Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning for kunstig intelligens-drevet segmentering av patologibekreftede interesseområder fra fargede, tynne vevsseksjonsbilder for berikelse av histologi-løste cellepopulasjoner ved hjelp av lasermikrodisseksjon. Denne strategien inkluderer en ny algoritme som muliggjør overføring av avgrensninger som betegner cellepopulasjoner av interesse direkte til lasermikroskoper.
Tumormikromiljøet (TME) representerer et komplekst økosystem som består av dusinvis av forskjellige celletyper, inkludert tumor-, stroma- og immuncellepopulasjoner. For å karakterisere variasjon på proteomnivå og tumor heterogenitet i stor skala, er det nødvendig med høy gjennomstrømningsmetoder for å selektivt isolere diskrete cellulære populasjoner i faste tumor maligniteter. Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning, aktivert av kunstig intelligens (AI), som segmenterer bilder av hematoksylin og eosin (H&E)-fargede, tynne vevsseksjoner i patologibekreftede interesseområder for selektiv høsting av histologi-løste cellepopulasjoner ved hjelp av lasermikrodisseksjon (LMD). Denne strategien inkluderer en ny algoritme som muliggjør overføring av regioner som betegner cellepopulasjoner av interesse, kommentert ved hjelp av digital bildeprogramvare, direkte til lasermikroskoper, og dermed muliggjør flere facile samlinger. Vellykket implementering av denne arbeidsflyten ble utført, og demonstrerte nytten av denne harmoniserte metoden for selektiv høsting av tumorcellepopulasjoner fra TME for kvantitativ, multiplekset proteomisk analyse ved høyoppløselig massespektrometri. Denne strategien integreres fullt ut med rutinemessig histopatologigjennomgang, og utnytter digital bildeanalyse for å støtte berikelse av cellulære populasjoner av interesse og er fullt generaliserbar, noe som muliggjør harmoniserte høstinger av cellepopulasjoner fra TME for multiomiske analyser.
TME representerer et komplekst økosystem befolket av et svært variert utvalg av celletyper, for eksempel tumorceller, stromale celler, immunceller, endotelceller, andre mesenchymale celletyper og adipocytter, sammen med en kompleks ekstracellulær matrise1. Dette cellulære økosystemet varierer innenfor og på tvers av forskjellige sykdomsorganer, noe som resulterer i kompleks tumor heterogenitet 2,3. Nyere studier har vist at heterogene svulster og svulster med lav tumor cellulæritet (lav renhet) ofte korrelerer med dårlig sykdom prognose 2,3.
For å forstå det molekylære samspillet mellom tumor- og ikke-tumorcellepopulasjoner i TME i stor skala, er standardiserte og høygjennomstrømningsstrategier nødvendig for selektiv høsting av distinkte cellulære populasjoner av interesse for nedstrøms multiomisk analyse. Kvantitativ proteomikk representerer en raskt utviklende og stadig viktigere teknikk for å fremme forståelsen av kreftbiologi. Til dags dato har overvekten av studier som bruker proteomikk gjort det med proteiner ekstrahert fra hele tumorvevspreparater (f.eks. kryopulverisert), noe som fører til en paucity i forståelsen av proteome-nivå heterogenitet i TME 4,5,6.
Utviklingen av prøveinnsamlingsstrategier som sømløst integreres med og utnytter informasjon fra kliniske patologiske arbeidsflyter, vil muliggjøre en ny generasjon histologi-løst proteomikk som er svært komplementære til gullstandardiserte, diagnostiske patologiske arbeidsflyter. LMD muliggjør direkte og selektiv innsamling av cellulære subpopuleringer eller interesseområder (ROIer) gjennom mikroskopisk inspeksjon av histologisk farget vev tynne seksjoner7. Nylige store fremskritt innen digital patologi og AI-aktivert analyse har vist evnen til å identifisere unike komposisjonsegenskaper og ROIer innen TME på en automatisert måte, hvorav mange korrelerer med molekylære endringer og kliniske sykdomsfunksjoner, for eksempel resistens mot terapi og sykdomsprognose8.
Arbeidsflyten som er beskrevet i protokollen som presenteres her, utnytter kommersielle programvareløsninger for å selektivt kommentere tumor-ROIer i digitale histopatologibilder, og bruker programvareverktøy utviklet internt for å overføre disse tumor-ROIene til lasermikroskoper for automatisert innsamling av diskrete cellulære populasjoner av interesse som sømløst integreres med nedstrøms multiomiske analysearbeidsflyter. Denne integrerte strategien reduserer LMD-operatørtiden betydelig og minimerer varigheten som vev er nødvendig for å være ved omgivelsestemperatur. Integrasjonen av automatisert funksjonsvalg og LMD-høsting med kvantitativ proteomikk med høy gjennomstrømning demonstreres gjennom en differensialanalyse av TME fra to representative epitelale ovarialkreft histologiske undertyper, høyverdig serøs eggstokkkreft (HGSOC) og ovarialklart cellekarsinom (OCCC).
Mens det har vært flere studiepresedenser som tar sikte på å utvikle og/eller forbedre arbeidsflyter for berikelse av målcelleunderbefolkninger fra FFPE og/eller ferskfrossen vev og metoder for å opprettholde prøvekvaliteten under behandling av 9,12,13,14,15, er det et betydelig behov for å utvikle automatiserte strategier for å forberede kliniske vevsprøver for molekylære analyser for å redusere variasjon og øke reproduserbarheten. Denne arbeidsflyten beskriver en standardisert, halvautomatisert protokoll som integrerer eksisterende programvareverktøy for bildeanalyse (se materialtabellen) for histologi-løst høsting av diskrete cellepopulasjoner av LMD fra kliniske vevsprøver.
Romlig løst LMD-berikelse av ROIer som fanger diskrete cellepopulasjoner representerer et neste generasjons vevsbehandlingstrinn før multiomiske analyser for å forbedre molekylær karakterisering og identifisering og legge til rette for celleselektiv biomarkøroppdagelse. Denne protokollen forbedrer eksisterende metoder ved å redusere den ofte lange eksponeringen av vevsseksjoner til omgivelsesmiljøet som er forbundet med manuell segmentering av avkastning av en histolog (som kan ta > 1-2 timer før LMD-samlingen). Denne arbeidsflyten gjør det i stedet mulig for avkastning å bli preidentifisert av AI-veiledet klassifisering og segmentering. Begrensning av vevsboende tid vil redusere falske variasjoner i vurderingene av svært labile molekylære mål, som fosfopeptider og mRNA, eller for antistoffbaserte analytiske teknikker som er avhengige av at et målprotein er i sin opprinnelige konformasjon for deteksjon.
Å kutte ryddige kalibratorfiducials på PEN-membranlysbildet som er tydelig synlige i det skannede lysbildebildet, er en av nøkkelkomponentene som muliggjør integrering av bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen) med LMD-arbeidsflyten. Ved å sikre at kalibratorene har et presist (“rent”) punkt nederst på “V”-formen, kan du velge et presist punkt i bildeanalyseprogramvaren for kalibratorlinjene som skal trekkes fra, som beskrevet i trinn 5.1.6 og 5.2.13. Justering av disse punktene under import til LMD-programvaren er avgjørende for å legge merknadene riktig over (tilrettelagt gjennom genereringen av en kompatibel .xml fil ved hjelp av algoritmene “Malleator” og/eller “Dapọ” ) på den relevante vevs-ROI på det fysiske LMD-lysbildet. Det er nødvendig å markere alle former og kollektivt “dra og slipp” på plass selv når justeringen er presis ved import til LMD-programvaren for å registrere den vertikale (z-plan) posisjonen til lysbildetrinnet på lasermikroskopet. Mindre justeringer av plasseringen av merknadene over vevet ROI kan også gjøres i løpet av dette trinnet, om nødvendig.
En begrensning av den nåværende versjonen av Malleator-algoritmen er at den ikke er kompatibel med de forhåndsdefinerte merknadsformverktøyene som tilbys av bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen), selv om fremtidige oppdateringer / versjoner av algoritmen vil ta sikte på å forbedre denne kompatibiliteten. MERKNAD-filen for figurer som tegnes ved hjelp av disse verktøyene, inneholder bare to sett med sammenkoblede x- og y-koordinater for hver merknad, uten fullstendig romlig retning rundt disse punktene. Gjeldende bruk av disse verktøyene fører til at merknadene konverteres til rette linjer som er definert av bare to punkt under importprosessen. Manuell definisjon av vevs-ROI-segmenter kreves for vellykket konvertering til XML-format og LMD-import. Dette kan enten utføres ved å definere hver avkastning manuelt med individuelle frihånds polygonale merknader som er spesifikke for målområdet, eller ved å bruke en tilnærmet sirkulær eller rektangulær merknad på tvers av alle vevs-ROI-segmenter, om ønskelig, og vil være kompatible med denne arbeidsflyten.
Mens arbeidsflyten som presenteres her ble demonstrert for proteomisk analyse av ferskfrossen humane kreftvevsprøver, kan denne AI-drevne LMD-arbeidsflyten brukes tilsvarende med FFPE-vev, ikke-kreftfremkallende vevstyper og de fra ikke-menneskelige kilder. Den kan også støtte andre nedstrøms molekylære profileringsarbeidsflyter, inkludert transkripsjons-, genomiske eller fosfoproteomiske analyser. Denne arbeidsflyten kan også utnytte annen bruk av bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen), inkludert med funksjoner knyttet til celletelling eller andre analytiske moduler, inkludert “Multiplex IHC”-modulen eller “Tissue Microarray (TMA) Add-on”. Fremtidige anvendelser av denne arbeidsflyten kan også dra nytte av å forhåndsdefinere antall celler per AVKASTNING-segment, og dermed sikre tilsvarende cellulære inndata på tvers av flere samlinger, eller ved å bruke alternative metoder for å definere cellulære ROIer av interesse, for eksempel ved immunhiistokjemi eller cellesosiologi.
The authors have nothing to disclose.
Støtten til dette prosjektet ble delvis gitt av Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 og HU0001-16-2-00014) til Uniformed Services University for Gynecologic Cancer Center of Excellence. Sponsorene hadde ingen rolle i utformingen, utførelsen, tolkningen eller skrivingen av studien. Ansvarsfraskrivelse: Synspunktene som uttrykkes her er forfatternes og gjenspeiler ikke den offisielle politikken til Department of Army / Navy / Air Force, Department of Defense eller U.S. Government.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |