Summary
Immunohistochemische methoden zijn nuttig in honingbijenonderzoek om het niveau van apoptose en necrose in de midgut- en hypofaryngeale klieren van volwassen bijen te detecteren en te beoordelen.
Abstract
Honingbijen (Apis mellifera L.) in de korf (verpleegsters en andere bijenkorfbijen) en buiten de korf (foerageerders) worden blootgesteld aan klimaat- en weersveranderingen, verschillende pesticiden, pathogenen en ondervoeding, voornamelijk via de mond en voornamelijk van invloed op het spijsverteringskanaal van volwassen bijen. Om de effecten van dergelijke externe en interne stressoren op honingbijen te begrijpen en te voorkomen, is een nuttige onderzoeksmethode de immunohistochemische methode. Een basisprotocol wordt beschreven om de midgut (ventriculus) en hypofaryngeale klieren (HPG's) van volwassen bijen voor te bereiden op histologische analyse. Een gedetailleerde methodologie wordt beschreven om het niveau van celbeschadiging te beoordelen en necrose te onderscheiden van geprogrammeerde celdood (apoptose) als een natuurlijk proces van weefselregeneratie. De resultaten van volwassen honingbijenbehandeling met oxaalzuur en pesticiden (insecticide en acaricide) en de bepaling van celdood in de ventriculus en HPG's worden gepresenteerd. Ook de voor- en nadelen van de methodiek komen aan bod.
Introduction
Honingbijen (Apis mellifera L.) zijn, naast andere wilde bestuivers, de belangrijkste bestuivers van landbouwgewassen. Gedurende duizenden jaren heeft de veranderende omgeving bijen beïnvloed om hun morfologie, fysiologie, gedrag en tolerantie aan te passen aan verschillende pathogenen en parasieten. Daarom hebben honingbijen een zeer divers scala aan soorten en ondersoorten over de hele wereld ontwikkeld1. Deze resultaten komen overeen met eerdere bevindingen, dat er genetische variatie is in de structuur van het spijsverteringskanaal van de honingbij, maar suggereren ook dat veranderingen van het midgut te wijten zijn aan omgevingsfactoren 2,3.
Het spijsverteringskanaal van de honingbij bestaat uit drie hoofdonderdelen: foregut, midgut (ventriculus) en hindgut4. De ventriculus is een essentieel orgaan voor de vertering van stuifmeel en nectar/honing; in het achterbeen vindt osmotische controle plaats door absorptie van water en ionen2. De hypofaryngeale klieren (HPG's) van honingbijwerkers bevinden zich in het hoofd en synthetiseren en scheiden koninginnengeleicomponenten af om het broed, de koningin en leden van de kolonie te voeden. Hun grootte verandert met leeftijd en taken en is afhankelijk van de juiste voeding (kwaliteit stuifmeel). Verpleegsters van 6 tot 18 dagen voeren broedopfok uit en de grootte van HPG's neemttoe met 5,6. Bij foerageerbijen degenereren de HPG's en scheiden ze alleen enzymen af die belangrijk zijn om de complexe suikers om te zetten in eenvoudige (α-glucosidases, leucine arylamidase, invertase) in honing7.
Honingbijen worden blootgesteld aan verschillende biotische en abiotische stressoren8, en het spijsverteringskanaal kan worden beïnvloed door verschillende negatieve stimulerende middelen. De eerste barrière die het organisme beschermt tegen pathogenen is het peritrofe membraan in het midgut, dat bestaat uit darmslijmvlies om te beschermen tegen pathogenen4. De ontwikkeling en functie van HPG's zijn afhankelijk van dieet, leeftijd en kolonieconditie9 en worden beïnvloed door insecticiden, acariciden10 en pathogenen 11,12,13. Acaricideresiduen in de korf als gevolg van varroabestrijding en pesticiden uit het milieu beïnvloeden foerageerbijen en verpleegbijen14,15. De grootste bedreiging voor honingbijenkolonies is de mijt Varroa-destructor, zowel als vector van virussen die bijdragen aan kolonieverliezen16 als als consument van het vetlichaam van de gastheer (een belangrijk vitaal orgaan in honingbijen), wat bijgevolg het lichaam en de koloniefuncties van het individu beïnvloedt17.
Intensieve landbouwgrondhabitats kunnen echter op korte termijn zorgen voor een voedselvoorziening voor honingbijen. Daarom moeten agromilieuregelingen de beschikbaarheid van honingbloemen in landbouwlandschappen vergroten18. Om de morfologie van verschillende ondersoorten 6,19,20,21 of subletale effecten van deze factoren op cel- of weefselniveau, met name midgut en HPG's, te beoordelen, zijn histologische en immunohistochemische methoden praktisch en voldoende nauwkeurig om te worden gebruikt in histologisch onderzoek bij honingbijen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Basis histologie voor honingbijenonderzoek
- Dissectie van honingbijenweefsel
OPMERKING: Gebruik voor de dissectie van werkbijen een ontleedmicroscoop met een LED-lichtbron. De meest bruikbare vergroting is ~20x.- Manipulatie en dissectie
- Neem voorzichtig een werkbij met een tang en zet deze gedurende 2 minuten op ijs (of in de vriezer bij -20 °C) om hem te immobiliseren22. Pin de bij twee keer diagonaal door het bovenste achterste gedeelte van de thorax op de petrischaal, van links naar rechts en van rechts naar links.
- Giet insectenzout om het lichaam te bedekken. Plaats de petrischaal onder de microscoop, stel scherp en pas aan.
- Bereid de instrumenten voor (zie de materiaaltabel).
- Dissectie van midgut
- Begin met de buik door één punt van de schaar onder de tergite A5 (figuur 1) in het midden van de rechterkant van het bijenlichaam in te brengen. Gesneden naar de tergootS2.
- Houd het binnenste mes van de schaar parallel aan de zijkant van het lichaam om te voorkomen dat de inwendige organen worden beschadigd. Draai de schaar naar links en maak een knip; sla rechtsaf en maak nog een snede. Open voorzichtig het linkerdeel van de buik en speld het vast. Herhaal dit aan de andere kant.
- Gebruik een tang met één hand, trek de honingbijenmaag voorzichtig naar boven en snijd met een schaar in de andere hand helemaal aan het einde van de slokdarm. Trek de maag en het middendarm weg van de buik en snijd in het rectum. Gebruik een pipet met insectenzoutoplossing en verwijder eventuele uitwerpselen of delen van het weefsel.
- Dissectie van HPG's
- Immobiliseer een werkbij op ijs zoals beschreven in stap 1.1.1. Snijd de kop af en plaats deze op de kleinere plaat met de antennes naar boven gericht. Beveilig het hoofd met twee pinnen: een door het linker samengestelde oog en de tweede door het rechter samengestelde oog.
- Maak een snede over het eerste samengestelde oog aan de binnenkant van de pinnen, ga verder naar het labrum en maak vervolgens nog een snede aan de andere kant over het tweede samengestelde oog (figuur 2).
- Knip de antennes af. Til het masker af en knip waar het nog vastzit. Neem de tang en verwijder voorzichtig de klieren samen met de hersenen en een deel van de samengestelde ogen.
- Manipulatie en dissectie
- Fixatie, uitdroging en inbedding van paraffine
LET OP: Draag beschermende handschoenen.- Plaats het weefsel in penicillineflessen, 3/4 gevuld met 10% formaline. Bewaren in de koelkast bij 4 °C.
- Na 24 uur droogt u het weefsel uit in een reeks alcoholen: 70%, 80%, 90%, 100%, elk 1 uur, 100% 2-propanol gedurende 1 uur, 100% 2-propanol gedurende 12 uur en ten slotte 100% 2-propanol gedurende 1 uur.
- Plaats het weefsel in histocassettes; markeer en plaats ze in de glazen kamers met 2-propanol en paraffine (1:1) in een incubator bij 60 °C gedurende 24 uur.
- Verplaats de histocassettes naar een andere kamer met paraffine (I.) gedurende nog eens 24 uur. Herhaal de procedure met verse paraffine nogmaals tweemaal (II. en III.), beide gedurende 24 uur.
- Bereid ten slotte het montagestation voor en begin met het inbedden van het weefsel in was.
- Open elke histocassette en verwijder de klep. Vul de mal met was en leg het weefsel voorzichtig met een warme tang in het midden van de mal.
- Leg de histocassette op de vorm en bedek deze lichtjes met was. Plaats de mal onmiddellijk een paar seconden op het koude oppervlak van het montagestation en plaats deze vervolgens een paar minuten op de koude plaat totdat de was uithardt en zich samen en de histocassette van de mal scheidt.
- Bewaar de afgewerkte monsters in een doos, uit de buurt van stof en warmte.
- Snijd 4 μm dunne secties op een microtoom: eerst twee secties aan elkaar bevestigd en vervolgens één afzonderlijk. Breng de secties over met een tang en laat ze drijven op gedestilleerd water (42 °C) en verzamel ze vervolgens op schone glijbanen door twee secties samen aan de linkerkant van het objectiefglas en de derde aan de rechterkant te plaatsen, waarbij ze duidelijk gescheiden blijven. Laat de gemarkeerde dia's 's nachts op het verwarmingsapparaat achter en bewaar ze ten slotte in een doos die is bestemd voor histologiemonsters.
- Wasgoed en rehydratatie
LET OP: Draag beschermende handschoenen.- Bereid negen Coplin-potten en plaats de secties in een reeks opruimmiddelen (I., II., III.) gedurende elk 5 minuten.
- Doe in 2-propanol, ethanol 96% (I., II.), alcohol 90% en 80%, en gedestilleerd water gedurende 3 minuten elk.
- Verven met hematoxyline en eosine
LET OP: Draag beschermende handschoenen.- Bereid zes Coplin-potten.
- Voor hematoxyline en eosine (H &E) kleuring, plaats de ontwaste, gerehydrateerde secties in hematoxyline gedurende 5 minuten en plaats ze vervolgens voorzichtig onder het stromende leidingwater gedurende 2 minuten. Doe ze vervolgens 1 min in gedestilleerd water en 4 minuten in eosine (voor eosine is de Coplin-pot niet nodig).
- Plaats de dia's in ethanol 96% gedurende 1 min, vervolgens 2-propanol gedurende 2 minuten en ten slotte gedurende 2 minuten in het opruimmiddel.
- Voeg montagemedium en een afdekglas toe en laat ze drogen. Observeer onder een lichtmicroscoop.
Figuur 1: Dorsale weergave van het lichaam van honingbijen. A1-A7 tergites. De gedetailleerde instructies over honingbijdissectie zijn te vinden in Carreck et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Dorsale weergave van HPG's, delen van samengestelde ogen die aan de hersenen zijn bevestigd (niet zichtbaar). Een jonge werkbij van 5 tot 6 dagen heeft mollige en roomwitte HPG's. De acini bevinden zich op de hersenen en vullen het hoofdgebied met takken die de achterkant van de hersenen bereiken. Bij foeragerende bijen zijn deze klieren sterk gekrompen en laten ze alleen dunne draadachtige overblijfselen achter. Om deze reden is het beter om klieren samen met de hersenen te verwijderen om het gemakkelijker te maken bij verdere procedures om te voorkomen dat het weefsel verloren gaat. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. Celdooddetectie in weefselsecties
- Apoptose detectie kit (Assay A)
OPMERKING: Volg het protocol van de fabrikant (zie de tabel met materialen).- Bereid de Coplin potten.
- Dompel na het verwijderen en rehydrateren (zie stap 1.3) de dia's onder in 0,85% NaCl-oplossing en vervolgens in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (5 min).
- Zet de dia's in 4% paraformaldehyde 2 x 15 min.
- Plaats de dia's plat in de container en voeg 100 μL proteïnase K (20 μg/ml) oplossing toe en laat ze vervolgens 10-30 min staan.
- Plaats de dia's in PBS (5 min).
- Plaats de dia's in 4% paraformaldehyde in PBS (5 min).
- Dompel de dia's onder in PBS (2 x 5 min).
- Plaats de dia's plat in de container, voeg 100 μL equilibratiebuffer toe en laat ze 5-10 minuten staan.
- Voeg 100 μL TdT-reactiemengsel toe. Leg papieren handdoeken in de container, rond de glijbanen, bevochtig de handdoeken met water en dek af met plasticfolie. Incubeer dia's gedurende 60 min bij 37 °C.
- Plaats de glaasjes terug in het beitsrek en dompel ze gedurende 15 minuten onder in 2x zout-natriumcitraat (SSC).
- Dompel de dia's 3 x 5 minuten onder in PBS, vervolgens in 0,3% waterstofperoxide gedurende 3-5 minuten en vervolgens opnieuw in PBS, 3 x 5 min.
- Plaats de dia's opnieuw plat in de container, voeg 100 μL Streptavidin HRP (mierikswortelperoxidase) toe en laat 30 minuten staan (dek af met plasticfolie).
- Dompel de dia's 3 x 5 min onder in PBS.
- Plaats de dia's plat in de container en voeg 100 μL 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing toe. Zoek naar een lichtbruine achtergrond.
- Breng de dia's terug naar het rek en was ze meerdere keren in water (dubbel gedestilleerd).
- Monteer de dia's onder glazen afdekkingen in montagemedium en laat plat drogen.
- Observeer onder een lichtmicroscoop.
- Apoptose detectie kit (Assay B)
OPMERKING: Volg het protocol van de fabrikant (zie de tabel met materialen).- Bereid Coplin-potten.
- Bereid Proteïnase K (20 μg/ml verdund in PBS).
- Na het ontwasvrij maken en opnieuw hydrateren van de secties (stap 1.3), plaatst u de dia's gedurende 5 minuten in PBS.
- Plaats de dia's plat in de container en voeg Proteïnase K (20 μg/ml, 60 μL per monster van 5 cm²) toe.
- Was de dia's 2 x 2 min in gedestilleerd water.
- Doven in endogene peroxidase (in 3% waterstofperoxidase) bij kamertemperatuur.
- Spoel de dia's 2 x 5 min af met PBS of water.
- Plaats de dia's plat in de container en breng de equilibratiebuffer (75 μL/5 cm2) gedurende 10 s bij kamertemperatuur aan.
- Veeg voorzichtig rond het weefsel.
- Voeg het TdT-enzym (terminale deoxynucleotidyltransferase) toe aan elke sectie en incubeer in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij 37 °C. Leg papieren handdoeken in de lade, rond de glijbanen, bevochtig de handdoeken met water en bedek ze met plasticfolie.
- Leg de monsters na de incubatie in het rek en laat ze in stop/wasbuffer (10 min).
- Verwarm het anti-digoxigenine conjugaat tot kamertemperatuur.
- Was de dia's in PBS (3 x 1 min).
- Veeg voorzichtig rond het weefsel af.
- Voeg twee druppels Anti-Digoxigenin-Peroxidase conjugaat (65 μL/5 cm²) toe aan de secties en incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde container.
- Na het wassen in PBS 4 x 2 min, bereidt u peroxidasesubstraat met werksterkte en tikt u voorzichtig overtollige vloeistof af en zuigt u rond de sectie.
- Bedek de secties met peroxidasesubstraat (75 μL/5 cm²) en beits gedurende 5 min. Plaats een dia onder de microscoop en bepaal de optimale kleuringstijd.
- Was de dia's in een beitsrek in gedestilleerd water (3 x 1 min).
- Incubeer de dia's in gedestilleerd water gedurende 5 min.
- Counterstain met behulp van hematoxyline gedurende 2 min.
- Plaats de glijbaan 3 min onder stromend leidingwater.
- Was de glijbaan in gedestilleerd water.
- Monteer de dia's onder glazen afdekkingen in montagemedium en laat plat drogen.
- Observeer onder een lichtmicroscoop.
- Apoptose detectie kit (Assay C)
OPMERKING: Volg het protocol van de fabrikant (zie de tabel met materialen).- Bereid de Coplin potten.
- De was en rehydrateer de weefselsecties (zie stap 1.3).
- Incubeer het weefsel met Proteïnase K (15-30 min bij 37 °C).
- Plaats de dia's terug op het rek en spoel 2x in PBS.
- Dek af met 50 μL 'TUNEL-reactiemengsel'. Plaats natte papieren handdoeken in de container, bedek ze met plasticfolie en laat ze 60 minuten op 37 °C staan.
- Spoel 3x met PBS.
- Plaats de dia's in de container en droog het gebied rond het weefselmonster.
- Voeg 50 μL Converter-AP toe aan het monster en incubeer in een bevochtigde container gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Spoel 3x in PBS.
- Voeg 50-100 μL substraatoplossing toe en laat 10 minuten in het donker staan.
OPMERKING: Observeer de kleuring onder een lichtmicroscoop. - Spoel de dia's 3x af met PBS.
- Counterstain door secties gedurende 2 minuten over te brengen in hematoxyline en vervolgens gedurende 5 minuten voorzichtig af te spoelen in stromend leidingwater.
- Monteer de dia's onder glazen afdekkingen in een waterig montagemedium en laat ze plat drogen.
- Observeer onder een lichtmicroscoop. Beoordeel de aangetaste (positieve) cellen door 70 tot 100 cellen te tellen in elk monster van het midgut of HPG's onder een lichtmicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celdooddetectie in het midgut
Nieuw ontstane werkbijen (Apis mellifera carnica) uit de experimentele bijenstal van het Landbouwinstituut van Slovenië in Ljubljana werden individueel behandeld met 3% oxaalzuur (OA)23. OA wordt vaak gebruikt in de bijenteelt voor Varroa destructor controle. Na de behandeling werden de werkbijen (drie uit elke groep) geïmmobiliseerd op ijs. Het midgut werd ontleed en gefixeerd in 10% formaline. Het weefsel werd vervolgens uitgedroogd in een reeks alcoholoplossingen en uiteindelijk ingebed in paraffinewas. Na met een microtoom in dunne secties van 7 μm te zijn gesneden, werden de weefselmonsters voorbereid voor analyse. Met behulp van een lichtmicroscoop werd het percentage aangetaste cellen (70-100 cellen uit elk van de drie midgutmonsters) berekend. De resultaten met Assay B gaven aan dat behandeling met artrose de cellen in het midgut significant beïnvloedde (figuur 3). Test A toonde geen verschil tussen behandelde en controlebijen; het percentage celdood was minder dan 10%. Bij controlebijen, alleen gevoed met suikerstroop, was de morfologie van het midgut onaangetast en goed bewaard gebleven.
Figuur 3: Midgut. (A) Hematoxyline en eosine kleuring; B) immunostaining (assay C) van het midgut. Intense rode kleuring is gelokaliseerd in de kernen van de midgut-cellen. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Celdooddetectie in HPG's
In de volgende proef werd het experiment uitgevoerd, waarbij drie ziektevrije kolonies (Apis mellifera L.) werden geselecteerd. Kammen met bedekt broed werden in een couveuse geplaatst (34,5 °C) en de nieuw ontstane werkbijen werden gemarkeerd met een vlek op de thorax om hun leeftijd te bepalen. Deze procedure werd drie keer herhaald om verschillend gerijpte bijen te verkrijgen. De bijen werden gemarkeerd en teruggebracht naar hun kolonie. De bijen werden na 30 dagen vanaf het begin van de proef bemonsterd. Ten slotte werden ze in een hoardingkooi van 7,5 cm x 4 cm x 4 cm geplaatst, met gaas aan één kant en bewaard in een incubator bij 28 °C.
Werknemers werden behandeld met insecticide (imidacloprid) of acaricide (coumaphos), beide oplossingen in subletale doses, of suikerstroop als controlegroep10. De bijen van verschillende groepen werden geïmmobiliseerd en de HPG's ontleed. Een steekproef bestond uit drie tot vijf werknemers uit dezelfde groep om zoveel mogelijk cellen te verkrijgen. De aangetaste cellen werden geëvalueerd met behulp van immunohistologische methoden. Rode (Assay C) en bruine (Assay B) reactieproducten werden gedetecteerd in de apoptotische kernen van HPG's. Positieve rode kernen na behandeling met imidacloprid of coumaphos werden bepaald in de meerderheid van de glandulaire cellen (figuur 4), en slechts sporadische celkernen vertoonden bruin reactieproduct uit dezelfde behandelde groepen. De controlegroep had geen beschadigde HPG-cellen.
Figuur 4: Hypofaryngeale klieren. (A) Hematoxyline en eosinekleuring; B) immunostaining (assay C). Rode kleuring is gelokaliseerd in de kernen van de cellen. (C) Immunostaining (assay B). Bruin reactieproduct duidt op de positieve celkernen. Schaalbalken = 50 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In levende organismen wordt celdood gedefinieerd als apoptose of necrose25 en kan gepaard gaan met autofagie26. Het verschil tussen apoptotische en necrotische cellen is dat apoptose een vorm van geprogrammeerde celdood is en voorkomt in normale cellen, terwijl necrose optreedt als gevolg van dodelijke aandoeningen (bijv. Ongeval, ziekte)27,28. Apoptose kan worden gedetecteerd met behulp van testkits op basis van de TUNEL-techniek (detectie van DNA-fragmentatie door de 3′-hydroxyl termini te labelen in de dubbelstrengs DNA-breuken die tijdens apoptose worden gegenereerd). Verschillende kits bieden verschillende niveaus van gevoeligheid bij het detecteren van celdeletie.
Een van de testen (Assay C) is zeer gevoelig en detecteert zowel apoptose als necrose29; de andere test (B) toont een hogere gevoeligheid voor het detecteren van apoptotische celdood30. Het principe van Assay C is om DNA-breuken in de vroege stadia van apoptose te detecteren. Na het fixeren en permeabiliseren van de apoptotische cellen wordt het weefsel geïncubeerd met een TUNEL-reactiemengsel. Ondertussen is de rol van TdT om de toevoeging van fluoresceïne-dUTP aan vrije 3′-OH-groepen in DNA te katalyseren. Nadat het weefsel is gewassen, markeert het anti-fluoresceïne-antilichaam het label in de beschadigde delen van het DNA. Het principe van het antilichaam is om zich te hechten aan het enzym alkalische fosfatase dat werkt als een verslaggever. Ten slotte kan de AP worden gezien als een resultaat van deze specifieke reactie31.
Hematoxyline- en eosinekleuring van organen is een eenvoudige en nuttige methode voor morfologische analyse met behulp van lichtmicroscopie. Het wordt aanbevolen om eerst deze stap op te nemen om eventuele morfologische veranderingen van cellen te observeren. Voor de detectie van vroege stadia van apoptose in de dunne delen van honingbijenweefsel zijn ten minste twee kits beschikbaar voor immunohistochemische analyse (zie de tabel met materialen). Beide maken de apoptotische celkernen donkerbruin en worden gevisualiseerd met behulp van lichtmicroscopie. Met behulp van Assay A (TUNEL-techniek) conjugaten de Streptavidin HRP (mierikswortelperoxidase) aan gebiotinyleerde nucleotiden en worden apoptotische kernen bruin na de reactie van DAB (diaminobenzidine, een stabiel chromogeen). Assay B onderscheidt celschade via de detectie van DNA-splitsing en gecondenseerd chromatine, wat een teken is van vroege apoptose.
In een gezond organisme kan het niveau van celvernieuwing meestal in kleine percentages worden beoordeeld32,33. Celdood in het midgut nam toe na de OA-behandeling, wat aangeeft dat het gebruik van artrose een schadelijk effect heeft op de midguts van werkbijen in laboratoriumexperimenten. De groep bijen behandeld met imidacloprid en coumaphos onthulde een verhoogde celdood (rode kernen) in de voedselklieren10, wat wijst op celbeschadiging of necrose; geprogrammeerde celdood werd gevonden op een laag niveau (bruine kernen)10. Necrotische en apoptotische celdood werd echter op hoge niveaus gevonden, vooral na behandeling met imidacloprid. In de groep onbehandelde bijen was het niveau van geprogrammeerde celdood in HPG's niet meer dan 10%, wat in overeenstemming is met de normale weefselomzet32.
Celdood, zowel als gevolg van schade of geprogrammeerde celdood, werd gedetecteerd door beide assays (B en C) en resulteerde in verschillende gevoeligheid; de eerste detecteert zowel necrotische als geprogrammeerde celdood11. Zoals bevestigd in de gezonde werknemers (controlegroep), detecteerden beide testen sporadische positieve cellen slechts10. De apoptose- en necrosedetectietests die worden gebruikt bij immunohistochemische analyse van honingbijenweefsel bleken een krachtige methode om de subletale effecten van verschillende stoffen op honingbijen te onderzoeken.
Kritieke stappen in het protocol:
Na het snijden met een microtoom, moeten weefselsecties 's nachts op een warme plaat (afplattingstafel, zie Materiaaltabel) op het objectiefglas worden geplaatst. Het is essentieel dat de monsters goed gedroogd zijn voor toekomstige stappen in de protocollen. Wanneer weefsel niet goed aan het glas is bevestigd, kan het loskomen van het oppervlak in de procedure voor celdooddetectie. Het is raadzaam om de lichtmicroscoop te gebruiken om de aanwezigheid van het gewenste weefsel te verifiëren. Vervolgens is het nuttig om de eerste dia met H &E te verven om te controleren op het juiste gedeelte met veel cellen (vooral het klierweefsel) en nieuwe voor te bereiden voor het geval het middendarmgedeelte niet geschikt is. HPG's kunnen behoorlijk uitdagend zijn om te vinden, dus zorg ervoor dat er niet te veel secties worden gesneden; anders gaan de klieren verloren.
Het toevoegen van positieve controle om DNA-fragmentatie te detecteren is nuttig, maar optioneel. Het is belangrijk om de dia's afzonderlijk te behandelen om hoge achtergrondvlekken in de experimentele dia's te voorkomen. In assay B zijn de positieve controles opgenomen in sommige van de kits (zie materiaaltabel); andere moeten apart worden gekocht.
De methode heeft een beperking in zijn lengte en precisie. Conservering van weefsel in een waterig montagemedium is slechts van korte duur (minder dan 3 maanden). Als langer behoud gewenst is (niet aanbevolen vanwege mogelijke kleurveranderingen), zijn er andere media, maar de resultaten zijn niet zo betrouwbaar.
Het gelijktijdig gebruiken van deze twee methoden (apoptose en necrosedetectie) is zeer nuttig om de verschillende effecten van pesticiden op honingbijenweefsel te vergelijken, vooral voor subletale effecten. De alternatieve methode zou de observatie van foerageeractiviteit en de impact ervan op de cognitieve perceptie van werkbijen die door pesticiden worden beïnvloed, zijn. Een dergelijke methode zou sneller zijn in het detecteren van subletale effecten op de activiteiten van volwassen bijen, maar zou geen vragen beantwoorden over de omvang van de interne schade die het gedrag in een vroeg stadium kan veranderen, zoals bij jonge (verpleegster) bijen.
Histologische analyse van de eenvoudige morfologie van honingbijenweefsel is een solide basis voor het benaderen van verschillende onderzoeksperspectieven in celbeschadiging, apoptose of misvormingen. De oorzaken van het gebruik van pesticiden in het milieu of de behandeling van kolonies als gevolg van parasieten en plagen kunnen schadelijk zijn en de levensduur van honingbijen en de overleving van de kolonie aanzienlijk beïnvloeden. De midgut en HPG's zijn essentiële organen in honingbijen en hebben het vermogen en het doel om snel te reageren op elke vorm van negatieve externe factoren die de leeftijdsgerelateerde activiteiten van bijen beïnvloeden. De HPG's nemen af in grootte en secretievermogen, en epitheelcellen in het midgut reageren door verhoogde celdood. Immunohistochemische methoden, zoals in situ studies, zijn nuttige hulpmiddelen voor apoptosedetectie in bijenweefsel. Ze tonen ook het potentieel om te worden geïmplementeerd in studies van mogelijke nadelige effecten op honingbijen en andere nuttige insecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Ik dank de steun van het Sloveense onderzoeksbureau, subsidie nr. P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
