Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento para segmentação de regiões de interesse confirmadas pela patologia de imagens de seção de tecidos manchados e finos para enriquecimento de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser. Esta estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de demarcações denotando populações celulares de interesse diretamente para microscópios a laser.
O microambiente tumoral (TME) representa um ecossistema complexo composto por dezenas de tipos de células distintas, incluindo populações de tumores, estroma e células imunes. Para caracterizar a variação do nível de proteome e a heterogeneidade tumoral em escala, métodos de alto rendimento são necessários para isolar seletivamente populações celulares discretas em malignidades tumorais sólidas. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento, habilitado pela inteligência artificial (IA), que segmenta imagens de hematoxilina e eosina (H&E) manchadas de tecidos finos em regiões de interesse confirmadas pela patologia para a colheita seletiva de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser (LMD). Essa estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de regiões denotando populações celulares de interesse, anotadas usando software de imagem digital, diretamente para microscópios a laser, permitindo assim coleções mais fáceis. Foi realizada a implementação bem-sucedida deste fluxo de trabalho, demonstrando a utilidade deste método harmonizado para colher seletivamente populações de células tumorais do TME para análise proteômica quantitativa e multiplexada por espectrometria de massa de alta resolução. Essa estratégia integra-se plenamente à revisão histopatologia de rotina, aproveitando a análise de imagens digitais para apoiar o enriquecimento das populações celulares de interesse e é totalmente generalizável, possibilitando colheitas harmonizadas de populações celulares do TME para análises multiômicas.
O TME representa um ecossistema complexo povoado por uma variedade altamente diversificada de tipos celulares, como células tumorais, células estromais, células imunes, células endoteliais, outros tipos de células mesenquimais e adipócitos, juntamente com uma complexa matriz extracelular1. Esse ecossistema celular varia dentro e em diferentes sítios de órgãos de doença, resultando em heterogeneidade tumoral complexa 2,3. Estudos recentes têm demonstrado que tumores heterogêneos e tumores com baixa celularidade tumoral (baixa pureza) muitas vezes se correlacionam com o prognóstico da doença ruim 2,3.
Para entender a interação molecular entre populações de tumores e células não tumorais dentro do TME em escala, estratégias padronizadas e de alto rendimento são necessárias para colher seletivamente populações celulares distintas de interesse para análise multiômica a jusante. A proteômica quantitativa representa uma técnica em rápida evolução e cada vez mais importante para promover a compreensão da biologia do câncer. Até o momento, a preponderância dos estudos que empregam proteômica tem feito isso com proteínas extraídas de preparações inteiras de tecido tumoral (por exemplo, criopulverizadas), levando a uma escassez na compreensão da heterogeneidade de nível proteome no TME 4,5,6.
O desenvolvimento de estratégias de coleta de amostras que se integrem perfeitamente e aproveitem informações a partir de fluxos de trabalho de patologia clínica permitirão uma nova geração de proteômicas resolvidas em histologia que sejam altamente complementares aos fluxos de trabalho de patologia diagnóstica padrão-ouro. A LMD permite a coleta direta e seletiva de subpopulações celulares ou regiões de interesse (ROIs) através de inspeção microscópica das seções finas de tecido histologicamentemanchados 7. Os recentes grandes avanços na patologia digital e na análise habilitada para IA demonstraram a capacidade de identificar características composicionais únicas e ROIs dentro do TME de forma automatizada, muitas das quais se correlacionam com alterações moleculares e características clínicas da doença, como resistência à terapia e prognóstico dedoenças 8.
O fluxo de trabalho descrito no protocolo aqui apresentado aproveita soluções de software comercial para anotar seletivamente ROIs tumorais dentro de imagens de histopatologia digital, e utiliza ferramentas de software desenvolvidas internamente para transferir esses ROIs tumorais para microscópios laser para coleta automatizada de populações celulares discretas de interesse que se integra perfeitamente com fluxos de trabalho de análise multiômica a jusante. Esta estratégia integrada diminui significativamente o tempo do operador de LMD e minimiza a duração para a qual os tecidos são necessários para estar em temperatura ambiente. A integração da seleção automatizada de recursos e da colheita de LMD com proteômica quantitativa de alto rendimento é demonstrada através de uma análise diferencial do TME de dois subtipos histológicos representativos do câncer de ovário epitelial, câncer de ovário soros de alto grau (HGSOC) e carcinoma de células claras ovarianas (OCCC).
Embora existam múltiplos precedentes de estudo destinados a desenvolver e/ou melhorar os fluxos de trabalho para enriquecimento de subpopulações celulares-alvo de tecidos e metodologias congeladas e frescas para a manutenção da qualidade da amostra durante o processamentode 9,12,13,14,15, existe uma necessidade substancial de desenvolver estratégias automatizadas para a preparação de amostras de tecido clínico para análises moleculares para diminuir a variabilidade e aumentar a reprodutibilidade. Este fluxo de trabalho descreve um protocolo padronizado e semautomado que integra ferramentas de software de análise de imagem existentes (ver a Tabela de Materiais) para a colheita de populações de células discretas por LMD de amostras de tecido clínico.
O enriquecimento de LMD espacialmente resolvido de ROIs capturando populações de células discretas representa uma etapa de processamento de tecidos de próxima geração antes de análises multiômicas para melhorar a caracterização e identificação molecular e facilitar a descoberta de biomarcadores seletivos celulares. Este protocolo melhora as metodologias existentes, reduzindo a exposição muitas vezes longa de seções teciduais ao ambiente que está associada à segmentação manual do ROI por um histólogo (que pode levar >1-2 h antes da coleta de LMD). Este fluxo de trabalho permite que o ROI seja pré-identificado pela classificação e segmentação guiadas por IA. Limitar o tempo de moradia tecidual diminuirá variações espúrias nas avaliações de alvos moleculares altamente labiais, como fosforpeptídeos e mRNA, ou para técnicas analíticas baseadas em anticorpos que dependem de uma proteína-alvo estar em sua conformação nativa para detecção.
O corte de fiduciais de calibrador puro no slide da membrana PEN que são claramente visíveis na imagem de slide digitalizada é um dos componentes-chave que permitem a integração do software de análise de imagem (ver a Tabela de Materiais) com o fluxo de trabalho LMD. Garantir que os calibradores tenham um ponto preciso (“limpo”) na parte inferior da forma “V” permite a seleção de um ponto preciso no software de análise de imagem para que as linhas calibradoras sejam desenhadas, conforme descrito nas etapas 5.1.6 e 5.2.13. O alinhamento desses pontos durante a importação para o software LMD é fundamental para sobrepor adequadamente as anotações (facilitadas através da geração de um arquivo .xml compatível usando os algoritmos “Malleator” e/ou “Dapě”) no ROI de tecido relevante no slide LMD físico. É necessário destacar todas as formas e coletivamente “arrastar e soltar” coletivamente no lugar mesmo quando o alinhamento é preciso ao importar para o software LMD para registrar a posição vertical (z-plane) do estágio de slides no microscópio laser. Pequenos ajustes no posicionamento das anotações sobre o ROI tecidual também podem ser feitos durante esta etapa, se necessário.
Uma limitação da versão atual do algoritmo Malleator é que ele não é compatível com as ferramentas de forma de anotação predefinidas fornecidas pelo software de análise de imagem (ver a Tabela de Materiais), embora futuras atualizações/versões do algoritmo visarão melhorar essa compatibilidade. O arquivo .anotação para formas desenhadas usando essas ferramentas contém apenas dois conjuntos de coordenadas emparelhadas x e y para cada anotação, sem a orientação espacial completa em torno desses pontos. O uso atual dessas ferramentas resulta na conversão das anotações em linhas retas definidas por apenas dois pontos durante o processo de importação. A definição manual dos segmentos de ROI de tecido é necessária para conversão bem-sucedida para formato XML e importação de LMD. Isso pode ser realizado definindo manualmente cada ROI com anotações poligonais individuais à mão livre específicas da área alvo ou aplicando uma anotação circular ou retangular aproximada em todos os segmentos de ROI de tecido, se desejar, e será compatível com este fluxo de trabalho.
Embora o fluxo de trabalho aqui apresentado tenha sido demonstrado para análise proteômica de amostras de tecido de câncer humano congelado fresco, este fluxo de trabalho LMD orientado por IA pode ser usado equivalentemente com tecidos FFPE, tipos de tecidos não cancerígenos, e aqueles de fontes não humanas. Ele também pode suportar outros fluxos de trabalho de perfil molecular a jusante, incluindo análises transcriômicas, genômicas ou fosfoproteômicas. Este fluxo de trabalho também pode aproveitar outros usos do software de análise de imagens (ver a Tabela de Materiais), inclusive com recursos associados à contagem de células ou outros módulos analíticos, incluindo o módulo “Multiplex IHC” ou o Add-on “Tissue Microarray (TMA).” Aplicações futuras deste fluxo de trabalho também podem se beneficiar de predefinir o número de células por segmento de ROI, garantindo entradas celulares equivalentes em várias coleções, ou usando métodos alternativos para definir ROIs celulares de interesse, como por imunohistoquímica ou sociologia celular.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento para este projeto foi fornecido em parte pelo Programa de Saúde de Defesa (HU0001-16-2-0006 e HU0001-16-2-00014) para a Universidade de Serviços Uniformizados para o Centro de Excelência do Câncer Ginecológico. Os patrocinadores não tiveram papel no projeto, execução, interpretação ou redação do estudo. Disclaimer: As opiniões aqui expressas são dos autores e não refletem a política oficial do Departamento do Exército/Marinha/Força Aérea, Departamento de Defesa ou Governo dos EUA.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |