Summary
该协议描述了磷酸钙诱导的腹主动脉瘤（AAA）小鼠模型，以研究AAA的病理特征和分子机制。
Abstract
腹主动脉瘤 （AAA） 是一种危及生命的心血管疾病，在世界范围内发生，其特征是腹主动脉不可逆扩张。目前，使用了几种化学诱导的鼠AAA模型，每个模型都模拟AAA发病机制的不同方面。与血管紧张素II和弹性蛋白诱导的AAA模型相比，磷酸钙诱导的AAA模型是一种快速且具有成本效益的模型。将CaPO4 晶体应用于小鼠主动脉会导致弹性纤维降解，平滑肌细胞丢失，炎症和与主动脉扩张相关的钙沉积。本文介绍了CaPO4诱导的AAA模型的标准协议。该方案包括材料制备，将CaPO4手术应用于肾下腹主动脉的外膜，收获主动脉以可视化主动脉瘤以及小鼠的组织学分析。
Introduction
腹主动脉瘤 （AAA） 是一种致命的心血管疾病，其特征是腹主动脉永久性扩张，一旦破裂，死亡率很高。AAA 与衰老、吸烟、男性、高血压和高脂血症有关1。几种病理过程已被证明有助于AAA的形成，包括细胞外基质纤维蛋白水解，免疫细胞浸润和血管平滑肌细胞的丧失。目前，AAA的病理机制仍然难以捉摸，并且没有经过验证的药物治疗AAA1。由于人类主动脉样本很少，对人类AAA的研究受到限制;因此，已经建立并广泛采用几种化学修饰诱导的动物AAA模型，包括皮下血管紧张素II（AngII）输注，血管周围或腔内弹性蛋白酶孵育以及血管周围磷酸钙应用2。常用的小鼠模型是将磷酸钙（CaPO4）应用于肾下腹主动脉的外膜，具有成本效益且不需要基因修饰。
Gertz等人最初报道了将CaCl2直接应用于兔颈动脉以诱导动脉瘤变化，后来应用于小鼠的腹主动脉。该模型由Yamanouchi等人开发，通过在小鼠中使用CaPO 4晶体来加速主动脉扩张4。CaPO4浸润到小鼠主动脉中概括了在人类AAA中观察到的许多病理特征，包括深度巨噬细胞浸润，细胞外基质降解和钙沉积。人类AAA的危险因素，如高脂血症，也增加了CaPO4诱导的小鼠AAA5。与ApoE-/-或LDLR-/-小鼠中AngII灌注诱导的AAA相反，CaPO4诱导的AAA发生在肾下主动脉区域，其模拟人类AAA。目前，该方法已广泛应用于评估转基因小鼠对AAA发展的敏感性和评估药物6，7的抗AAA作用。
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Protocol
动物研究按照北京大学医学部机构动物护理与使用委员会的指导方针进行，并得到北京大学生物医学伦理委员会（LA2015142）的批准。所有用于手术的小鼠均用异氟醚（1.5%-2%）麻醉，并仔细监测麻醉以避免小鼠疼痛或不适。
1. 准备
- 切下0.3厘米宽的无粉橡胶手套和纱布。
- 购买8-10周龄的C57BL / 6J雄性小鼠。将动物安置在空调环境中，进行12小时的明暗循环，并免费获得食物和水。
- 手术前高压灭菌纱布、棉签、剪刀和镊子。
- 获取倍他定、70% 乙醇和消毒洗手液。
- 戴上口罩、防护服和无菌手套。
2. 外科手术
- 手术前2-4小时将咀嚼片卡洛芬片（5mg / kg剂量）喂给8-10周大的C57BL / 6J小鼠。然后，将小鼠置于含有异氟醚的诱导室（206mm x 210 mm x 140 mm）中，流速为1.5%-2%。
- 监测小鼠约5分钟，直到呼吸明显减慢。确保小鼠在手术前对疼痛刺激没有反应。
- 在眼睛上涂抹眼药膏，并用加热垫或毯子提供热支持。在手术过程中，每15分钟用脚趾捏一下确认麻醉深度。
- 使用电动剪或脱毛膏剃掉鼠标的腹毛。用甜菜碱擦拭并擦拭剃光区域，然后用70%乙醇打圈数次。更换手套以保持无菌。
- 用剪刀沿着腹部中线在下腹部做一个~1.5厘米的切口。
- 使用蘸有生理盐水的无菌棉签小心地取出肠道，直到可见肾下主动脉。
- 从肾下主动脉解剖结缔组织和脂肪约 0.5 cm 切片。注意背侧的小血管，避免撕裂它们。无需将腹主动脉与腹主静脉分开。
- 在腹主动脉和腹主静脉下包装一块盐水浸泡的橡胶手套条。使用棉签擦去多余的液体。
- 在肾下腹部脉管系统的外罩上包装一块浸有0.5M CaCl2 的纱布10分钟。对于假小鼠组，用生理盐水替换0.5M CaCl2 。
- 取下纱布并包装另一块浸有PBS溶液5分钟的纱布，以在主动脉外膜原位产生CaPO4晶体。
- 小心地取下橡胶手套条和纱布。重置鼠标的肠道。
- 用5-0缝合缝合腹部切口和皮肤。
- 将鼠标放在加热垫上，直到鼠标恢复意识。根据当地动物伦理委员会的说法，提供术后疼痛恢复住房和镇痛。
- 将鼠标再放置 14 天。手术后密切监测小鼠，随后每天至少观察1次。如果在此期间有任何小鼠死亡，请立即进行尸检。
3. 采集用于主动脉成像
- 手术后14天，使用CO2处死小鼠。
- 在腹侧切开小鼠胸腔和腹腔，切开右心房。
- 通过心脏左心室向小鼠灌注PBS缓冲液以去除主动脉中的血液，然后如前所述用4%多聚甲醛灌注8。
- 在立体镜下收获主动脉。
- 将收获的主动脉置于含有5mL 4%多聚甲醛的管中48小时。
- 在立体镜下小心地去除外源组织和脂肪，并用昆虫针将主动脉钉在黑色蜡板上。
- 获取主动脉图像。
4. 弹性纤维降解的评估
- 将主动脉瘤组织切成连续冷冻切片（7μm厚）。
- 根据制造商的方案，使用商用弹性货车 （EVG） 染色试剂盒分析弹性纤维。
- 对弹性蛋白降解进行分级。1级：降解<25%;2 级：降解 25%-50%;3 级：降解 50% 至 75%;或 4 级：降解>75%。
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Representative Results
施用CaPO4后14天，对C57BL/6J雄性小鼠实施安乐死，收获并清洁其主动脉。对主动脉的形态进行成像以可视化AAA形成。如图1A-B所示，CaPO4的应用导致肾下腹主动脉扩张。在组织学上，CaPO4导致弹性纤维的显着降解，如弹性蛋白断裂所示（图1C）。
图 1：8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠在 14 天后用盐水（假）或收获的 CaPO4 处理。 （A）立体镜下肾下腹主动脉的代表性图像。（B）小鼠主动脉的代表性形态图像;比例尺 = 1 mm. （C） 主动脉弹性范吉森染色的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
CaPO4的手术周围应用是在小鼠中诱导AAA的可靠方法。一些研究使用了CaPO4模型，并一致报告说这是一种快速且可重复的方法来研究小鼠的AAA7，9。该模型被认为概括了人主动脉瘤的部分特征，并为AAA发病机制提供了机制见解，包括炎症和细胞外基质降解。
人类AAA的危险因素主要包括衰老、男性、吸烟、高脂血症、高血压和动脉粥样硬化10。虽然没有系统地研究，但当使用CaPO4 模型时，也发现高脂血症会使小鼠易患AAA扩增。与人类不同，衰老在小鼠CaPO4 模型5的AAA形成中起着次要作用。以往的大型流行病学研究表明，糖尿病是人类AAA11的独立阴性危险因素。虽然一些数据表明二甲双胍（一种糖尿病药物）会引起这种效应，但有趣的是，在CaPO4 模型中，高血糖症通过抑制巨噬细胞活化来抑制主动脉扩张12。
目前，已经建立了几种化学诱导的小鼠AAA模型，包括弹性蛋白酶孵育，CaPO4孵育和皮下AngII灌注2。通常，弹性蛋白酶和CaPO4模型已在8-10周龄雄性野生型小鼠中进行，AngII模型已在高脂血症小鼠（如ApoE-/-和LDLR-/-小鼠）或5-6个月大的小鼠中进行，以诱导AAA13。这三种模型都表型了人类AAA的主要病理特征，包括弹性纤维降解和免疫细胞浸润。与其他两种型号相比，CaPO4 的应用导致手术后 7 天主动脉快速扩张超过 1.5 倍，与弹性蛋白显着降解和钙沉积有关4。CaPO4 模型诱导肾下腹主动脉梭形扩张，类似于人类 AAA 状况，而 AngII 灌注诱导肾上 AAA 和胸主动脉瘤。考虑到弹性蛋白酶、AngII和渗透微型泵的成本，执行CaPO4模型更具成本效益。然而，可以公平地说，CaPO4模型不能诱导AAA特征，例如壁血栓形成和主动脉破裂，并且该模型快速，因此不太适合使用现有的AAA进行干预研究。CaPO4模型非常适合与转基因小鼠合作，以评估对AAA发育的易感性。
CaPO4诱导的AAA形成的机制尚未完全阐明。先前的研究暗示，钙离子可能直接与主要动脉结构成分弹性蛋白和胶原蛋白结合，促进细胞外基质降解并降低血管壁稳定性14。CaPO4 晶体也被鉴定为触发显着的 NOD 样受体蛋白 3 （NLRP3） 炎症小体活化和平滑肌细胞凋亡4，15。此外，微钙化晶体能够诱导单核细胞进入破骨细胞样细胞并促进基质金属蛋白酶（MMP）的产生，并最终可能导致主动脉扩张16。
执行 CaPO4 模型时，必须避免几个问题以提高成功率。应避免撕裂背支血管，避免将过量的CaCl2 溶液添加到腹腔中，并避免过量麻醉。手术期间严重出血或术后感染的小鼠应排除在实验之外。如前所述，当观测值数量足够时，CaPO4 模型中主动脉的最大直径通常是正态分布的，这与AngII模型7不同。因此，我们建议在使用CaPO4 模型时比较主动脉的最大直径而不是AAA入射。
总体而言，CaPO4诱导的小鼠AAA模型是一种快速且具有成本效益的方法，可以探索AAA的分子机制和治疗策略，可以与其他模型并行应用以完全模仿人类AAA的特征。
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Acknowledgments
这项研究得到了中国国家自然科学基金（NSFC，81730010，91839302，81921001，31930056和91529203）和国家重点研发计划（2019YFA 0801600）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
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