이 프로토콜은 레이저 미세 해부를 사용하여 조직학적으로 해결된 세포 집단의 농축을 위해 염색된 얇은 조직 섹션 이미지로부터 병리학적으로 확인된 관심 영역의 인공 지능 기반 세분화를 위한 고처리량 워크플로우를 설명합니다. 이 전략에는 관심 있는 세포 집단을 나타내는 경계선을 레이저 현미경으로 직접 전송할 수 있는 새로운 알고리즘이 포함되어 있습니다.
종양 미세환경(TME)은 종양, 스트로마 및 면역 세포 집단을 포함한 수십 개의 별개의 세포 유형으로 구성된 복잡한 생태계를 나타낸다. 프로테옴 수준 변이와 종양 이질성을 대규모로 특성화하기 위해서는 고형 종양 악성종양에서 분리된 세포 집단을 선택적으로 분리하기 위해 높은 처리량 방법이 필요합니다. 이 프로토콜은 인공 지능 (AI)에 의해 활성화 된 고처리량 워크 플로우를 설명하며, 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색 된 얇은 조직 절편의 이미지를 레이저 미세 해부 (LMD)를 사용하여 조직학 해결 세포 집단의 선택적 수확을 위해 병리학 확인 관심 영역으로 분할합니다. 이 전략에는 디지털 이미지 소프트웨어를 사용하여 주석을 달고 관심있는 세포 집단을 나타내는 영역을 레이저 현미경으로 직접 전송할 수있는 새로운 알고리즘이 포함되어있어 더 쉬운 수집이 가능합니다. 이 워크플로우의 성공적인 구현이 수행되었으며, 고분해능 질량 분광법에 의한 정량적이고 다중화된 프로테오믹 분석을 위해 TME로부터 종양 세포 집단을 선택적으로 수확하는 이 조화된 방법의 유용성을 입증하였다. 이 전략은 일상적인 조직병리학 검토와 완전히 통합되며, 디지털 이미지 분석을 활용하여 관심있는 세포 집단의 농축을 지원하며 완전히 일반화 가능하여 다오믹 분석을 위해 TME에서 세포 집단의 조화 된 수확을 가능하게합니다.
TME는 복잡한 세포외 매트릭스1과 함께 종양 세포, 기질 세포, 면역 세포, 내피 세포, 다른 중간엽 세포 유형 및 지방세포와 같은 매우 다양한 세포 유형의 어레이에 의해 채워지는 복잡한 생태계를 나타낸다. 이 세포 생태계는 서로 다른 질병 기관 부위 내외에서 다양하며, 복잡한 종양 이질성 2,3을 초래한다. 최근 연구에 따르면 이질적인 종양과 낮은 종양 세포성 (낮은 순도)을 가진 종양은 종종 가난한 질병 예후 2,3과 관련이 있습니다.
TME 내의 종양과 비종양 세포 집단 사이의 분자 상호 작용을 대규모로 이해하려면, 하류 다중종 분석을 위해 관심있는 별개의 세포 집단을 선택적으로 수확하기 위해 표준화되고 높은 처리량 전략이 필요하다. 정량적 프로테오믹스는 암 생물학에 대한 이해를 증진시키기 위해 빠르게 진화하고 점점 더 중요한 기술을 나타낸다. 현재까지, 프로테오믹스를 채용하는 연구의 우세는 전체 종양 조직 제제로부터 추출된 단백질(예를 들어, 동결분쇄)으로 이루어졌으며, 이는 TME 4,5,6에서의 프로테옴 수준 이질성에 대한 이해에 있어서 불충분성을 초래하였다.
임상 병리학 워크플로우의 정보와 원활하게 통합되고 활용되는 샘플 수집 전략의 개발은 황금 표준의 진단 병리학 워크플로우를 매우 보완하는 새로운 세대의 조직학 해결 프로테오믹스를 가능하게 할 것입니다. LMD는 조직학적으로 염색된 조직 얇은 절편(7)의 현미경 검사를 통해 세포 하위집단 또는 관심 영역(ROI)의 직접적이고 선택적인 수집을 가능하게 한다. 디지털 병리학 및 AI 활성화 분석의 최근 주요 발전은 자동화 된 방식으로 TME 내의 고유 한 구성 특징 및 ROI를 식별 할 수있는 능력을 입증했으며, 그 중 많은 부분이 분자 변경 및 임상 질병 특징, 예를 들어 치료 및 질병 예후와 같은 임상 질환 특징과 상관 관계가 있습니다8.
여기에 제시된 프로토콜에 설명된 워크플로우는 상용 소프트웨어 솔루션을 활용하여 디지털 조직병리학 이미지 내에서 종양 ROI에 선택적으로 주석을 달고, 사내에서 개발된 소프트웨어 도구를 활용하여 이러한 종양 ROI를 레이저 현미경으로 전송하여 다운스트림 다중종 분석 워크플로우와 원활하게 통합되는 관심 있는 개별 세포 집단의 자동 수집을 수행합니다. 이 통합 전략은 LMD 작업자 시간을 크게 줄이고 조직이 주변 온도에서 유지되어야 하는 기간을 최소화합니다. 자동화된 특징 선택 및 LMD 수확과 고처리량 정량적 단백체학의 통합은 두 가지 대표적인 상피 난소암 조직학적 아형, 고급 장액성 난소암(HGSOC) 및 난소 맑은 세포 암종(OCCC)으로부터 TME의 차등 분석을 통해 입증된다.
FFPE 및/또는 신선 냉동 조직으로부터 표적 세포 하위집단의 농축을 위한 워크플로우를 개발 및/또는 개선하려는 여러 연구 선례가 있었지만,9,12,13,14,15를 처리하는 동안 샘플 품질을 유지하기 위한 방법론이 있지만, 가변성을 감소시키기 위해 분자 분석을 위한 임상 조직 표본을 제조하기 위한 자동화된 전략을 개발해야 할 상당한 필요성이 존재하며, 재현성을 높입니다. 이 워크플로우는 임상 조직 표본에서 LMD에 의한 이산 세포 집단의 조직학적으로 해결된 수확을 위해 기존의 이미지 분석 소프트웨어 도구(자료 표 참조)를 통합하는 표준화된 반자동화 프로토콜을 설명합니다.
분리된 세포 집단을 포획하는 ROI의 공간적으로 해결된 LMD 농축은 분자 특성화 및 식별을 개선하고 세포 선택적 바이오마커 발견을 촉진하기 위해 다중종 분석 이전의 차세대 조직 처리 단계를 나타낸다. 이 프로토콜은 조직 학자에 의한 ROI의 수동 세분화와 관련된 주변 환경에 대한 조직 절편의 종종 긴 노출을 줄임으로써 기존 방법론을 개선합니다 (LMD 수집 전에 >1-2 시간이 걸릴 수 있음). 대신 이 워크플로우를 통해 AI 기반 분류 및 세분화를 통해 ROI를 미리 식별할 수 있습니다. 조직 체류 시간을 제한하면 포스포펩타이드 및 mRNA와 같은 매우 불안정한 분자 표적의 평가에서 또는 검출을 위해 그것의 본래 입체 형태에 있는 표적 단백질에 의존하는 항체 기반 분석 기술에 대한 스퓨리어스 변이를 감소시킬 것이다.
스캔한 슬라이드 이미지에서 명확하게 볼 수 있는 PEN 멤브레인 슬라이드에 깔끔한 교정기 신탁을 절단하는 것은 LMD 워크플로우와 이미지 분석 소프트웨어( 자료 표 참조)를 통합할 수 있는 핵심 구성 요소 중 하나입니다. 교정기가 “V” 형상의 하단에 정밀한(“깨끗한” 점)을 갖도록 보장하면 단계 5.1.6 및 5.2.13에 설명된 대로 교정기 선에서 그려질 이미지 분석 소프트웨어에서 정확한 점을 선택할 수 있습니다. LMD 소프트웨어로 가져오는 동안 이러한 지점의 정렬은 주석(“Malleator” 및/또는 “Dapọ” 알고리즘을 사용하여 호환 가능한 .xml 파일 생성을 통해 촉진됨)을 물리적 LMD 슬라이드의 관련 조직 ROI에 적절하게 오버레이하는 데 중요합니다. LMD 소프트웨어로 가져올 때 정렬이 정확할 때에도 모든 모양을 강조 표시하고 공동으로 “드래그 앤 드롭”하여 레이저 현미경에 슬라이드 스테이지의 수직 (z-plane) 위치를 등록해야합니다. 필요한 경우 조직 ROI에 대한 주석의 위치를 약간 조정할 수도 있습니다.
Malleator 알고리즘의 현재 버전의 한계는 이미지 분석 소프트웨어에서 제공하는 사전 정의 된 주석 모양 도구 ( 자료 표 참조)와 호환되지 않는다는 것입니다.하지만 알고리즘의 향후 업데이트 / 버전은이 호환성을 향상시키는 것을 목표로합니다. 이러한 도구를 사용하여 그려진 셰이프의 .annotation 파일에는 각 주석에 대해 쌍을 이룬 x 및 y 좌표 집합이 두 개만 포함되어 있으며 이러한 점 주위의 전체 공간 방향은 포함되지 않습니다. 현재 이러한 도구를 사용하면 주석이 가져오기 프로세스 중에 두 점만 정의된 직선으로 변환됩니다. 조직 ROI 세그먼트의 수동 정의는 XML 형식 및 LMD 가져오기로의 성공적인 변환을 위해 필요합니다. 이는 대상 영역에 특정한 개별 자유형 다각형 주석으로 각 ROI를 수동으로 정의하거나 원하는 경우 모든 조직 ROI 세그먼트에 대략적인 원형 또는 직사각형 주석을 적용하여 수행할 수 있으며 이 워크플로와 호환됩니다.
여기에 제시된 워크 플로우는 신선하게 얼어 붙은 인간 암 조직 표본의 프로테오믹 분석을 위해 입증되었지만,이 AI 기반 LMD 워크 플로우는 FFPE 조직, 비 암성 조직 유형 및 비인간 소스의 것과 동등하게 사용될 수 있습니다. 또한 전사체, 게놈 또는 포스포프로테오믹 분석을 포함한 다른 다운스트림 분자 프로파일링 워크플로우를 지원할 수 있습니다. 이 워크플로우는 또한 “Multiplex IHC” 모듈 또는 “Tissue Microarray (TMA) Add-on”을 포함한 세포 계수 또는 기타 분석 모듈과 관련된 기능을 포함하여 이미지 분석 소프트웨어( 자료 표 참조)의 다른 용도를 활용할 수 있습니다. 이 워크플로우의 향후 적용은 ROI 세그먼트당 세포 수를 미리 정의하여 여러 컬렉션에 걸쳐 동등한 세포 입력을 보장하거나 면역조직화학 또는 세포 사회학과 같이 관심있는 세포 ROI를 정의하기 위한 대체 방법을 사용하여 이점을 얻을 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트에 대한 기금은 국방 건강 프로그램 (HU0001-16-2-0006 및 HU0001-16-2-00014)에 의해 부인과 암 센터 우수성을위한 Uniformed Services University에 부분적으로 제공되었습니다. 스폰서는 연구의 설계, 실행, 해석 또는 작성에 아무런 역할을하지 못했습니다. 면책 조항: 여기에 표현 된 견해는 저자의 견해이며 육군 / 해군 / 공군, 국방부 또는 미국 정부의 공식 정책을 반영하지 않습니다.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |