipettenspitze mit einer Öffnung von >1 mm (Innendurchmesser) überführen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine abgesägte Pipettenspitze zu verwenden, um die Scherbelastung der Tiere zu minimieren.
  3. Entfernen Sie den Überstand aus dem Röhrchen, nachdem sich die Tiere durch die Schwerkraft ~ 1 min am Boden des Röhrchens niedergelassen haben (nicht zentrifugieren).
  4. Resuspendieren Sie die Tiere vorsichtig in 1 ml Chemotaxis-Assay-Puffer (siehe Schritt 1.6.) und lassen Sie sie durch Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens für ~1 min absetzen (nicht zentrifugieren). Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich durch Pipettieren.
  5. In der Zwischenzeit werden diagonal jeweils 4 μL 5% wässriges 1-Propanol an zwei Stellen und je 4 μLddH2Oan zwei anderen Stellen auf die gleiche Weise gespottet, wie in Abbildung 3A gezeigt. Für Chemotaxis-Assay von Mutanten mit geringerer Empfindlichkeit gegenüber 1-Propanol sind höhere Konzentrationen von wässrigem 1-Propanol zu erkennen, die zu ~0,6 Chemotaxis-Index-Werten (C.I.) von naiven Mutanten führen, wie in Zusatztabelle 1 gezeigt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Spotting-Verfahren so schnell wie möglich abzuschließen. Spot 5% wässriges 1-Propanol, da 1% wässriges 1-Propanol zu schwach ist, um Tiere im Chemotaxis-Assay anzuziehen. Verwenden Sie dagegen 1% wässriges 1-Propanol zur Konditionierung, da Tiere, die mit höheren Konzentrationen von wässrigem 1-Propanol als 1% behandelt wurden, niedrigere CI-Werte aufweisen.
  6. Spot 6 μL Portionen der Tiersuspension in Chemotaxis-Assay-Puffer (Schritt 5.4.) mit ~60 Tieren in der Mitte von drei Platten für den Chemotaxis-Assay unter Verwendung einer abgesägten Pipettenspitze mit einer Öffnung von ~1,0 mm (Innendurchmesser). Entfernen Sie die Flüssigkeit so viel wie möglich mit einem Labortuchdocht, ohne die Tiere zu berühren, und setzen Sie einen Deckel auf den Teller.
    HINWEIS: Es ist wichtig, diese Verfahren so schnell wie möglich abzuschließen.
  7. Lassen Sie die Tiere 10 Minuten bei RT frei auf dem Teller bewegen und geben Sie dann die Platte für 3 Minuten in eine Glaspetrischale auf Eis, um die Chemotaxis zu stoppen. Bewahren Sie den Teller dann in einem Kühlschrank auf, bis Sie die Anzahl der Tiere auf dem Teller gezählt haben.
  8. Zählen Sie die Anzahl der Tiere in vier Abschnitten, mit Ausnahme derjenigen im Mittelkreis, unter einem Stereomikroskop und berechnen Sie den Chemotaxis-Index (C.I.) anhand der in Abbildung 3B gezeigten Gleichung. Berechnen Sie aus den C.I.-Werten die Lernindexwerte (L.I.) als Differenz zwischen dem C.I.-Wert der Referenztiere und dem C.I.-Wert der konditionierten Tiere (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
    ANMERKUNG: Der C.I.-Wert der Referenztiere (C.I.Referenz) ist der Mittelwert der C.I.-Werte von Tieren, die nur mit 1% wässrigem 1-Propanol konditioniert sind.

Representative Results

C. elegans wurde durch massenhaftes Training konditioniert, um ein kurzzeitiges aversives assoziatives Gedächtnis zu bilden, indem 1% wässriges 1-Propanol und HCl (pH 4,0) als CS bzw. US gepaart wurden. Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden synchronisierte Tiere 5 Tage lang auf einer Bank bei einer RT von 18 °C kultiviert und 2x mitddH2Obei einer RT von 18 °C sehr schonend gewaschen. Dann wurden die Tiere mit einer Mischung aus 1% wässrigem 1-Propanol und HCl (pH 4,0) für 1 s konditioniert. Wir trainierten auch Tiere nur mit ddH2O, 1% wässrigem 1-Propanol und HCl (pH 4,0) nur als Referenzen. Nach der Konditionierung wurden die Tiere 1x mit ddH2Ogewaschen. Wir haben die Konditionierung 10x ohne Unterbrechung wiederholt (keine ITIs). Eine erfolgreiche Konditionierung wurde erreicht, indem der Vorgang mehr als 7x bis 10x wiederholt wurde. Eine Konditionierung von mehr als 10x führte zu weniger effizientem Lernen21. Nach dem Training ruhten die Tiere 10 min bei RT (18 °C) auf bakteriellem Futter. Nach dem Waschen mitddH2O3x wurden die Tiere durch Aufhängen in 0,25% wässriger Gelatine in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und durch Schwerkraft auf den Boden gesetzt. Nachdem der Überstand so weit wie möglich entfernt wurde, wurden die Tiere vorsichtig in Chemotaxis-Assay-Puffer resuspendiert und dann durch die Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens gelassen.

Nach dem Entfernen von so viel Überstand wie möglich wurde die Tiersuspension auf dem Mittelkreis einer Chemotaxis-Assay-Platte entdeckt, die bei einer RT von 18 °C gehalten wurde, und dann durften sich die Tiere 10 Minuten lang bei einer RT von 18 °C frei auf der Platte bewegen. Die C.I.-Werte wurden unter Verwendung der in Abbildung 3B gezeigten Gleichung berechnet. Wie in Abbildung 4A gezeigt, wurden Tiere, die mit der Mischung aus 1% 1-Propanol und HCl konditioniert waren, nicht mehr von 5% 1-Propanol angezogen, das auf Agarplatten für den Chemotaxis-Test entdeckt wurde, während naive und Referenztiere in ähnlicher Weise von 5% 1-Propanol angezogen wurden. Nach dem Massentraining (Schritt 3.) wurde das Gedächtnis innerhalb von 3 h20 nicht mehr beobachtet. Darüber hinaus war das Gedächtnis, das durch das Massentraining gebildet wurde, empfindlich gegenüber Kälteschock20. Diese Ergebnisse zeigen, dass C. elegans erfolgreich aversive STM durch Massentraining gebildet hat.

Die Tiere wurden auch durch 10x verteiltes Training mit einem 10-minütigen ITI zwischen den Trainingsschritten konditioniert (Schritt 4.). Während der ITI wurde der Kollektor mit Tieren auf einem Bakterienrasen auf einer 6 cm NGM-Platte bei einer RT von 18 °C platziert. Tiere, die durch das Abstandstraining mit einer Mischung aus 1% wässrigem 1-Propanol und HCl (pH 4,0) konditioniert wurden, wurden im Vergleich zu Tieren, die nur mit 1% 1-Propanol, nur HCl (pH 4,0) oder nur ddH2O behandelt wurden,nicht mehr von 5% 1-Propanol angezogen (Abbildung 4B). Nach dem Spaced-Training behielten die Tiere das Gedächtnis für mehr als 12 h20,21. Darüber hinaus bildete sich das Gedächtnis nicht, wenn Tiere mit Translations- oder Transkriptionsinhibitoren behandelt wurden und war resistent gegen Kälteschock20,21. Daher bildete C. elegans erfolgreich aversive LTM durch Spaced-Training.

Wir untersuchten auch die Auswirkungen von Mutationen in "Lern- und Gedächtnisgenen" auf die Bildung von STM und LTM. Das crh-1-Gen kodiert für den ubiquitären Transkriptionsfaktor cAMP-response element-binding protein (CREB), glr-1 und nmr-1 kodieren für α-Amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA)-Typ bzw. N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Typ Glutamatrezeptor-Untereinheiten, und stau-1 kodiert für das doppelsträngige RNA-bindende Protein Staufen-Isoform. Diese Gene spielen eine wesentliche Rolle bei der klassischen Konditionierung in C. elegans, Drosophila, Alysia und Mäusen. Unter Verwendung einer Mischung aus 1% wässrigem 1-Propanol und HCl (pH 4,0) war die Bildung von STM und LTM von allen Genen abhängig (Abbildungen 5A,B).

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelles Schema des Massentrainings. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Experimentelles Schema des Spaced Trainings. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Chemotaxis Assay und Chemotaxis Index . (A) Schematische Darstellung einer Chemotaxis-Assay-Platte. Petrischalen (6 cm Durchmesser) wurden wie gezeigt in vier Bereiche getrennt, und je 4 μL 5% wässriges 1-Propanol oderddH2Owurden diagonal an jeweils zwei Stellen, 2 cm vom Zentrum entfernt, gefleckt. (B) Die Chemotaxis Indexwerte wurden aus der Gleichung berechnet, die durch Zählen der Anzahl der Tiere in den Gebieten "a" und "b" nach Abschluss der Chemotaxis gezeigt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Chemotaxis Indexwerte von Tieren, die mit Chemikalien konditioniert wurden. Synchronisierte Wildtyp-N2-Tiere wurden mit Chemikalien konditioniert, die durch (A) Massentraining 10x oder (B) 10x Abstandstraining angegeben wurden. Flussdiagramme der verwendeten Trainingsprotokolle mit Masse und Abstand sind in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2 dargestellt. Nach der Konditionierung konnten sich die Tiere für 10 min auf einer 6 cm langen Agarplatte für den Chemotaxis-Test bei einer RT von 18 °C bewegen. Die C.I.-Werte wurden unter Verwendung der in Abbildung 3B gezeigten Gleichung berechnet. Die Daten für diese Zahl sind in der Zusatztabelle 1 enthalten. Daten der naiven Tiere wurden in beiden Figurentafeln wiedergegeben. Das Balkendiagramm zeigt das 1. Quartil, den Median und das 3. Quartil. Sternchen (*P < 0,05) zeigen statistisch signifikante Unterschiede an, die durch Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Lernindexwerte konditionierter mutierter Tiere. Synchronisierte Wildtyp-N2- und mutierte Tiere wurden mit einer Mischung aus 1% wässrigem 1-Propanol und HCl (pH 4,0) durch (A) Massentraining 10x oder (B) 10x Spaced-Training konditioniert. Flussdiagramme der verwendeten Trainingsprotokolle mit Masse und Abstand sind in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2 dargestellt. Nach der Konditionierung konnten sich die Tiere für 10 min auf einer 6 cm langen Agarplatte für den Chemotaxis-Test bei einer RT von 18 °C bewegen. Die Daten für diese Zahl sind in der Zusatztabelle 2 enthalten. Das Balkendiagramm zeigt das 1. Quartil, den Median und das 3. Quartil. Sternchen (*P < 0,05) zeigen statistisch signifikante Unterschiede an, die durch Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Junge erwachsene Tiere reagieren empfindlich auf chemische Behandlung. Tag 4 und Tag 5 Wildtyp-N2-Tiere wurden nach dem Schlüpfen 10x mit HCl, pH 4,0, ohne Unterbrechung trainiert und dann auf Chemotaxis auf 5% wässriges 1-Propanol untersucht. Barren sind Mittelwerte ± S.E.M. (n = 19). Sternchen (*P < 0,05) zeigen statistisch signifikante Unterschiede an, die durch Zwei-Wege-ANOVA gefolgt vom Tukey-Kramer-Post-hoc-Test bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Daten gemäß Abbildung 4. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Daten gemäß Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

In der vorliegenden Studie wurden alle Reagenzien bei einer RT von durchschnittlich ~18 °C gehalten, und die Tiere wurden auf einer Bank am RT kultiviert, um Stress für die Tiere zu vermeiden. Darüber hinaus wurden alle experimentellen Verfahren an der RT durchgeführt. Die Tiere wurden zunächst in einem Inkubator bei 20 °C kultiviert und dann auf einer Bank bei ~24 °C mit Reagenzien am RT konditioniert. Unter diesen Bedingungen waren die Ergebnisse der Konditionierung sehr unterschiedlich. Bei niedrigem RT wächst C. elegans langsam und sollte länger als bei 20 °C kultiviert werden, bis die Tiere das reife Erwachsenenalter erreichen, da jüngere erwachsene Tiere empfindlicher auf die zur Konditionierung verwendeten Chemikalien reagieren als reife erwachsene Tiere und niedrigere CI-Werte aufweisen können.

Der kritischste Schritt für eine erfolgreiche Konditionierung ist das Waschen der Tiere mitddH2Ounmittelbar nach jeder chemischen Behandlung. Daher sollten mechanische und Temperaturbelastungen minimiert werden, indem abgesägte Pipettenspitzen verwendet werden, Reagenzien bei RT gehalten und die Tiere sehr sanft gewaschen werden, indem der Tiersammler in ddH2O sehr langsam auf und ab bewegt wird. Die Bedingungen der Chemotaxis-Assayplatten beeinflussen die Ergebnisse ebenfalls stark. Zu trockene oder zu nasse Platten verhindern eine reibungslose Fortbewegung der Tiere. Die Platten wurden wie in Schritt 1 beschrieben vorbereitet. eine gute Platte ist eine, bei der die 4 μL-Flecken vonddH2Ooder 5% wässrigem 1-Propanol in etwa 5 min nach der Schmierblutung vollständig vom Agar absorbiert werden. Wie oben beschrieben, ist auch das Alter der Tiere entscheidend für eine erfolgreiche Konditionierung. Junge erwachsene Tiere reagieren empfindlich auf mechanische und chemische Behandlung, was zu unterschiedlichen Ergebnissen führt, obwohl sehr alte Tiere möglicherweise auch nicht für die Konditionierung geeignet sind.

Die Haltbarkeit von 1-Propanol hängt von Marken und Chargen ab und beträgt bei RT weniger als 3 Monate. Wenn sich die C.I.-Werte naiver Tiere verschlechtern, wird empfohlen, frisches 1-Propanol für den Konditionierungs- und Chemotaxis-Test zu verwenden.

Die Gedächtnisbildung durch Massentraining wurde durch die Behandlung von Tieren mit Translationshemmern (Cycloheximid und Anisomycin) und einem Transkriptionsinhibitor (Actinomycin D) nicht beeinflusst, während die Gedächtnisbildung durch das Spaced-Training durch die Inhibitoren20,21 deutlich gehemmt wurde. Darüber hinaus verfiel das erste Gedächtnis durch Kälteschock, während letzteres länger als das erstere erhalten blieb und resistent gegen Kälteschock war. Diese Ergebnisse zeigen, dass ersteres STM und letzteres LTM bzw.20,21 ist. Das durch das Massentraining gebildete Gedächtnis kann jedoch aus STM und dem mittelfristigen (mittelfristigen) Gedächtnis bestehen, da STM schwach vom CREB-Transkriptionsfaktor abhängig ist (Abbildung 5A). Dies steht im Einklang mit dem Ergebnis, dass das STM länger als 1 h20,21 aufbewahrt wurde. Die Bildung von STM und LTM hängt stark von nmr-1 ab, das nur in sechs Neuronenpaaren (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG und PVC) in C. elegans27,28 exprimiert wird. In diesen Neuronen können NMDA-Rezeptoren daher als molekularer Koinzidenzdetektor von 1% wässrigen 1-Propanol- und HCl-Signalen (pH 4,0) für synaptische Plastizität fungieren, wobei die synaptische Verstärkung, die sowohl für STM als auch für LTM erforderlich ist, aus zufälligem Feuern von prä- und postsynaptischen Neuronen resultieren kann 29,30,31,32,33. Daher kann sich das aversive assoziative Gedächtnis unter den Interneuronen bilden.

Die in der vorliegenden Studie beschriebenen Methoden sollten für das appetitive olfaktorische Lernen und das Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis unter Verwendung von 1-Nonanol als CS und Kaliumchlorid als US21 anwendbar sein. Es ist interessant, die neuronalen Schaltkreise zu vergleichen, die an der Bildung appetitiver und aversiver Erinnerungen beteiligt sind.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir danken Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang und Hitomi Ohtaki für ihre technische Unterstützung und Kommentare zum Manuskript. Die Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center zur Verfügung gestellt, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung der Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

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References

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Neuroscience Ausgabe 184
Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

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