Иммуногистохимические методы полезны в исследованиях медоносных пчел для выявления и оценки уровня апоптоза и некроза в средней кишке и гипофарингеальных железах взрослых пчел.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Основы гистологии и обнаружение гибели клеток в ткани медоносных пчел
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) внутри улья (медсестры и другие пчелы-ульи) и вне улья (фуражиры) подвергаются воздействию изменений климата и погоды, различных пестицидов, патогенов и недоедания, в основном попадая через рот и в первую очередь поражая пищеварительный тракт взрослых пчел. Чтобы понять и предотвратить воздействие таких внешних и внутренних стрессоров на медоносных пчел, одним из полезных методов исследования является иммуногистохимический метод. Описан базовый протокол подготовки средней кишки (желудочковой) и гипофарингеальной желез (ГПГ) взрослых пчел к гистологическому анализу. Описана подробная методика оценки уровня повреждения клеток и отличия некроза от запрограммированной гибели клеток (апоптоза) как естественного процесса регенерации тканей. Представлены результаты обработки взрослых медоносных пчел щавелевой кислотой и пестицидами (инсектицидами и акарицидами) и определения гибели клеток в желудочках и ГПГ. Также обсуждаются плюсы и минусы методики.
Введение
Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) являются, среди других диких опылителей, наиболее важными опылителями сельскохозяйственных растений. На протяжении тысячелетий изменяющаяся окружающая среда влияла на пчел, чтобы адаптировать их морфологию, физиологию, поведение и толерантность к нескольким патогенам и паразитам. Поэтому медоносные пчелы развили очень разнообразный диапазон видов и подвидов по всему земному шару1. Эти результаты согласуются с предыдущими выводами о том, что существует генетическая вариация в структуре пищеварительного тракта медоносной пчелы, но также предполагают, что изменения средней кишки....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Базовая гистология для исследования медоносных пчел
- Рассечение ткани медоносной пчелы
ПРИМЕЧАНИЕ: Для вскрытия рабочих пчел используйте рассекающий микроскоп со светодиодным источником света. Наиболее полезное увеличение ~ 20x.- Манипуляции и рассечение
- Осторожно возьмите рабочую пчелу с щипцами и положите ее на лед (или в морозильную камеру при -20 °C) на 2 мин, чтобы обездвижить ее22. Прикрепите пчелу к чашке Петри по диагонали через самую верхнюю заднюю часть грудной клетки дважды, слева направо и справа налево.
- Налейте физиологический раствор для насекомых, чтобы покрыть тело. Помест....
- Манипуляции и рассечение
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обнаружение гибели клеток в средней кишке
Недавно появившиеся рабочие пчелы (Apis mellifera carnica) с экспериментальной пасеки в Сельскохозяйственном институте Словении в Любляне были индивидуально обработаны 3% щавелевой кислотой (OA)23. OA часто используется в пчеловодстве для управления деструктором Varroa . После обработки рабочих пчел (по три из каждой группы) обездвиживали на льду. Среднюю кишку рассекли и зафиксировали в 10% формалине. Затем ткань обез.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
У живых организмов гибель клеток определяется как апоптоз или некроз25 и может сопровождаться аутофагией26. Разница между апоптотическими и некротическими клетками заключается в том, что апоптоз является формой запрограммированной гибели клеток и появляется в нормальных клетках, тогда как некроз возникает из-за летальных состояний (например, несчастный случай, болезнь)27,28. Апоптоз может быть обнаружен с помощью на.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У автора нет конфликта интересов.
Благодарности
Я с благодарностью отмечаю поддержку Словенского исследовательского агентства, грант No P4-133.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
24
стекла Leica Микротом Модульная станция встраивания тканей Leica NaHPO
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-Набор пропанол | |||
| ApopTag пероксидазы (ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Положительные элементы контроля входят в состав S7101 |
| Covers DeadEnd | |||
| Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Диссекционный микроскоп (для вскрытия пчел) | Zeiss | ||
| Дистиллированная вода | |||
| Встраиваемая кассета | |||
| EnVision System набор щелочной фосфатазы | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | спиртовой | |
| этанол | 95% (или менее чистый), 90%, 80% | ||
| Faramount монтажная среда, водная | Dako | монтажный средний | |
| Плющильный стол | Leica | HI1220 | |
| Щипцы (для вскрытия пчел) | Инструменты для тонкой науки | 11294-00 | Стандарт #4 |
| Формалин 10% | Формальдегид | ||
| Гематоксилин | Сигма-Олдрич | ||
| ГистоЧойс Очищающий агент | Сигма-Олдрич | Очиститель | |
| Водород пероксидаза 3% | |||
| Инкубатор | BioRad | ||
| Insect pins (для вскрытия пчел) | Entosphinx | 44594 | Штифты для насекомых нержавеющая сталь – белый, размер 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detection Kit, щелочная фосфатаза) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Световой микроскоп | Предметные | ||
| Microscope | Коробка со стеклами должна быть законсервирована в полиэтиленовую пленку для предотвращения попадания пыли | ||
| NaCl | |||
| Параформальдегид 4% | |||
| Парапласт | Leica | ||
| Пастер пипетки | 1,5 мл; 3 мл | ||
| PBS | |||
| чашка Петри (для вскрытия пчел) | Заполнен конденсационным кремнием (Ксантопрен L синий и универсальный активатор жидкости плюс) | ||
| Протеиназа K | Merck | 21627 | |
| Раствор Рингера (для вскрытия пчел) | 7,5 г NaCL, 2,38 г Na2HPO4, 2,72 г KH2PO4, 1 л дистиллированной воды | ||
| Ножницы (для вскрытия пчел) | Инструменты для тонкой науки | 1406-09, 14061-09 | Прямые и изогнутые, 9 см |
| Универсальная жидкость плюс активатор (для вскрытия пчел) | Часовщик Kulzer | ||
| s щипцы (для вскрытия пчел) | Инструменты для тонкой науки | 91100-12 | |
| Водяная баня | Leica | ||
| Акварельная кисть | 2x | ||
| Xantoprene L blue (для вскрытия пчел) | Кульцер |
Ссылки
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
