Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Workflow für die künstliche Intelligenz-gesteuerte Segmentierung von pathologiebestätigten Regionen von Interesse aus gefärbten, dünnen Gewebeschnittbildern zur Anreicherung von histologieaufgelösten Zellpopulationen mittels Laser-Mikrodissektion. Diese Strategie beinhaltet einen neuartigen Algorithmus, der die Übertragung von Demarkationen, die Zellpopulationen von Interesse bezeichnen, direkt auf Lasermikroskope ermöglicht.
Die Tumormikroumgebung (TME) stellt ein komplexes Ökosystem dar, das aus Dutzenden verschiedener Zelltypen besteht, darunter Tumor-, Stroma- und Immunzellpopulationen. Um die Variation auf Proteomebene und die Tumorheterogenität auf Skala zu charakterisieren, sind Hochdurchsatzmethoden erforderlich, um diskrete Zellpopulationen selektiv in soliden Tumormalignitäten zu isolieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Workflow, der durch künstliche Intelligenz (KI) ermöglicht wird und Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H&E)-gefärbten, dünnen Gewebeschnitten in pathologiebestätigte Regionen von Interesse für die selektive Ernte histologieaufgelöster Zellpopulationen mittels Lasermikrodissektion (LMD) segmentiert. Diese Strategie beinhaltet einen neuartigen Algorithmus, der die Übertragung von Regionen, die mit digitaler Bildsoftware auf Zellpopulationen von Interesse hinweisen, direkt auf Lasermikroskope ermöglicht und so einfachere Sammlungen ermöglicht. Es wurde eine erfolgreiche Implementierung dieses Workflows durchgeführt, die den Nutzen dieser harmonisierten Methode zur selektiven Ernte von Tumorzellpopulationen aus dem TME für die quantitative, gemultiplexte Proteomanalyse durch hochauflösende Massenspektrometrie demonstrierte. Diese Strategie lässt sich vollständig in die routinemäßige histopathologische Überprüfung integrieren und nutzt die digitale Bildanalyse, um die Anreicherung von Zellpopulationen von Interesse zu unterstützen, und ist vollständig generalisierbar, was harmonisierte Ernten von Zellpopulationen aus dem TME für multiomische Analysen ermöglicht.
Die TME stellt ein komplexes Ökosystem dar, das von einer Vielzahl von Zelltypen wie Tumorzellen, Stromazellen, Immunzellen, Endothelzellen, anderen mesenchymalen Zelltypen und Adipozyten zusammen mit einer komplexen extrazellulären Matrix 1 bevölkertist. Dieses zelluläre Ökosystem variiert innerhalb und zwischen verschiedenen Krankheitsorganstellen, was zu einer komplexen Tumorheterogenität führt 2,3. Neuere Studien haben gezeigt, dass heterogene Tumoren und Tumoren mit geringer Tumorzellularität (geringe Reinheit) oft mit einer schlechten Krankheitsprognose korrelieren 2,3.
Um das molekulare Zusammenspiel zwischen Tumor- und Nicht-Tumorzellpopulationen innerhalb der TME auf Skala zu verstehen, sind standardisierte und Hochdurchsatzstrategien erforderlich, um selektiv verschiedene Zellpopulationen zu ernten, die für die nachgelagerte multiomische Analyse von Interesse sind. Die quantitative Proteomik stellt eine sich schnell entwickelnde und immer wichtiger werdende Technik dar, um das Verständnis der Krebsbiologie zu fördern. Bisher hat die überwiegende Mehrheit der Studien, die Proteomik verwenden, dies mit Proteinen getan, die aus Ganztumorgewebepräparaten extrahiert wurden (z. B. kryopulverisiert), was zu einem Mangel am Verständnis der Heterogenität auf Proteomebene im TME 4,5,6 führte.
Die Entwicklung von Probenentnahmestrategien, die sich nahtlos in klinische Pathologie-Workflows integrieren und Informationen aus klinischen Pathologie-Workflows nutzen, wird eine neue Generation von histologie-aufgelösten Proteomics ermöglichen, die die Goldstandard-Workflows der diagnostischen Pathologie in hohem Maße ergänzen. LMD ermöglicht die direkte und selektive Erfassung zellulärer Subpopulationen oder Regionen von Interesse (ROIs) durch mikroskopische Inspektion von histologisch gefärbten Gewebedünnschnitten7. Jüngste große Fortschritte in der digitalen Pathologie und KI-fähigen Analyse haben die Fähigkeit gezeigt, einzigartige Zusammensetzungsmerkmale und ROIs innerhalb der TME automatisiert zu identifizieren, von denen viele mit molekularen Veränderungen und klinischen Krankheitsmerkmalen wie Therapieresistenz und Krankheitsprognosekorrelieren 8.
Der in dem hier vorgestellten Protokoll beschriebene Workflow nutzt kommerzielle Softwarelösungen, um Tumor-ROIs selektiv in digitalen Histopathologiebildern zu kommentieren, und verwendet intern entwickelte Softwaretools, um diese Tumor-ROIs auf Lasermikroskope zu übertragen, um diskrete Zellpopulationen von Interesse zu erfassen, die sich nahtlos in nachgelagerte multiomische Analyse-Workflows integrieren lassen. Diese integrierte Strategie verringert die LMD-Bedienerzeit erheblich und minimiert die Dauer, für die Gewebe Umgebungstemperatur haben müssen. Die Integration von automatisierter Merkmalsauswahl und LMD-Ernte mit quantitativer Proteomik mit hohem Durchsatz wird durch eine differentielle Analyse der TME aus zwei repräsentativen histologischen Subtypen des epithelialen Ovarialkarzinoms, dem hochgradigen serösen Eierstockkrebs (HGSOC) und dem Ovarialklarzellkarzinom (OCCC), demonstriert.
Während es mehrere Präzedenzfälle für Studien gab, die darauf abzielten, Arbeitsabläufe für die Anreicherung von zellulären Zielsubpopulationen aus FFPE und / oder frisch gefrorenem Gewebe und Methoden zur Aufrechterhaltung der Probenqualität während der Verarbeitung zu entwickeln 9,12,13,14,15, besteht ein erheblicher Bedarf, automatisierte Strategien für die Vorbereitung klinischer Gewebeproben für molekulare Analysenzu entwickeln, um die Variabilität zu verringern und erhöhen die Reproduzierbarkeit. Dieser Workflow beschreibt ein standardisiertes, halbautomatisiertes Protokoll, das bestehende Bildanalyse-Softwaretools (siehe Materialtabelle) für die histologieaufgelöste Ernte diskreter Zellpopulationen durch LMD aus klinischen Gewebeproben integriert.
Die räumlich aufgelöste LMD-Anreicherung von ROIs zur Erfassung diskreter Zellpopulationen stellt einen Gewebeverarbeitungsschritt der nächsten Generation vor multiomischen Analysen dar, um die molekulare Charakterisierung und Identifizierung zu verbessern und die Entdeckung zellselektiver Biomarker zu erleichtern. Dieses Protokoll verbessert bestehende Methoden, indem es die oft lange Exposition von Gewebeabschnitten gegenüber der Umgebungsumgebung reduziert, die mit einer manuellen Segmentierung des ROI durch einen Histologen verbunden ist (was >1-2 Stunden vor der LMD-Sammlung dauern kann). Dieser Workflow ermöglicht es stattdessen, den ROI durch KI-gesteuerte Klassifizierung und Segmentierung vorab zu identifizieren. Die Begrenzung der Gewebeverweilzeit verringert falsche Variationen bei der Beurteilung von hochlabilen molekularen Zielen wie Phosphopeptiden und mRNA oder für Antikörper-basierte Analysetechniken, die darauf angewiesen sind, dass sich ein Zielprotein in seiner nativen Konformation befindet, um nachgewiesen zu werden.
Eine Einschränkung der aktuellen Version des Malleator-Algorithmus besteht darin, dass sie nicht mit den vordefinierten Anmerkungsformwerkzeugen kompatibel ist, die von der Bildanalysesoftware bereitgestellt werden (siehe Materialverzeichnis), obwohl zukünftige Updates/Versionen des Algorithmus darauf abzielen, diese Kompatibilität zu verbessern. Die ANMERKUNGSDATEI für Formen, die mit diesen Werkzeugen gezeichnet wurden, enthält nur zwei Sätze von gepaarten x- und y-Koordinaten für jede Anmerkung, ohne die vollständige räumliche Ausrichtung um diese Punkte. Die aktuelle Verwendung dieser Werkzeuge führt dazu, dass die Anmerkungen während des Importvorgangs in gerade Linien umgewandelt werden, die nur durch zwei Punkte definiert sind. Die manuelle Definition von Tissue-ROI-Segmenten ist für eine erfolgreiche Konvertierung in das XML-Format und den LMD-Import erforderlich. Dies kann entweder durch manuelle Definition jedes ROI mit individuellen freihändigen polygonalen Annotationen, die für den Zielbereich spezifisch sind, oder durch Anwendung einer angenäherten kreisförmigen oder rechteckigen Annotation auf alle ROI-Segmente des Gewebes, falls gewünscht, erfolgen und ist mit diesem Workflow kompatibel.
Während der hier vorgestellte Workflow für die proteomische Analyse von frisch gefrorenen menschlichen Krebsgewebeproben demonstriert wurde, kann dieser KI-gesteuerte LMD-Workflow äquivalent mit FFPE-Geweben, nicht-krebsartigen Gewebetypen und solchen aus nicht-menschlichen Quellen verwendet werden. Es kann auch andere nachgelagerte molekulare Profiling-Workflows unterstützen, einschließlich transkriptomischer, genomischer oder phosphoprogeomischer Analysen. Dieser Workflow kann auch andere Anwendungen der Bildanalysesoftware nutzen (siehe Materialtabelle), einschließlich der Funktionen im Zusammenhang mit der Zellzählung oder anderen Analysemodulen, einschließlich des Moduls “Multiplex IHC” oder des “Tissue Microarray (TMA) Add-on”. Zukünftige Anwendungen dieses Workflows können auch davon profitieren, die Anzahl der Zellen pro ROI-Segment vorab zu definieren und dadurch äquivalente zelluläre Inputs über mehrere Sammlungen hinweg sicherzustellen, oder indem alternative Methoden zur Definition von zellulären ROIs von Interesse verwendet werden, z. B. durch Immunhistochemie oder Zellsoziologie.
The authors have nothing to disclose.
Die Finanzierung dieses Projekts erfolgte zum Teil durch das Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 und HU0001-16-2-00014) an die Uniformed Services University for the Gynecologic Cancer Center of Excellence. Die Sponsoren spielten keine Rolle bei der Gestaltung, Durchführung, Interpretation oder dem Schreiben der Studie. Verzichtserklärung: Die hierin geäußerten Ansichten sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik des Department of Army / Navy / Air Force, des Department of Defense oder der US-Regierung wider.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |