Denne protokol beskriver en arbejdsgang med høj kapacitet til kunstig intelligens-drevet segmentering af patologibekræftede regioner af interesse fra farvede, tynde vævssektionsbilleder til berigelse af histologiopløste cellepopulationer ved hjælp af lasermikrodissektion. Denne strategi omfatter en ny algoritme, der muliggør overførsel af afgrænsninger, der angiver cellepopulationer af interesse direkte til lasermikroskoper.
Tumormikromiljøet (TME) repræsenterer et komplekst økosystem bestående af snesevis af forskellige celletyper, herunder tumor-, stroma- og immuncellepopulationer. For at karakterisere variation på proteomniveau og tumor heterogenitet i skala er der behov for metoder med høj kapacitet til selektivt at isolere diskrete cellulære populationer i solide tumor maligniteter. Denne protokol beskriver en arbejdsgang med høj kapacitet, aktiveret af kunstig intelligens (AI), der segmenterer billeder af hæmatoxylin og eosin (H&E)-farvede, tynde vævssektioner i patologibekræftede regioner af interesse for selektiv høst af histologi-opløste cellepopulationer ved hjælp af lasermikrodissektion (LMD). Denne strategi omfatter en ny algoritme, der muliggør overførsel af regioner, der angiver cellepopulationer af interesse, kommenteret ved hjælp af digital billedsoftware, direkte til lasermikroskoper, hvilket muliggør mere letkøbte samlinger. En vellykket implementering af denne arbejdsgang blev udført, hvilket demonstrerede nytten af denne harmoniserede metode til selektivt at høste tumorcellepopulationer fra TME til kvantitativ, multiplekset proteomisk analyse ved højopløsnings massespektrometri. Denne strategi integreres fuldt ud med rutinemæssig histopatologisk gennemgang, udnytter digital billedanalyse til at understøtte berigelse af cellulære populationer af interesse og er fuldt generaliserbar, hvilket muliggør harmoniseret høst af cellepopulationer fra TME til multiomiske analyser.
TME repræsenterer et komplekst økosystem befolket af et meget forskelligt udvalg af celletyper, såsom tumorceller, stromale celler, immunceller, endotelceller, andre mesenkymale celletyper og adipocytter sammen med en kompleks ekstracellulær matrix1. Dette cellulære økosystem varierer inden for og på tværs af forskellige sygdomsorgansteder, hvilket resulterer i kompleks tumor heterogenitet 2,3. Nylige undersøgelser har vist, at heterogene tumorer og tumorer med lav tumorcellulæritet (lav renhed) ofte korrelerer med dårlig sygdomsprognose 2,3.
For at forstå det molekylære samspil mellem tumor- og ikke-tumorcellepopulationer inden for TME i skala er standardiserede og high-throughput-strategier nødvendige for selektivt at høste forskellige cellulære populationer af interesse for downstream multiomisk analyse. Kvantitativ proteomics repræsenterer en hurtigt udviklende og stadig vigtigere teknik til at fremme forståelsen af kræftbiologi. Hidtil har overvægten af undersøgelser, der anvender proteomik, gjort det med proteiner ekstraheret fra hele tumorvævspræparater (f.eks. Kryopulveriseret), hvilket fører til en mangel i forståelsen af heterogenitet på proteomniveau i TME 4,5,6.
Udviklingen af prøveindsamlingsstrategier, der problemfrit integreres med og udnytter information fra klinisk patologiske arbejdsgange, vil muliggøre en ny generation af histologi-løst proteomik, der er meget komplementære til guldstandard, diagnostiske patologi arbejdsgange. LMD muliggør direkte og selektiv indsamling af cellulære subpopulationer eller regioner af interesse (RIE’er) gennem mikroskopisk inspektion af histologisk farvede vævstynde sektioner7. Nylige store fremskridt inden for digital patologi og AI-aktiveret analyse har vist evnen til at identificere unikke sammensætningsfunktioner og RIE’er inden for TME på en automatiseret måde, hvoraf mange korrelerer med molekylære ændringer og kliniske sygdomsfunktioner, såsom resistens over for terapi og sygdomsprognose8.
Arbejdsgangen beskrevet i protokollen, der præsenteres her, udnytter kommercielle softwareløsninger til selektivt at kommentere tumor-ROI’er inden for digitale histopatologiske billeder og bruger softwareværktøjer udviklet internt til at overføre disse tumor-ROI’er til lasermikroskoper til automatiseret indsamling af diskrete cellulære populationer af interesse, der problemfrit integreres med downstream multiomiske analysearbejdsgange. Denne integrerede strategi reducerer LMD-operatørens tid betydeligt og minimerer den varighed, hvor væv skal være ved omgivelsestemperatur. Integrationen af automatiseret funktionsudvælgelse og LMD-høst med kvantitativ proteomik med høj kapacitet demonstreres gennem en differentiel analyse af TME fra to repræsentative epitelial ovariecancer histologiske undertyper, højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC) og ovarieklarcellecarcinom (OCCC).
Mens der har været flere undersøgelsespræcedenser, der har til formål at udvikle og / eller forbedre arbejdsgange til berigelse af målcellulære subpopulationer fra FFPE og / eller friskfrosne væv og metoder til opretholdelse af prøvekvaliteten under behandling 9,12,13,14,15, er der et betydeligt behov for at udvikle automatiserede strategier til forberedelse af kliniske vævsprøver til molekylære analyser for at mindske variabilitet og øge reproducerbarheden. Denne arbejdsgang beskriver en standardiseret, semiautomatisk protokol, der integrerer eksisterende billedanalysesoftwareværktøjer (se materialetabellen) til histologiopløst høst af diskrete cellepopulationer af LMD fra kliniske vævsprøver.
Rumligt opløst LMD-berigelse af ROI’er, der fanger diskrete cellepopulationer, repræsenterer et næste generations vævsbehandlingstrin forud for multiomiske analyser for at forbedre molekylær karakterisering og identifikation og lette celleselektiv biomarkøropdagelse. Denne protokol forbedrer eksisterende metoder ved at reducere den ofte lange eksponering af vævssektioner til det omgivende miljø, der er forbundet med manuel segmentering af ROI af en histolog (hvilket kan tage >1-2 timer før LMD-samlingen). Denne arbejdsgang gør det i stedet muligt at forudidentificere ROI ved AI-styret klassificering og segmentering. Begrænsning af vævs opholdstid vil reducere falske variationer i vurderingerne af meget labile molekylære mål, såsom phosphopeptider og mRNA, eller for antistofbaserede analytiske teknikker, der er afhængige af, at et målprotein er i sin oprindelige konformation til påvisning.
Skæring af pæne kalibratorfiducialer på PEN-membranglasset, der er tydeligt synlige i det scannede diasbillede, er en af nøglekomponenterne, der muliggør integration af billedanalysesoftwaren (se materialetabellen) med LMD-arbejdsgangen. Hvis kalibratorerne har et præcist (“rent”) punkt nederst i “V”-formen, kan der vælges et præcist punkt i billedanalysesoftwaren til de kalibratorlinjer, der skal trækkes fra, som beskrevet i trin 5.1.6 og 5.2.13. Justering af disse punkter under import til LMD-softwaren er afgørende for korrekt overlejring af annotationerne (lettet gennem generering af en kompatibel .xml-fil ved hjælp af algoritmerne “Malleator” og / eller “Dapọ”) på det relevante vævsAFKAST på det fysiske LMD-dias. Det er nødvendigt at fremhæve alle former og kollektivt “trække og slippe” på plads, selv når justeringen er præcis ved import til LMD-softwaren for at registrere den lodrette (z-plane) position af diastrinnet på lasermikroskopet. Mindre justeringer af placeringen af annotationerne over vævets ROI kan også foretages under dette trin, hvis det er nødvendigt.
En begrænsning af den nuværende version af Malleator-algoritmen er, at den ikke er kompatibel med de foruddefinerede annotationsformværktøjer, der leveres af billedanalysesoftwaren (se materialetabellen), selvom fremtidige opdateringer /versioner af algoritmen vil sigte mod at forbedre denne kompatibilitet. .annotationsfilen for figurer, der er tegnet ved hjælp af disse værktøjer, indeholder kun to sæt parrede x- og y-koordinater for hver anmærkning uden den komplette rumlige retning omkring disse punkter. Aktuel brug af disse værktøjer resulterer i, at anmærkningerne konverteres til lige linjer, der kun er defineret af to punkter under importprocessen. Manuel definition af vævs ROI-segmenter er påkrævet for en vellykket konvertering til XML-format og LMD-import. Dette kan enten udføres ved manuelt at definere hvert investeringsafkast med individuelle polygonale anmærkninger med fri hånd, der er specifikke for målområdet, eller ved at anvende en omtrentlig cirkulær eller rektangulær annotation på tværs af alle vævs ROI-segmenter, hvis det ønskes, og vil være kompatibel med denne arbejdsgang.
Mens arbejdsgangen, der præsenteres her, blev demonstreret til proteomisk analyse af friskfrosne humane kræftvævsprøver, kan denne AI-drevne LMD-arbejdsgang tilsvarende anvendes med FFPE-væv, ikke-kræftvævstyper og dem fra ikke-menneskelige kilder. Det kan også understøtte andre downstream molekylære profileringsarbejdsgange, herunder transkriptomiske, genomiske eller phosphoproteomiske analyser. Denne arbejdsgang kan også udnytte andre anvendelser af billedanalysesoftwaren (se materialetabellen), herunder med funktioner forbundet med celletælling eller andre analytiske moduler, herunder “Multiplex IHC” -modulet eller “Tissue Microarray (TMA) Add-on”. Fremtidige anvendelser af denne arbejdsgang kan også drage fordel af at foruddefinere antallet af celler pr. ROI-segment og derved sikre ækvivalente cellulære input på tværs af flere samlinger eller ved at bruge alternative metoder til at definere cellulære ROI’er af interesse, såsom ved immunhistokemi eller cellesociologi.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette projekt blev delvist ydet af Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 og HU0001-16-2-00014) til Uniformed Services University for Gynecologic Cancer Center of Excellence. Sponsorerne havde ingen rolle i design, udførelse, fortolkning eller skrivning af undersøgelsen. Ansvarsfraskrivelse: De synspunkter, der udtrykkes heri, er forfatternes og afspejler ikke den officielle politik for Department of Army / Navy / Air Force, Department of Defense eller US Government.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |