Este protocolo describe un flujo de trabajo de alto rendimiento para la segmentación impulsada por inteligencia artificial de regiones de interés confirmadas por patología a partir de imágenes de sección de tejido delgado teñidas para el enriquecimiento de poblaciones celulares resueltas por histología utilizando microdisección láser. Esta estrategia incluye un algoritmo novedoso que permite la transferencia de demarcaciones que denotan poblaciones celulares de interés directamente a los microscopios láser.
El microambiente tumoral (TME) representa un ecosistema complejo compuesto por docenas de tipos de células distintas, incluidas las poblaciones de tumores, estroma y células inmunes. Para caracterizar la variación a nivel de proteoma y la heterogeneidad tumoral a escala, se necesitan métodos de alto rendimiento para aislar selectivamente poblaciones celulares discretas en neoplasias malignas de tumores sólidos. Este protocolo describe un flujo de trabajo de alto rendimiento, habilitado por la inteligencia artificial (IA), que segmenta imágenes de hematoxilina y eosina (H&E) teñidas de secciones de tejido delgado en regiones de interés confirmadas por patología para la recolección selectiva de poblaciones celulares resueltas por histología utilizando microdisección láser (LMD). Esta estrategia incluye un nuevo algoritmo que permite la transferencia de regiones que denotan poblaciones celulares de interés, anotadas utilizando software de imagen digital, directamente a microscopios láser, lo que permite colecciones más fáciles. Se realizó una implementación exitosa de este flujo de trabajo, lo que demuestra la utilidad de este método armonizado para cosechar selectivamente poblaciones de células tumorales del TME para el análisis proteómico cuantitativo multiplexado mediante espectrometría de masas de alta resolución. Esta estrategia se integra completamente con la revisión histopatología de rutina, aprovechando el análisis de imágenes digitales para apoyar el enriquecimiento de las poblaciones celulares de interés y es totalmente generalizable, lo que permite cosechas armonizadas de poblaciones celulares del TME para análisis multiómicos.
El TME representa un ecosistema complejo poblado por una gama muy diversa de tipos de células, como células tumorales, células estromales, células inmunes, células endoteliales, otros tipos de células mesenquimales y adipocitos, junto con una matriz extracelular compleja1. Este ecosistema celular varía dentro y entre los diferentes sitios de órganos de la enfermedad, lo que resulta en una heterogeneidad tumoral compleja 2,3. Estudios recientes han demostrado que los tumores heterogéneos y los tumores con baja celularidad tumoral (baja pureza) a menudo se correlacionan con un mal pronóstico de la enfermedad 2,3.
Para comprender la interacción molecular entre las poblaciones de células tumorales y no tumorales dentro de la EMT a escala, se necesitan estrategias estandarizadas y de alto rendimiento para cosechar selectivamente distintas poblaciones celulares de interés para el análisis multiómico posterior. La proteómica cuantitativa representa una técnica en rápida evolución y cada vez más importante para mejorar la comprensión de la biología del cáncer. Hasta la fecha, la preponderancia de los estudios que emplean proteómica lo han hecho con proteínas extraídas de preparaciones de tejido tumoral completo (por ejemplo, criopulverizadas), lo que lleva a una escasez en la comprensión de la heterogeneidad a nivel de proteoma en la TME 4,5,6.
El desarrollo de estrategias de recolección de muestras que se integren a la perfección y aprovechen la información de los flujos de trabajo de patología clínica permitirá una nueva generación de proteómicas resueltas por histología que son altamente complementarias a los flujos de trabajo de patología diagnóstica estándar de oro. LMD permite la recolección directa y selectiva de subpoblaciones celulares o regiones de interés (ROI) a través de la inspección microscópica de secciones delgadas de tejido teñido histológicamente7. Los recientes avances importantes en patología digital y análisis habilitados para IA han demostrado la capacidad de identificar características composicionales y ROI únicas dentro de la EMT de manera automatizada, muchas de las cuales se correlacionan con alteraciones moleculares y características clínicas de la enfermedad, como la resistencia a la terapia y el pronóstico de la enfermedad8.
El flujo de trabajo descrito en el protocolo presentado aquí aprovecha las soluciones de software comerciales para anotar selectivamente los ROI tumorales dentro de las imágenes de histopatología digital, y utiliza herramientas de software desarrolladas internamente para transferir estos ROI tumorales a microscopios láser para la recopilación automatizada de poblaciones celulares discretas de interés que se integran a la perfección con los flujos de trabajo de análisis multiómico posteriores. Esta estrategia integrada disminuye significativamente el tiempo del operador de LMD y minimiza la duración durante la cual se requiere que los tejidos estén a temperatura ambiente. La integración de la selección automatizada de características y la cosecha de LMD con la proteómica cuantitativa de alto rendimiento se demuestra a través de un análisis diferencial de la EMT de dos subtipos histológicos representativos de cáncer de ovario epitelial, el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) y el carcinoma de células claras de ovario (OCCC).
Si bien ha habido múltiples precedentes de estudios destinados a desarrollar y / o mejorar los flujos de trabajo para el enriquecimiento de subpoblaciones celulares objetivo a partir de FFPE y / o tejidos frescos congelados y metodologías para mantener la calidad de la muestra duranteel procesamiento 9,12,13,14,15, existe una necesidad sustancial de desarrollar estrategias automatizadas para preparar muestras de tejido clínico para análisis moleculares para disminuir la variabilidad y aumentar la reproducibilidad. Este flujo de trabajo describe un protocolo estandarizado y semiautomatizado que integra las herramientas de software de análisis de imágenes existentes (consulte la Tabla de materiales) para la recolección resuelta histológicamente de poblaciones de células discretas por LMD a partir de muestras de tejido clínico.
El enriquecimiento de LMD resuelto espacialmente de LOS ROI que capturan poblaciones celulares discretas representa un paso de procesamiento de tejidos de próxima generación antes de los análisis multiómicos para mejorar la caracterización e identificación molecular y facilitar el descubrimiento de biomarcadores selectivos celulares. Este protocolo mejora las metodologías existentes al reducir la exposición a menudo prolongada de las secciones de tejido al entorno ambiental que se asocia con la segmentación manual del ROI por parte de un histólogo (que puede tardar >1-2 h antes de la recolección de LMD). En cambio, este flujo de trabajo permite que el ROI se identifique previamente mediante clasificación y segmentación guiadas por IA. Limitar el tiempo de permanencia del tejido disminuirá las variaciones espurias en las evaluaciones de objetivos moleculares altamente lábiles, como fosfopéptidos y ARNm, o para técnicas analíticas basadas en anticuerpos que se basan en una proteína objetivo que se encuentra en su conformación nativa para su detección.
Cortar fiduciales de calibrador limpios en la diapositiva de membrana PEN que son claramente visibles en la imagen de diapositiva escaneada es uno de los componentes clave que permiten la integración del software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) con el flujo de trabajo de LMD. Asegurarse de que los calibradores tengan un punto preciso (“limpio”) en la parte inferior de la forma de “V” permite seleccionar un punto preciso en el software de análisis de imágenes para las líneas del calibrador que se van a extraer, como se describe en los pasos 5.1.6 y 5.2.13. La alineación de estos puntos durante la importación en el software LMD es fundamental para superponer adecuadamente las anotaciones (facilitadas a través de la generación de un archivo .xml compatible utilizando los algoritmos “Malleator” y / o “Dapọ”) en el ROI de tejido relevante en la diapositiva LMD física. Es necesario resaltar todas las formas y colectivamente “arrastrar y soltar” en su lugar, incluso cuando la alineación es precisa al importarla al software LMD para registrar la posición vertical (plano z) de la etapa de deslizamiento en el microscopio láser. También se pueden realizar ajustes menores en el posicionamiento de las anotaciones sobre el ROI del tejido durante este paso, si es necesario.
Una limitación de la versión actual del algoritmo Malleator es que no es compatible con las herramientas de forma de anotación predefinidas proporcionadas por el software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales), aunque las futuras actualizaciones / versiones del algoritmo tendrán como objetivo mejorar esta compatibilidad. El archivo .annotation para las formas dibujadas con estas herramientas contiene sólo dos conjuntos de coordenadas x e y emparejadas para cada anotación, sin la orientación espacial completa alrededor de esos puntos. El uso actual de estas herramientas da como resultado que las anotaciones se conviertan en líneas rectas definidas por solo dos puntos durante el proceso de importación. Se requiere la definición manual de segmentos de ROI de tejido para una conversión exitosa a formato XML y la importación lmD. Esto se puede realizar definiendo manualmente cada ROI con anotaciones poligonales individuales a mano alzada específicas para el área objetivo o aplicando una anotación circular o rectangular aproximada en todos los segmentos de ROI de tejido, si se desea, y será compatible con este flujo de trabajo.
Si bien el flujo de trabajo presentado aquí se demostró para el análisis proteómico de muestras de tejido de cáncer humano recién congelado, este flujo de trabajo de LMD impulsado por IA se puede usar de manera equivalente con tejidos FFPE, tipos de tejidos no cancerosos y aquellos de fuentes no humanas. También puede admitir otros flujos de trabajo de perfiles moleculares posteriores, incluidos los análisis transcriptómicos, genómicos o fosfoproteómicos. Este flujo de trabajo también puede aprovechar otros usos del software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales), incluso con capacidades asociadas con el conteo de células u otros módulos analíticos, incluido el módulo “Multiplex IHC” o el “Tissue Microarray (TMA) Add-on”. Las aplicaciones futuras de este flujo de trabajo también pueden beneficiarse de la predefinición del número de células por segmento de ROI, asegurando así entradas celulares equivalentes a través de múltiples colecciones, o mediante el uso de métodos alternativos para definir los ROI celulares de interés, como la inmunohistoquímica o la sociología celular.
The authors have nothing to disclose.
El financiamiento para este proyecto fue proporcionado en parte por el Programa de Salud de Defensa (HU0001-16-2-0006 y HU0001-16-2-00014) a la Universidad de Servicios Uniformados para el Centro de Excelencia de Cáncer Ginecológico. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño, ejecución, interpretación o redacción del estudio. Renuncia: Las opiniones expresadas en este documento son las de los autores y no reflejan la política oficial del Departamento del Ejército / Marina / Fuerza Aérea, el Departamento de Defensa o el Gobierno de los Estados Unidos.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |