Summary
Иммуногистохимические методы полезны в исследованиях медоносных пчел для выявления и оценки уровня апоптоза и некроза в средней кишке и гипофарингеальных железах взрослых пчел.
Abstract
Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) внутри улья (медсестры и другие пчелы-ульи) и вне улья (фуражиры) подвергаются воздействию изменений климата и погоды, различных пестицидов, патогенов и недоедания, в основном попадая через рот и в первую очередь поражая пищеварительный тракт взрослых пчел. Чтобы понять и предотвратить воздействие таких внешних и внутренних стрессоров на медоносных пчел, одним из полезных методов исследования является иммуногистохимический метод. Описан базовый протокол подготовки средней кишки (желудочковой) и гипофарингеальной желез (ГПГ) взрослых пчел к гистологическому анализу. Описана подробная методика оценки уровня повреждения клеток и отличия некроза от запрограммированной гибели клеток (апоптоза) как естественного процесса регенерации тканей. Представлены результаты обработки взрослых медоносных пчел щавелевой кислотой и пестицидами (инсектицидами и акарицидами) и определения гибели клеток в желудочках и ГПГ. Также обсуждаются плюсы и минусы методики.
Introduction
Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) являются, среди других диких опылителей, наиболее важными опылителями сельскохозяйственных растений. На протяжении тысячелетий изменяющаяся окружающая среда влияла на пчел, чтобы адаптировать их морфологию, физиологию, поведение и толерантность к нескольким патогенам и паразитам. Поэтому медоносные пчелы развили очень разнообразный диапазон видов и подвидов по всему земному шару1. Эти результаты согласуются с предыдущими выводами о том, что существует генетическая вариация в структуре пищеварительного тракта медоносной пчелы, но также предполагают, что изменения средней кишки обусловлены факторами окружающей среды 2,3.
Пищеварительный тракт медоносной пчелы состоит из трех основных частей: передней кишки, средней кишки (ventriculus) и задней кишки4. Желудочек является важным органом для переваривания пыльцы и нектара/меда; в задней кишке осмотический контроль происходит путем поглощения воды и ионов2. Гипофарингеальные железы (HPG) работников медоносных пчел расположены в голове и синтезируют и выделяют компоненты маточного молочка для питания расплода, матки и членов колонии. Их размер меняется с возрастом и задачами и зависит от правильного питания (качественная пыльца). Работники медсестер в возрасте от 6 до 18 дней занимаются выращиванием расплода, а размер HPG увеличивается на 5,6. У пчел-фуражиров HPG дегенерируют и выделяют только ферменты, которые важны для превращения сложных сахаров в простые (α-глюкозидазы, лейцинариламидазы, инвертазы) вмеде 7.
Медоносные пчелы подвергаются воздействию нескольких биотических и абиотических стрессоров8, а на пищеварительный тракт могут влиять несколько негативных стимуляторов. Первым барьером, защищающим организм от болезнетворных микроорганизмов, является перитрофическая мембрана в средней кишке, которая состоит из слизистой оболочки кишечника для защиты от болезнетворных микроорганизмов4. Развитие и функция HPG зависят от диеты, возраста и состояния колонии9 и подвержены влиянию инсектицидов, акарицидов10 и патогенов 11,12,13. Остатки акарицидов в улье из-за контрольной обработки варроа и пестицидов из окружающей среды влияют на пчел-фуражиров ипчел-кормилиц 14,15. Наибольшую угрозу для колоний медоносных пчел представляет клещ Варроа-деструктор, как переносчик вирусов, способствующих потерям колоний16, так и как потребитель жирового тела хозяина (важный жизненно важный орган у медоносных пчел), который, следовательно, влияет на организм человека и функции колонии17.
Тем не менее, интенсивные места обитания сельскохозяйственных угодий могут обеспечить краткосрочное снабжение продовольствием для медоносных пчел. Поэтому агроэкологические схемы должны повысить доступность медоносных цветов в сельскохозяйственных ландшафтах18. Для оценки морфологии различных подвидов 6,19,20,21 или сублетальных эффектов этих факторов на клеточном или тканевом уровнях, особенно средней кишки и HPG, гистологические и иммуногистохимические методы являются практичными и достаточно точными для использования в гистологических исследованиях у медоносных пчел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Базовая гистология для исследования медоносных пчел
- Рассечение ткани медоносной пчелы
ПРИМЕЧАНИЕ: Для вскрытия рабочих пчел используйте рассекающий микроскоп со светодиодным источником света. Наиболее полезное увеличение ~ 20x.- Манипуляции и рассечение
- Осторожно возьмите рабочую пчелу с щипцами и положите ее на лед (или в морозильную камеру при -20 °C) на 2 мин, чтобы обездвижить ее22. Прикрепите пчелу к чашке Петри по диагонали через самую верхнюю заднюю часть грудной клетки дважды, слева направо и справа налево.
- Налейте физиологический раствор для насекомых, чтобы покрыть тело. Поместите чашку Петри под микроскоп, сфокусируйте и отрегулируйте.
- Подготовьте инструменты (см. Таблицу материалов).
- Рассечение средней кишки
- Начните с живота, вставив одну точку ножниц под тергит А5 (рисунок 1) в центр правой стороны тела пчелы. Вырезать до тергита А2.
- Держите внутреннее лезвие ножниц параллельно боковой части тела, чтобы избежать повреждения внутренних органов. Поверните ножницы влево и сделайте один разрез; поверните направо и сделайте еще один разрез. Аккуратно откройте левую часть живота и приколите ее. Повторите с другой стороны.
- С помощью щипцов одной рукой аккуратно потяните желудок медоносной пчелы вверх, а ножницами в другой руке срежьте в самом конце пищевода. Оттяните живот и среднюю кишку от живота и срежьте прямую кишку. Используйте пипетку с солевым раствором насекомых и удалите любые калы или части ткани.
- Рассечение ХПГ
- Обездвижите рабочую пчелу на льду, как описано в шаге 1.1.1. Отрежьте голову и поместите ее на меньшую пластину с антеннами, обращенными вверх. Закрепите голову двумя штифтами: один через левый составной глаз, а второй через правый составной глаз.
- Сделайте разрез поперек первого составного глаза на внутренней стороне штифтов, продолжайте движение к лабруму, а затем сделайте еще один разрез на другой стороне через второй составной глаз (рисунок 2).
- Отрежьте усики. Снимите маску и срежьте там, где еще прикреплены. Возьмите щипцы и аккуратно удалите железы вместе с мозгом и частью сложных глаз.
- Манипуляции и рассечение
- Фиксация, обезвоживание и встраивание парафина
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитные перчатки.- Поместите ткань во флаконы с пенициллином, наполненные на 3/4 10% формалином. Хранить в холодильнике при температуре 4 °C.
- Через 24 ч обезвоживают ткани в серии спиртов: 70%, 80%, 90%, 100%, по 1 ч каждый, 100% 2-пропанол в течение 1 ч, 100% 2-пропанол в течение 12 ч и, наконец, 100% 2-пропанол в течение 1 ч.
- Поместите ткань в гистокассеты; разметить и поместить их в стеклянные камеры с 2-пропанолом и парафином (1:1) в инкубатор при 60 °C в течение 24 ч.
- Переместите гистокассетты в другую камеру с парафином (I.) еще на 24 ч. Повторяют процедуру со свежим парафином еще дважды (II. и III.), оба в течение 24 ч.
- Наконец, подготовьте монтажную станцию и начните встраивать ткань в воск.
- Откройте каждый гистокассет и снимите крышку. Заполните форму воском и аккуратно положите ткань теплыми щипцами в середину формы.
- Поместите гистокассет на форму и слегка накройте ее воском. Немедленно поместите форму на холодную поверхность монтажной станции на несколько секунд, затем поместите ее на холодную пластину на несколько минут, пока воск не затвердеет и не отделится от формы вместе и гистокассетта.
- Храните готовые образцы в коробке, вдали от пыли и тепла.
- Нарежьте тонкие участки по 4 мкм на микротоме: сначала две секции, прикрепленные друг к другу, а затем один отдельно. Переложите секции щипцами и дайте им плавать на дистиллированной воде (42 ° C), затем соберите их на чистых горках, поместив две секции вместе на левой стороне объективного стекла и третью на правой стороне, оставаясь отчетливо отдельными. Оставьте отмеченные слайды на ночь на нагревательном устройстве и, наконец, храните их в коробке, предназначенной для гистологических образцов.
- Депарафинизация и регидратация
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитные перчатки.- Подготовьте девять банок Коплина и поместите секции в серию очищающих агентов (I., II., III.) на 5 мин каждая.
- Вводят в 2-пропанол, этанол 96% (I., II.), спирт 90% и 80%, дистиллированную воду на 3 мин каждый.
- Окрашивание гематоксилином и эозином
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитные перчатки.- Приготовьте шесть банок Коплина.
- Для окрашивания гематоксилина и эозина (H&E) поместите депарафинизированные, регидратированные срезы в гематоксилин на 5 мин, затем аккуратно поместите их под проточную водопроводную воду на 2 мин. Затем поместите их в дистиллированную воду на 1 мин и эозин на 4 мин (для эозина банка Коплина не нужна).
- Поместите слайды в этанол 96% в течение 1 мин, затем 2-пропанол в течение 2 мин и, наконец, в очищающее средство на 2 мин.
- Добавьте монтажную среду и защитное стекло и дайте им высохнуть. Наблюдайте под световым микроскопом.
Рисунок 1: Дорсальный вид тела медоносной пчелы. Тергиты А1-А7. Подробные инструкции по рассечению медоносных пчел можно найти в Carreck et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Дорсальный вид HPG, частей сложных глаз, прикрепленных к мозгу (не видимых). Молодая рабочая пчела в возрасте от 5 до 6 дней имеет пухлые и кремово-белые HPG. Ацины расположены на головном мозге и заполняют область головы ветвями, достигающими задней части мозга. У пчел-кормильцев эти железы сильно сморщиваются и оставляют только тонкие нитевидные остатки. По этой причине лучше удалять железы вместе с мозгом, чтобы облегчить дальнейшие процедуры, чтобы избежать потери ткани. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Обнаружение гибели клеток в срезах тканей
- Комплект для обнаружения апоптоза (Анализ А)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов).- Приготовьте банки Коплина.
- После депарафинизации и регидратации (см. этап 1.3) погружают слайды в 0,85% раствор NaCl, а затем в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (5 мин).
- Поместите слайды в 4% параформальдегида 2 х 15 мин.
- Поместите слайды в емкость и добавьте 100 мкл раствора протеиназы К (20 мкг/мл), затем оставьте их на 10-30 мин.
- Поместите слайды в PBS (5 мин).
- Поместите слайды в 4% параформальдегид в PBS (5 мин).
- Погрузите слайды в PBS (2 x 5 мин).
- Поместите слайды в контейнер, добавьте 100 мкл буфера равновесия и оставьте их на 5-10 минут.
- Добавьте 100 мкл реакционной смеси TdT. Положите бумажные полотенца внутрь контейнера, вокруг горок, смочите полотенца водой, а затем накройте полиэтиленовой пленкой. Инкубировать горки в течение 60 мин при 37 °C.
- Поместите слайды обратно в стойку для окрашивания и погрузите в 2x физиологический раствор цитрат натрия (SSC) на 15 минут.
- Погружают слайды 3 х 5 мин в ПБС, затем в 0,3% перекиси водорода в течение 3-5 мин, а затем в ПБС снова, 3 х 5 мин.
- Снова поместите слайды в контейнер, добавьте 100 мкл Стрептавидина HRP (пероксидазы хрена) и оставьте на 30 минут (накройте полиэтиленовой пленкой).
- Погрузите слайды за 3 x 5 минут в PBS.
- Поместите слайды в контейнер и добавьте 100 мкл раствора 3,3'-диаминобензидина (DAB). Обратите внимание на светло-коричневый фон.
- Верните горки в стойку и несколько раз вымойте их в воде (двойной дистилляции).
- Установите горки под стеклянные крышки в монтажную среду и оставьте плоскими для высыхания.
- Наблюдайте под световым микроскопом.
- Комплект для обнаружения апоптоза (Анализ B)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов).- Приготовьте банки Коплина.
- Готовят протеиназу К (20 мкг/мл, разведенную в PBS).
- После депарафинизации и регидратации секций (шаг 1.3) поместите слайды в PBS на 5 минут.
- Поместите слайды в контейнер и добавьте протеиназу K (20 мкг/мл, 60 мкл на образец размером 5 см²).
- Промойте горки 2 х 2 мин в дистиллированной воде.
- Закалка в эндогенной пероксидазе (в 3% водородной пероксидазе) при комнатной температуре.
- Промойте горки 2 x 5 минут PBS или водой.
- Поместите слайды в контейнер и нанесите буфер равновесия (75 мкл/5см2) на 10 с при комнатной температуре.
- Тщательно протрите вокруг ткани.
- Добавляют фермент TdT (концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу) к каждому участку и инкубируют в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 °C. Положите бумажные полотенца внутрь лотка, вокруг горок, смочите полотенца водой и накройте их полиэтиленовой пленкой.
- После инкубации поместите образцы в стойку и оставьте их в буфере остановки/промывки (10 мин).
- Нагрейте анти-дигоксигенин, конъюгированный до комнатной температуры.
- Мойте слайды в PBS (3 x 1 мин).
- Тщательно вытрите вокруг ткани.
- Добавьте две капли конъюгата Анти-Дигоксигенин-Пероксидаза (65 мкл/5 см²) в секции и инкубируйте в течение 30 мин в увлажненном контейнере.
- После промывки в PBS 4 x 2 мин, подготовьте подложку из пероксидазы рабочей силы и аккуратно отсоедините лишнюю жидкость и аспират по всему участку.
- Накройте участки пероксидазной подложкой (75 мкл/5 см²) и окрашиванием в течение 5 мин. Поместите слайд под микроскоп и определите оптимальное время окрашивания.
- Помойте горки в окрашивающей стойке в дистиллированной воде (3 х 1 мин).
- Инкубировать горки в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Противодействовать с помощью гематоксилина в течение 2 мин.
- Поместите горку под проточную водопроводную воду на 3 мин.
- Промойте горку в дистиллированной воде.
- Установите горки под стеклянные крышки в монтажную среду и оставьте плоскими для высыхания.
- Наблюдайте под световым микроскопом.
- Комплект для обнаружения апоптоза (Assay C)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов).- Приготовьте банки Коплина.
- Депаракс и регидратация тканевых срезов (см. шаг 1.3).
- Инкубировать ткань протеиназой К (15-30 мин при 37 °С).
- Поместите слайды обратно на стойку и промойте 2x в PBS.
- Покрыть 50 мкл реакционной смеси TUNEL. Поместите влажные бумажные полотенца внутрь контейнера, накройте их полиэтиленовой пленкой и оставьте на 60 минут при 37 °C.
- Смойте 3x с помощью PBS.
- Поместите слайды в контейнер и высушите область вокруг образца ткани.
- Добавьте к образцу 50 мкл конвертера-АП и инкубируйте в увлажненном контейнере в течение 30 мин при 37 °C.
- Промыть 3x в PBS.
- Добавить 50-100 мкл раствора субстрата и оставить на 10 мин в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за окрашиванием под световым микроскопом. - Промойте слайды 3x с помощью PBS.
- Противодействуйте окрашиванию, перемещая срезы в гематоксилин в течение 2 мин, а затем тщательно смывайте в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
- Установите горки под стеклянными крышками в водную монтажную среду и оставьте их плоскими для высыхания.
- Наблюдайте под световым микроскопом. Оцените пораженные (положительные) клетки, насчитав от 70 до 100 клеток в каждом образце средней кишки или HPG под световым микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обнаружение гибели клеток в средней кишке
Недавно появившиеся рабочие пчелы (Apis mellifera carnica) с экспериментальной пасеки в Сельскохозяйственном институте Словении в Любляне были индивидуально обработаны 3% щавелевой кислотой (OA)23. OA часто используется в пчеловодстве для управления деструктором Varroa . После обработки рабочих пчел (по три из каждой группы) обездвиживали на льду. Среднюю кишку рассекли и зафиксировали в 10% формалине. Затем ткань обезвоживали в серии спиртовых растворов и, наконец, внедряли в парафиновый воск. После разрезания микротомом на тонкие участки размером 7 мкм образцы тканей готовили к анализу. С помощью светового микроскопа был рассчитан процент пораженных клеток (70-100 клеток из каждого из трех образцов средней кишки). Результаты анализа B показали, что лечение ОА значительно повлияло на клетки средней кишки (рисунок 3). Анализ А не показал различий между обработанными и контрольными пчелами; уровень гибели клеток составил менее 10%. У контрольных пчел, которых кормили только сахарным сиропом, морфология средней кишки не была затронута и хорошо сохранилась.
Рисунок 3: Окрашивание midgut. (A) Окрашивание гематоксилином и эозином; (B) иммуноокрашающее (Анализ C) средней кишки. Интенсивное красное окрашивание локализуется в ядрах клеток средней кишки. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Обнаружение гибели клеток в HPG
В следующем испытании был проведен эксперимент, выбранный тремя свободными от болезней колониями (Apis mellifera L.). Гребни с покрытым расплодом помещали в инкубатор (34,5 °C), а вновь появившиеся рабочие пчелы были отмечены пятном на грудной клетке, чтобы определить их возраст. Эту процедуру повторяли трижды, чтобы получить пчел разного возраста. Пчелы были помечены и возвращены в свою колонию. Пчелы были отобраны через 30 дней с начала испытания. Наконец, их поместили в клетку для хранения размером 7,5 см х 4 см х 4 см с проволочной сеткой с одной стороны и держали в инкубаторе при 28 °C.
Рабочих обрабатывали инсектицидом (имидаклопридом) или акарицидом (кумафос), оба раствора в сублетальных дозах, или сахарным сиропом в качестве контрольной группы10. Пчелы разных групп были обездвижены, а HPG рассечены. Образец состоял из трех-пяти рабочих из одной группы, чтобы получить как можно больше клеток. Пораженные клетки оценивали с помощью иммуногистологических методов. Красные (Assay C) и коричневые (Assay B) продукты реакции были обнаружены в апоптотических ядрах HPG. Положительные красные ядра после обработки имидаклопридом или кумафосом были определены в большинстве железистых клеток (рисунок 4), и только спорадические клеточные ядра показали коричневый продукт реакции из тех же обработанных групп. В контрольной группе не было поврежденных клеток HPG.
Рисунок 4: Гипофарингеальные железы. (А) Окрашивание гематоксилином и эозином; (B) иммуноокрашающее (Анализ C). Красное окрашивание локализуется в ядрах клеток. (C) Иммуноокрашивание (анализ B). Продукт бурой реакции указывает на положительные ядра клеток. Шкала = 50 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
У живых организмов гибель клеток определяется как апоптоз или некроз25 и может сопровождаться аутофагией26. Разница между апоптотическими и некротическими клетками заключается в том, что апоптоз является формой запрограммированной гибели клеток и появляется в нормальных клетках, тогда как некроз возникает из-за летальных состояний (например, несчастный случай, болезнь)27,28. Апоптоз может быть обнаружен с помощью наборов для анализа, основанных на методе TUNEL (обнаружение фрагментации ДНК путем маркировки 3'-гидроксильных терминов в двухцепочечных разрывах ДНК, генерируемых во время апоптоза). Различные наборы обеспечивают несколько уровней чувствительности при обнаружении удаления клеток.
Один из анализов (Assay C) является высокочувствительным и обнаруживает как апоптоз, так и некроз29; другой анализ (B) показывает более высокую чувствительность для обнаружения апоптотической гибели клеток30. Принцип анализа С заключается в обнаружении разрывов ДНК на ранних стадиях апоптоза. После фиксации и пермеабилизации апоптотических клеток ткань инкубируют реакционной смесью TUNEL. Между тем, роль TdT заключается в катализировании добавления флуоресцеина-dUTP в свободные 3'-OH группы в ДНК. После того, как ткань промыта, антифлуоресцеиновое антитело маркирует метку в поврежденных частях ДНК. Принцип действия антитела заключается в присоединении к ферменту щелочной фосфатазе, который работает как репортер. Наконец, АП можно рассматривать как результат этой специфической реакции31.
Окрашивание органов гематоксилином и эозином является простым и полезным методом морфологического анализа с использованием световой микроскопии. В том числе на этом этапе рекомендуется сначала наблюдать какие-либо морфологические изменения клеток. Для выявления ранних стадий апоптоза в тонких срезах ткани медоносной пчелы доступны не менее двух наборов для иммуногистохимического анализа (см. Таблицу материалов). Оба превращают ядра апоптотических клеток в темно-коричневый цвет и визуализируются с помощью световой микроскопии. Используя анализ A (метод TUNEL), стрептавидин HRP (пероксидаза хрена) конъюгирует с биотинилированными нуклеотидами, а апоптотические ядра становятся коричневыми после реакции DAB (диаминобензидин, стабильный хромоген). Анализ B различает повреждение клеток путем обнаружения расщепления ДНК и конденсированного хроматина, что является признаком раннего апоптоза.
В здоровом организме уровень обновления клеток обычно можно оценить в небольших процентах32,33. Гибель клеток в средней кишке увеличилась после лечения ОА, что указывает на то, что использование ОА оказывает пагубное влияние на средние полоски рабочих пчел в лабораторных экспериментах. В группе пчел, получавших имидаклоприд и кумафос, выявлена повышенная гибель клеток (красных ядер) в пищевых железах10, что свидетельствует о повреждении или некрозе клеток; запрограммированная гибель клеток была обнаружена на низком уровне (коричневые ядра)10. Тем не менее, некротическая и апоптотическая гибель клеток была обнаружена на высоких уровнях, особенно после лечения имидаклопридом. В группе необработанных пчел уровень запрограммированной гибели клеток в ГПГ составил не более 10%, что соответствует нормальному обороту тканей32.
Гибель клеток, как вследствие повреждения, так и запрограммированной гибели клеток, была обнаружена с помощью обоих анализов (B и C) и приводила к различной чувствительности; первый обнаруживает как некротическую, так и запрограммированную гибель клеток11. Как подтвердили у здоровых работников (контрольная группа), в обоих анализах было обнаружено спорадических положительных клеток только10. Анализы обнаружения апоптоза и некроза, используемые в иммуногистохимическом анализе ткани медоносных пчел, оказались мощным методом изучения сублетального воздействия различных веществ на медоносных пчел.
Критические шаги в протоколе:
После разрезания микротомом срезы ткани должны быть помещены на объективное стекло на теплой пластине (стол для сплющивания, см. Таблица материалов) на ночь. Важно, чтобы образцы были хорошо высушены для будущих этапов в протоколах. Когда ткань плохо прикреплена к стеклу, она может отделяться от поверхности в процедуре обнаружения гибели клеток. Желательно использовать световой микроскоп для проверки наличия нужной ткани. Затем полезно покрасить первый слайд H&E, чтобы проверить правильный участок со многими клетками (особенно железистой тканью) и подготовить новые на случай, если участок средней кишки не подходит. HPG может быть довольно сложно найти, поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы не вырезать слишком много секций; в противном случае железы будут потеряны.
Добавление положительного контроля для обнаружения фрагментации ДНК полезно, но необязательно. Важно обрабатывать слайды отдельно, чтобы избежать высокого фонового окрашивания в экспериментальных слайдах. В анализе B положительные элементы управления включены в некоторые наборы (см. Таблицу материалов); другие должны быть приобретены отдельно.
Метод имеет ограничение по своей длине и точности. Сохранение ткани в водной монтажной среде только кратковременное (до 3 месяцев). Если желательна более длительная сохранность (не рекомендуется из-за возможных изменений цвета), есть и другие среды, но результаты не так надежны.
Использование этих двух методов (обнаружение апоптоза и некроза) одновременно очень полезно для сравнения различных эффектов пестицидов на ткани медоносных пчел, особенно для сублетальных эффектов. Альтернативным методом будет наблюдение за кормовой активностью и ее влиянием на когнитивное восприятие рабочих пчел, пораженных пестицидами. Такой метод был бы быстрее в обнаружении сублетального воздействия на деятельность взрослых пчел, но не отвечал бы на какие-либо вопросы относительно степени внутреннего повреждения, которое может изменить поведение на ранней стадии, как у молодых (нянь) пчел.
Гистологический анализ простой морфологии ткани медоносных пчел является прочной основой для подхода к различным перспективам исследований повреждения клеток, апоптоза или пороков развития. Причины использования пестицидов в окружающей среде или обработки колоний из-за паразитов и вредителей могут быть вредными и значительно влиять на продолжительность жизни медоносных пчел и выживание колоний. Мидгут и ХПГ являются важнейшими органами у медоносных пчел и обладают способностью и назначением быстро реагировать на любые негативные внешние факторы, влияющие на возрастную деятельность пчел. HPG уменьшаются в размерах и секреционных способностях, а эпителиальные клетки в средней кишке реагируют увеличением гибели клеток. Методы иммуногистохимии, такие как исследования in situ , являются полезными инструментами для выявления апоптоза в пчелиной ткани. Они также показывают потенциал, который может быть реализован в исследованиях возможного неблагоприятного воздействия на медоносных пчел и других полезных насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У автора нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Я с благодарностью отмечаю поддержку Словенского исследовательского агентства, грант No P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
