Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Аверсивное ассоциативное обучение и формирование памяти путем сопряжения двух химических веществ в Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Ранее мы разработали протоколы для Caenorhabditis elegans для формирования краткосрочных и долгосрочных ассоциативных воспоминаний путем массового и интервального обучения соответственно. Здесь подробно описаны протоколы кондиционирования C. elegans путем сопряжения 1-пропанола и соляной кислоты в качестве условных и безусловных стимулов, соответственно, для формирования аверсивной ассоциативной памяти.

Abstract

Нематода Caenorhabditis elegans является привлекательным модельным организмом для изучения обучения и памяти на молекулярном и клеточном уровнях из-за простоты своей нервной системы, химические и электрические схемы которой были полностью реконструированы из серийных электронных микроснимков тонких срезов. Здесь мы описываем подробные протоколы кондиционирования C. elegans путем массовой и распределенной тренировки для формирования кратковременной памяти (STM) и долговременной памяти (LTM) соответственно. Сочетая 1-пропанол и соляную кислоту в качестве условных и безусловных стимулов соответственно, C. elegans был успешно обучен формировать аверсивные ассоциативные СТМ и ЛТМ. В то время как наивных животных привлекал 1-пропанол, дрессированных животных больше не привлекал или очень слабо привлекал 1-пропанол. Как и в других организмах, таких как Aplysia и Drosophila, «гены обучения и памяти» играют важную роль в формировании памяти. В частности, Глутаматные рецепторы NMDA-типа, экспрессируемые только в шести парах интернейронов у C. elegans, необходимы для образования как STM, так и LTM, возможно, как фактор совпадения. Поэтому след памяти может находиться между интернейронами.

Introduction

Обучение и память жизненно важны для животных, чтобы выжить и размножаться, эффективно ориентируясь в изменяющейся среде. C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения обучения и памяти на молекулярном и клеточном уровнях из-за простоты его нервной системы, чьи химические и электрические схемы были полностью реконструированы из серийных электронных микроснимков тонких сечений 1,2,3.

C. elegans учится связывать температуру культивирования с голоданием и мигрирует от температуры своего роста с отвратительной памятью, длящейся в течение нескольких часов 4,5. Кондиционирование C. elegans хлоридом натрия (NaCl) в отсутствие пищи приводит к снижению хемотаксиса в сторону NaCl 6,7,8. В сочетании с едой притяжение бутанона усиливается в результате аппетитного обучения 9,10,11. Хотя эти явления интерпретируются как ассоциативное обучение и память10,12, различие между ассоциативным обучением и неассоциативной сенсибилизацией, привыканием и адаптацией не ясно в парадигме обучения и памяти C. elegans 13,14. Действительно, животные, обусловленные бутаноном и депривацией пищи (аверсивное обусловливание), показали подавленную связь сенсорного нейрона бутанона AWCON с целевыми нейронами сигналами инсулина от других нейронов, включая интернейроны AIA, в то время как животные, обусловленные бутаноном и пищей (аппетитное обусловливание), показали усиленную связь AWCON с целевыми нейронами15 . Передача сигналов инсулина вызывает изменения экспрессии генов, индуцированные ядерным EGL-4 и другими транскрипционными регуляторами16,17. Таким образом, это аверсивное и аппетитное обучение и память имеют аналогии с неассоциативным привыканием и сенсибилизацией, соответственно, пресинаптических сенсорных нейронов в жаберно-абстинентном рефлексе у Aplysia 18,19.

Объединив два химических вещества в качестве условного стимула (CS) и безусловного стимула (US), мы и другие разработали протоколы для обусловливания C. elegans для формирования ассоциативного обучения и памяти без использования пищи или голодания в качестве US 20,21,22,23. В настоящем исследовании протоколы модифицированы для кондиционирования животных с 1-пропанолом и соляной кислотой (HCl, pH 4.0) в качестве CS и US, соответственно, для аверсивного обучения и кратковременной памяти (STM) и долговременной памяти (LTM). Наивный C. elegans притягивается 1-пропанолом24 и отталкивается кислотой25. При кондиционировании смесью 1-пропанола и HCl (рН 4,0) C. elegans больше не привлекался или очень слабо притягивался к 1-пропанолу.

Protocol

1. Рецепты

  1. Агаровые пластины NGM (шаг 2.1.)
    1. Для приготовления 6 см пластин NGM растворяют 2,5 г пептона, 3 г NaCl и 17 г агара в 850 мл дважды деионизированногоH2O(ddH2O). Доведите общий объем до 972 мл с ddH2O.
    2. После автоклавирования охладите до ~65 °C и добавьте 1 мл холестерина 5 мг/мл, растворенного в этаноле, по 1 мл по 1 МCaCl2 и 1 М МгСО4 и 25 мл 1 М фосфата калия (рН 6,0). После хорошего перемешивания дозируйте по 8 мл каждой до 6 см (в диаметре) чашки Петри.
    3. Храните тарелки с крышками на скамейке при комнатной температуре (РТ) в течение 1 дня, а затем храните их в пластиковой посуде в холодном помещении до использования.
  2. Готовят среду Luria-Bertani (LB) (стадия 2.1.), растворяя 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl в 1 л ddH2O. Отрегулируйте рН до 7,0 с 5 N NaOH (несколько капель) и стерилизуйте автоклавированием.
    1. Приготовьте пластины LB, добавив 15 г агара в среду LB. После автоклавирования охладите до ~60 °C и дозируйте по 12 мл до 9 см (в диаметре) чашки Петри. Храните тарелки в пластиковой посуде в холодном помещении до использования.
  3. Для изготовления животного коллектора (шаг 2.4.) прикрепите нейлоновую сетку (размер сетки 30 мкм) к дну прозрачной акриловой цилиндрической трубы (3,5 см в длину, 3 см во внешнем диаметре, 2 мм в толщине стенки) с помощью клея.
  4. Для приготовления 0,25% водного раствора желатина (стадия 2.4.) растворяют 0,25 г желатина в 100 мл ddH2O. Стерилизуют автоклавированием.
  5. Пластины для анализа хемотаксиса (шаг 5.1.)
    1. Чтобы сделать агаровые пластины для анализа хемотаксиса, растворите 15 г агара в 993 мл ddH2Oпутем автоклавирования и охладите раствор до ~65 °C.
    2. Затем добавляют 5 мл автоклавного 1 М фосфата калия (рН 6,0), 1 мл 1 МCaCl2 и 1 мл 1 М МгСО4 в раствор агара. Все эти растворы отдельно стерилизуются автоклавированием.
    3. Дозировать 10 мл смешанного раствора на чашку Петри размером 6 см. Поместите эти тарелки с крышками на скамейку в RT на два дня, а затем положите их на влажные бумажные полотенца в пластиковой посуде в RT до использования. Эти пластины можно использовать до 10 дней.
  6. Для получения буфера для анализа хемотаксиса (стадия 5.4.) смешайте 5 мл 1 М фосфата калия (рН 6,0), 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 1 M MgSO4 и 993 мл ddH2O. Отдельно стерилизуют все эти растворы путем автоклавирования.
  7. Чтобы получить 40 мл смеси CS/US раствора (1% водного 1-пропанола и HCl [рН 4,0]) (стадия 3.1. и стадия 4.1.), добавляют 0,4 мл абсолютного 1-пропанола и 4 мкл 5 М HCl (0,1 мМ при конечной концентрации) до 39,6 мл ddH2O. Держат раствор при РТ.
  8. Чтобы сделать ddH2O, обработайте водопроводную воду 2x системами очистки воды (см. Таблицу материалов).
  9. Готовят жидкую культуру (OD600 = ~0,7) Escherichia coli OP50 путем инокуляции свежей колонии зубочисткой в 10 мл среды LB и инкубации при 37 °C в течение 7-8 ч. Бактерии, культивируемые в течение более длительного периода, могут влиять на результат кондиционирования, возможно, из-за вторичных метаболитов.

2. Подготовка синхронизированного С.  элеганс

  1. Используя стандартные методы26, культивируют животных на 6 см плитах NGM (шаг 1.1.). Пластины NGM получают путем разбрасывания 0,2 мл жидкой культуры E. coli OP50 в среде LB (см. этап 1.9.) и инкубации на RT в течение не более 24 ч (старые бактерии могут влиять на результат кондиционирования).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обучение и память C. elegans чрезвычайно чувствительны к механическим, химическим и температурным нагрузкам. Поэтому настоятельно рекомендуется выращивать животных, поддерживать все реагенты, включая воду, и выполнять все анализы при РТ между 17 ° C и 20 ° C. Следует избегать физической и механической стимуляции, такой как вихрь, грубое пипетирование и центрифугирование. Свежий 1-пропанол следует использовать каждые 3 месяца дольше по неизвестной причине. Важно отметить, что животные должны выращиваться с большим количеством пищи, так как голодание может серьезно повлиять на результат кондиционирования.
  2. На 1-й день выберите и поместите пять сытых гравидных животных (поместите больше мутантных животных, которые медленно откладывают яйца) на каждую из четырех пластин NGM размером 6 см с помощью сборщика платиновых червей и дайте им отложить ~ 50 яиц в течение 3 часов на RT, чтобы получить синхронизированную популяцию взрослых животных. Остановите яйцекладку, удалив родительских животных с тарелок с помощью платинового червячного сборщика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные пластины должны храниться в RT, чтобы свести к минимуму стресс для животных.
  3. Культивируйте животных в RT в течение примерно 5 дней, что является временем, которое требуется животным, чтобы достичь своей зрелой взрослой стадии, а не молодой взрослой стадии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Период культивирования между 4,5 днями и 5,5 днями должен быть скорректирован в зависимости от условий, поскольку молодые взрослые животные более чувствительны к химическим веществам, используемым для кондиционирования, чем зрелые взрослые животные (дополнительный рисунок 1). После кондиционирования молодые взрослые животные могут показывать более низкие значения индекса хемотаксиса (C.I.).
  4. Соберите ~ 200 взрослых животных в сборщике животных (см. шаг 1.4.), промыв каждую пластину 1 мл 0,25% водного желатина (шаг 1.4.) Этот водный желатин предотвращает прилипание животных к поверхности пластмасс, таких как наконечники пипеток.
  5. Промывайте животных в коллекторе с ddH2O (шаг 1.8.), очень осторожно перемещая коллектор вверх и вниз в ~ 10 мл ddH2O. Повторите этот процесс еще в 2 раза (всего 3x) с ~ 10 мл ddH2O каждый, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальное загрязнение серьезно влияет на хемотаксис животных.

3. Массовая тренировка для кратковременного ассоциативного обучения и памяти

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс массового обучения см. на рисунке 1 .

  1. Осторожно погружают животный сборщик, содержащий ~200 животных, в 40 мл смеси 1% 1-пропанола и HCl (рН 4,0 после смешивания с 1-пропанолом; см. этап 1,7.) в кристаллизующуюся посуду в течение ~1 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контрольных животных делайте то же самое, но погружайте только в 1% водный 1-пропанол. Было бы лучше относиться к животным с HCl (рН 4,0) только в качестве еще одного контроля.
  2. Промывайте животных в коллекторе, очень осторожно погружая коллектор 1x в 10 мл ddH2Oв лунку из 6-луночной тканевой культуральной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг стирки должен быть очень мягким и выполняться только 1 раз, так как обширная стирка может помешать обучению.
  3. Повторите шаги 3.1. и 3.2. 10x без перерыва (межпробный интервал [ITI], 0 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий ddH2O каждый раз на RT.
  4. Поместите коллектор на газон E. coli OP50 на плиту NGM 6 см на 10 минут в RT, чтобы животные могли отдохнуть.
  5. Мойте животных в коллекторе с ddH2O, очень осторожно перемещая коллектор вверх и вниз в ~ 10 мл ddH2O. Повторите этот процесс еще в 2 раза (всего в 3 раза) с ~ 10 мл ddH2O каждый, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
  6. Перейдите к анализу хемотаксиса, как описано ниже (шаг 5).

