Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Основы гистологии и обнаружение гибели клеток в ткани медоносных пчел
Chapters
Summary July 7th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Иммуногистохимические методы полезны в исследованиях медоносных пчел для выявления и оценки уровня апоптоза и некроза в средней кишке и гипофарингеальных железах взрослых пчел.
Transcript
Этот протокол полезен во многих биологических и токсикологических исследованиях медоносных пчел, обработанных пестицидами. Он помогает обнаружить клеточные реакции ткани медоносных пчел на акарициды, которые используются в пчелиных семьях для лечения против клещей Варроа. Это мощный инструмент для обнаружения суб-малого воздействия на ткани в сочетании с поведением пчел или других полезных насекомых.
Для начала осторожно возьмите рабочую пчелу с щипцами и положите ее на лед или морозильную камеру при минус 20 градусах Цельсия на две минуты, чтобы обездвижить ее. Прижмите пчелу к чашке Петри по диагонали через самую верхнюю заднюю часть грудной клетки дважды слева направо и справа налево. Плохое насекомое физиологическим раствором покрывает тело.
Поместите чашку Петри под стереомикроскоп, сфокусируйте и отрегулируйте. Чтобы рассечь среднюю кишку, начните с живота, вставив одну точку ножниц под тергит А5 в центр правой стороны тела пчелы. Вырезать до тергита А2. Держите внутреннее лезвие ножниц параллельно боковой части тела, чтобы избежать повреждения внутренних органов.
Поверните ножницы влево и отрежьте. Аккуратно откройте левую часть живота и приколите ее. С помощью щипцов одной рукой аккуратно потяните желудок медоносной пчелы вверх, а ножницами в другой руке срежьте в самом конце пищевода.
Оттяните живот и среднюю кишку от живота и срежьте прямую кишку. Используйте пипетку с солевым раствором насекомых и удалите любые калы или части ткани. Для рассечения гипофарингеальных желез обездвижите рабочую пчелу на льду, как описано выше.
Отрежьте голову и поместите ее на меньшую пластину с антенной вверх. Закрепите голову двумя штифтами, один через левый составной глаз, а второй через правый составной глаз. Сделайте разрез поперек первого составного глаза на внутренней стороне штифтов, продолжайте движение к лабруму, а затем сделайте еще один разрез на другой стороне через второй составной глаз.
Отрежьте усики. Снимите маску и срежьте там, где еще прикреплены. Возьмите щипцы и аккуратно удалите железы вместе с мозгом и частью сложных глаз.
Для окрашивания гематоксилина и эозина поместите депараксированные, регидратированные участки в гематоксилин на пять минут. Затем аккуратно поместите их под проточную водопроводную воду на две минуты. Затем поместите их в дистиллированную воду на одну минуту и эозин на четыре минуты.
Поместите слайды 96% этанола в течение одной минуты, затем 2-пропанола в течение двух минут и, наконец, в очищающее средство на две минуты. Добавьте монтажную среду и защитное стекло и дайте им высохнуть. Наблюдайте под световым микроскопом.
Приготовьте банки Коплина. Готовят протеиназу-К. После депарафинизации и регидратации секций поместите слайды в PBS на пять минут.
Поместите слайды в контейнер и добавьте протеиназу-К. Промойте горки в дистиллированной воде. Закалка в эндогенной пероксидазе при комнатной температуре.
Промойте горки PBS или водой. Поместите слайды в контейнер и примените буфер равновесия на 10 секунд при комнатной температуре. После протирания вокруг ткани добавляют терминальный фермент дезоксинуклеотидилтрансферазы к каждому участку и инкубируют в увлажненной камере в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
Перед инкубацией положите смоченные бумажные полотенца внутрь лотка вокруг горок и накройте их полиэтиленовой пленкой. После инкубации положите экземпляры на стойку и оставьте их в буфере стоп-промывки. После мытья горок в PBS и протирания вокруг тканей добавьте две капли теплой антидигоксигенинпероксидазы, конъюгированной в срезы и высиживайте в течение 30 минут в увлажненной емкости.
После промывки в PBS, подготовьте рабочую прочно-пероксидазную подложку, накройте участки пероксидазной подложкой и окрашивайте в течение пяти минут. Поместите слайд под микроскоп и определите оптимальное время окрашивания. После мытья горок в окрасочной стойке и дистиллированной воде высиживать горки в дистиллированной воде в течение пяти минут.
Противопоставьте пятно с использованием гематоксилина в течение двух минут. Вымойте горки, поместив их под проточную водопроводную воду на три минуты, а затем в дистиллированную воду. Установите горки под стеклянные крышки и монтажную среду и оставьте плоскими для высыхания.
Наблюдайте под световым микроскопом. Процент пораженных клеток рассчитывали с помощью светового микроскопа. Результаты показали, что лечение щавелевой кислотой значительно повлияло на клетки в средней кишке.
Иммуноокрашивание показало положительные красные или коричневые продукты реакции в апоптотических ядрах гипофарингеальных желез. Положительная реакция продукта после лечения имидаклопридом или кумафосом определялась в большинстве железистых клеток. При снятии маски с пчелиной головы следите за тем, чтобы не повредить и не оторвать части гипофарингеальных желез.
Этот метод обнаруживает субклинические изменения у пчел, а также подходит для обнаружения других воздействий окружающей среды на пчел и некоторые другие живые организмы.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