4. Интервальная тренировка для долгосрочного ассоциативного обучения и памяти

ПРИМЕЧАНИЕ: См. рисунок 2 для рабочего процесса обучения с интервалом.

  1. Осторожно погружайте сборщик животных, содержащий ~200 животных, в 40 мл смеси 1% 1-пропанола и HCl (рН 4,0 после смешивания с 1-пропанолом; см. этап 1,7.) в кристаллизующуюся посуду в течение ~1,0 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проделайте то же самое с 1% водным 1-пропанолом только в качестве контрольной. Было бы лучше относиться к животным с HCl (рН 4,0) только в качестве еще одного контроля.
  2. Промывайте животных в коллекторе, очень ненадолго погружая коллектор 1x в 10 мл ddH2Oв лунку из 6-луночной пластины для культуры тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта стирка должна быть очень короткой, так как обширная стирка может помешать обучению.
  3. Поместите коллектор на газон E. coli OP50 на агаровую пластину NGM в чашку Петри диаметром 6 см (диаметром) в течение 10 минут в RT, чтобы животные могли отдохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот отдых в течение 10 минут, так как ITI имеет решающее значение для животных, чтобы консолидировать воспоминания для формирования LTM.
  4. Повторите шаги 4.1.-4.3. в 10х.
  5. Мойте животных в коллекторе с ddH2O, очень осторожно перемещая коллектор вверх и вниз в ~10 мл ddH2O, который хранится на RT. Повторите этот процесс еще в 2 раза (всего 3x) с ~ 10 мл ddH2O каждый, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
  6. Перейдите к анализу хемотаксиса, как описано ниже (шаг 5.).

5. Анализ хемотаксиса

  1. Приготовьте агаровые пластины для анализа хемотаксиса в 6 см пластиковых чашках Петри (см. шаг 1.5.).
  2. Перенесите животных в коллектор (этап 2.5.), который помещается на плоскую поверхность пластиковой крышки чашки Петри, в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с 1 мл 0,25% водного желатина с помощью отпиленного наконечника пипетки с отверстием >1 мм (внутренний диаметр).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать отпиленный наконечник пипетки, чтобы свести к минимуму нагрузку на животных.
  3. Удалите супернатант из трубки после того, как животные осядут на дне трубки под действием силы тяжести в течение ~ 1 мин (не центрифугировать).
  4. Осторожно повторно суспендируйте животных в 1 мл буфера анализа хемотаксиса (см. шаг 1.6.) и дайте им самим отойти под действием силы тяжести на дно трубки в течение ~ 1 мин (не центрифугировать). Удалите как можно больше супернатанта путем пипетки.
  5. Между тем, по диагонали обнаружить 4 мкл каждого из 5% водного 1-пропанола в двух местах и обнаружить по 4 мкл каждого из ddH2Oв двух других местах таким же образом, как показано на рисунке 3A. Для анализа хемотаксиса мутантов, которые имеют более низкую чувствительность к 1-пропанолу, определите более высокие концентрации водного 1-пропанола, которые приводят к ~ 0,6 значения индекса хемотаксиса (C.I.) наивных мутантов, как показано в дополнительной таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно как можно быстрее завершить процедуры кровянистых выделений. Пятно 5% водного 1-пропанола, так как 1% водного 1-пропанола слишком слаб, чтобы привлечь животных в анализ хемотаксиса. Напротив, используйте 1% водного 1-пропанола для кондиционирования, поскольку животные, получавшие более высокие концентрации водного 1-пропанола, чем 1%, показали более низкие значения СИ.
  6. Обнаружите 6 мкл порций суспензии животного в буфере анализа хемотаксиса (стадия 5.4.), содержащем ~60 животных в центре трех пластин для анализа хемотаксиса, используя отпиленный наконечник пипетки с отверстием ~1,0 мм (внутренний диаметр). Удалите как можно больше жидкости с помощью лабораторного тканевого фитиля, не прикасаясь к животным, и поместите крышку на пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить эти процедуры как можно быстрее.
  7. Дайте животным свободно перемещаться по тарелке в течение 10 мин на RT, а затем переложите тарелку в стеклянную чашку Петри на льду в течение 3 мин, чтобы остановить хемотаксис. Затем держите тарелку в холодильнике до подсчета количества животных на тарелке.
  8. Подсчитайте количество животных в четырех секциях, за исключением тех, которые находятся в центральном круге, под стереомикроскопом и рассчитайте индекс хемотаксиса (C.I.), используя уравнение, показанное на рисунке 3B. Из значений C.I. рассчитайте значения индекса обучения (L.I.) как разницу между значением C.I. эталонных животных и значением C.I. условных животных (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значение C.I. эталонных животных (C.I.reference) является средним значением значений C.I. животных, обусловленных только 1% водного 1-пропанола.

Representative Results

C. elegans был обусловлен массовым обучением для формирования кратковременной аверсивной ассоциативной памяти путем сопряжения 1% водного 1-пропанола и HCl (pH 4,0) с CS и US соответственно. Согласно протоколу, описанному выше, синхронизированных животных выращивали на скамейке при РТ 18 °C в течение 5 дней и очень осторожно мыли 2x с ddH2O при RT 18 °C. Затем животных обусловли смесью 1% водного 1-пропанола и HCl (рН 4,0) в течение 1 с. Мы также обучали животных только с ddH2O, 1% водного только 1-пропанола и HCl (pH 4,0) только в качестве эталонов. После кондиционирования животных мыли 1x с ddH2O. Мы повторили кондиционирование 10x без перерыва (без ITI). Успешное кондиционирование было достигнуто путем повторения процедуры более чем от 7x до 10x. Кондиционирование более чем в 10 раз привело к менее эффективному обучению21. После дрессировки животные отдыхали на бактериальной пище в течение 10 мин при РТ (18 °C). После промывки ddH2O 3x животных переносили в микроцентрифужную трубку путем подвешивания в 0,25% водного желатина и под действием силы тяжести оседали на дно. После удаления супернатанта настолько, насколько это было возможно, животных осторожно повторно суспендировали в буфере анализа хемотаксиса, а затем позволили оседать на дно трубки под действием силы тяжести.

После удаления как можно большего количества супернатанта суспензию животного заметили на центральном круге хемотаксисной пробирной пластины, которая держалась при РТ 18 °C, а затем животным разрешалось свободно перемещаться по пластине в течение 10 минут при RT 18 °C. Значения C.I. были рассчитаны с использованием уравнения, показанного на рисунке 3B. Как показано на рисунке 4А, животных, обусловливавших смесью 1% 1-пропанола и HCl, больше не привлекали 5% 1-пропанолом, замеченным на агаровых пластинах для анализа хемотаксиса, тогда как наивных и эталонных животных аналогичным образом привлекали к 5% 1-пропанолу. После массовой тренировки (шаг 3.) память уже не наблюдалась в течение 3 ч20. Кроме того, память, сформированная массовыми тренировками, была чувствительна к холодному шоку20. Эти результаты демонстрируют, что C. elegans успешно сформировал аверсивную СТМ путем массового обучения.

Животные также были обусловлены разнесенной тренировкой 10x с 10-минутным ITI между этапами обучения (шаг 4.). Во время ITI коллектор с животными был помещен на бактериальный газон на плите NGM 6 см при RT 18 °C. Животных, обусловленных разнесенной тренировкой смесью 1% водного 1-пропанола и HCl (рН 4,0), больше не привлекали 5% 1-пропанолом по сравнению с животными, получавшими только 1% 1-пропанол, только HCl (рН 4,0) или только ddH2O(рисунок 4B). После разнесенной дрессировки животные сохраняли память более 12 ч20,21. Более того, память не формировалась при лечении животных ингибиторами трансляции или транскрипции и была устойчива к холодовому шоку20,21. Поэтому C. elegans успешно сформировал аверсивный LTM путем разнесенной тренировки.

Мы также изучили влияние мутаций в «генах обучения и памяти» на формирование STM и LTM. Ген crh-1 кодирует вездесущий транскрипционный фактор цАМФ-ответ элемента-связывающий белок (CREB), glr-1 и nmr-1 кодируют α-амино-3-гидроксил-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота (AMPA)-тип и N-метил-D-аспартат (NMDA)-тип глутаматных рецепторов, соответственно, а stau-1 кодирует двухцепочечный РНК-связывающий белок Staufen изоформу. Эти гены играют важную роль в классическом обусловливании у C. elegans, Drosophila, Aplysia и мышей. При использовании смеси 1% водного 1-пропанола и HCl (рН 4,0) образование СТМ и ЛТМ зависело от всех генов (рис. 5А,В).

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная схема массового обучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Экспериментальная схема интервального обучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ хемотаксиса и индекс хемотаксиса. (А) Схематическое изображение пластины анализа хемотаксиса. Чашки Петри (диаметром 6 см) были разделены на четыре области, как показано на рисунке, и по 4 мкл каждой из 5% водного 1-пропанола или ddH2O были по диагонали замечены в двух местах каждая, на расстоянии 2 см от центра. (B) Значения индекса хемотаксиса были рассчитаны на основе уравнения, показанного путем подсчета количества животных в областях "a" и "b" после завершения хемотаксиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Значения индекса хемотаксиса животных, обусловленных химическими веществами. Синхронизированные дикие животные N2 были обусловлены химическими веществами, обозначенными (A) массовым обучением 10x или (B) интервальным обучением 10x. Блок-схемы используемых массовых и разнесенных протоколов обучения показаны на рисунке 1 и рисунке 2 соответственно. После кондиционирования животные могли свободно перемещаться в течение 10 минут на 6-сантиметровой агаровой пластине для анализа хемотаксиса при РТ 18 °C. Значения C.I. были рассчитаны с использованием уравнения, показанного на рисунке 3B. Данные по этому показателю приводятся в дополнительной таблице 1. Данные наивных животных были перерисованы на обеих фигурных панелях. График бара показывает 1-й квартиль, медиану и 3-й квартиль. Звездочки (*P < 0,05) указывают на статистически значимые различия, определяемые односторонней ANOVA, за которой следует множественный сравнительный тест Даннетта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Значения индекса обучения условных мутантных животных. Синхронизированные дикие животные N2 и мутантные животные были обусловлены смесью 1% водного 1-пропанола и HCl (pH 4,0) путем (A) массового обучения 10x или (B) интервального обучения 10x. Блок-схемы используемых массовых и разнесенных протоколов обучения показаны на рисунке 1 и рисунке 2 соответственно. После кондиционирования животные могли свободно перемещаться в течение 10 минут на 6-сантиметровой агаровой пластине для анализа хемотаксиса при РТ 18 °C. Данные по этому показателю приводятся в дополнительной таблице 2. График бара показывает 1-й квартиль, медиану и 3-й квартиль. Звездочки (*P < 0,05) указывают на статистически значимые различия, определяемые односторонней ANOVA, за которой следует множественный сравнительный тест Даннетта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Молодые взрослые животные чувствительны к химической обработке. На 4-й день и на 5-й день диких животных N2 после вылупления обучали массированно 10 раз с HCl, рН 4,0, без перерыва и затем анализировали на хемотаксис до 5% водного 1-пропанола. Бары означают ± S.E.M. (n = 19). Звездочки (*P < 0,05) указывают на статистически значимые различия, определяемые двусторонней ANOVA, за которой следует пост-хок-тест Туки-Крамера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Данные, соответствующие рисунку 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Данные, соответствующие рисунку 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

В настоящем исследовании все реагенты содержались при РТ ~ 18 ° C в среднем, а животные выращивались на скамейке в RT, чтобы избежать стресса для животных. Кроме того, все экспериментальные процедуры были проведены в РТ. Животных первоначально культивировали в инкубаторе при 20 °C, а затем кондиционировали на скамейке при ~24 °C с использованием реагентов в RT. В этих условиях результаты обусловливания были очень изменчивыми. При низком РТ C. elegans растет медленно и должен культивироваться дольше, чем при 20 ° C, пока животные не достигнут зрелой стадии взрослой жизни, поскольку молодые взрослые животные более чувствительны к химическим веществам, используемым для кондиционирования, чем зрелые взрослые животные, и могут показывать более низкие значения ИИ.

Наиболее важным этапом для успешного кондиционирования является промывка животных с ddH2Oсразу после каждой химической обработки. Поэтому механические и температурные напряжения должны быть сведены к минимуму путем использования отпиленных наконечников пипеток, хранения реагентов на RT и очень осторожного мытья животных, очень медленно перемещая коллекционер животных вверх и вниз в ddH2O. Тщательная промывка животных каждый раз после кондиционирования может повлиять на обучение и память. Состояние пластин анализа хемотаксиса также серьезно влияет на результаты. Слишком сухие или слишком влажные пластины препятствуют плавному передвижению животных. Пластины готовили, как описано на этапе 1.; Хорошей пластиной является та, для которой пятна 4 мкл ddH2Oили 5% водного 1-пропанола полностью поглощаются агаром примерно через 5 мин после пятен. Как описано выше, возраст животных также имеет решающее значение для успешного кондиционирования. Молодые взрослые животные чувствительны к механической и химической обработке, что приводит к переменным результатам, хотя очень пожилые животные также могут не подходить для кондиционирования.

Срок годности 1-пропанола зависит от марок и партий и составляет менее 3 месяцев на РТ. Когда показатели ИИ наивных животных ухудшаются, рекомендуется использовать свежий 1-пропанол для кондиционирования и анализа хемотаксиса.

На формирование памяти путем массовой дрессировки не влияло лечение животных ингибиторами трансляции (циклогексимид и анизомицин) и ингибитором транскрипции (актиномицин D), в то время как формирование памяти при разнесенной тренировке заметно тормозилось ингибиторами20,21. Кроме того, первая память разлагалась в результате холодного шока, в то время как вторая сохранялась в течение более длительного периода, чем первая, и была устойчива к холодному шоку. Эти результаты показывают, что первый - STM, а второй - LTM, соответственно20,21. Однако память, сформированная массовой тренировкой, может состоять из STM и среднесрочной (среднесрочной) памяти, поскольку STM слабо зависит от фактора транскрипции CREB (рисунок 5A). Это согласуется с результатом, в результате которого STM сохранялся более 1 ч 20,21. Образование как STM, так и LTM сильно зависит от nmr-1, который выражается только в шести парах нейронов (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG и PVC) в C. elegans27,28. Таким образом, в этих нейронах NMDA-рецепторы могут действовать как молекулярный детектор совпадения 1% водных сигналов 1-пропанола и HCl (рН 4,0) для синаптической пластичности, где синаптическое усиление, необходимое как для STM, так и для LTM, может быть результатом случайного возбуждения пре- и постсинаптических нейронов 29,30,31,32,33. Поэтому среди интернейронов может образоваться аверсивная ассоциативная память.

Методы, описанные в настоящем исследовании, должны быть применимы для аппетитного обонятельного обучения и краткосрочной и долгосрочной ассоциативной памяти с использованием 1-нонанола в качестве CS и хлорида калия в качестве US21. Интересно сравнить нейронные цепи, которые участвуют в формировании аппетитных и аверсивных воспоминаний.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарны Такаси Мураяме, Эй-итиро Сайта, Иоу Вен Чангу и Хитоми Охтаки за их техническую помощь и комментарии к рукописи. Штаммы были предоставлены Центром генетики Caenorhabditis, который финансируется Национальным центром исследовательских ресурсов NIH (NCRR). Эта работа была поддержана финансированием Окинавского института науки и техники последипломного университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Tags

Неврология выпуск 184
Аверсивное ассоциативное обучение и формирование памяти путем сопряжения двух химических веществ в <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter