Summary
Bu protokol, AAA'ların patolojik özelliklerini ve moleküler mekanizmalarını incelemek için kalsiyum fosfata bağlı abdominal aort anevrizması (AAA) fare modelini tanımlamaktadır.
Abstract
Abdominal aort anevrizması (AAA), tüm dünyada görülen, hayatı tehdit eden ve abdominal aortun geri dönüşümsüz genişlemesi ile karakterize kardiyovasküler bir hastalıktır. Günümüzde, her biri AAA'nın patogenezinin farklı bir yönünü simüle eden çeşitli kimyasal olarak indüklenmiş murin AAA modelleri kullanılmaktadır. Kalsiyum fosfat kaynaklı AAA modeli, anjiyotensin II ve elastaz kaynaklı AAA modellerine kıyasla hızlı ve uygun maliyetli bir modeldir. CaPO4 kristallerinin fare aortuna uygulanması, elastik lif yıkımı, düz kas hücrelerinin kaybı, iltihaplanma ve aort dilatasyonu ile ilişkili kalsiyum birikimi ile sonuçlanır. Bu makalede, CaPO4 kaynaklı AAA modeli için standart bir protokol tanıtılmaktadır. Protokol, materyal hazırlamayı, CaPO4'ün infrarenal abdominal aortun adventitisine cerrahi olarak uygulanmasını, aort anevrizmalarını görselleştirmek için aortların toplanmasını ve farelerde histolojik analizleri içerir.
Introduction
Abdominal aort anevrizması (AAA), abdominal aortun kalıcı genişlemesi ile karakterize, rüptür meydana geldiğinde yüksek mortalite oranları olan ölümcül bir kardiyovasküler hastalıktır. AAA yaşlanma, sigara içme, erkek cinsiyet, hipertansiyon ve hiperlipidemi ile ilişkilidir1. Hücre dışı matriks lif proteolizi, immün hücre infiltrasyonu ve vasküler düz kas hücrelerinin kaybı dahil olmak üzere çeşitli patolojik süreçlerin AAA oluşumuna katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Şu anda, AAA'nın patolojik mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır ve AAA1'in tedavisi için kanıtlanmış bir ilaç yoktur. İnsan AAA'sı üzerine yapılan araştırmalar, az sayıda insan aort örneğinin varlığı nedeniyle sınırlıdır; Bu nedenle, subkutan anjiyotensin II (AngII) infüzyonu, perivasküler veya intraluminal elastaz inkübasyonu ve perivasküler kalsiyum fosfat uygulaması2 dahil olmak üzere çeşitli kimyasal modifikasyona bağlı hayvan AAA modelleri kurulmuş ve yaygın olarak benimsenmiştir. Yaygın olarak kullanılan bir fare modeli, infrarenal abdominal aortun adventitisine kalsiyum fosfatın (CaPO4) uygulanmasıdır, bu da uygun maliyetlidir ve genetik modifikasyon gerektirmez.
Anevrizmal değişikliği indüklemek için tavşanların karotis arterine CaCl2'nin doğrudan periaort uygulaması başlangıçta Gertz ve ark.3 tarafından bildirilmiş ve daha sonra farelerin abdominal aortlarına uygulanmıştır. Model, farelerde CaPO 4 kristalleri kullanılarak aort genişlemesini hızlandırmak için Yamanouchi ve ark.tarafından geliştirilmiştir4. CaPO4'ün farelerin aortlarına infiltrasyonu, derin makrofaj infiltrasyonu, hücre dışı matriks yıkımı ve kalsiyum birikimi dahil olmak üzere insan AAA'larında gözlenen birçok patolojik özelliği özetler. Hiperlipidemi gibi insan AAA'sının risk faktörleri, farelerde CaPO4 kaynaklı AAA'yı da arttırır5. ApoE-/- veya LDLR-/- farelerde AngII perfüzyona bağlı AAA'nın aksine, CaPO4 kaynaklı AAA, insan AAA'sını taklit eden infrarenal aort bölgesinde meydana gelir. Günümüzde bu yöntem, genetiği değiştirilmiş farelerde AAA gelişimine duyarlılığı değerlendirmek ve ilaçların anti-AAA etkilerini değerlendirmek için yaygın olarak uygulanmaktadır 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları, Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Pekin Üniversitesi Biyomedikal Etik Kurulu (LA2015142) tarafından onaylanmıştır. Ameliyat için tüm fareler izofluran (% 1.5 -% 2) ile uyuşturuldu ve fareler için ağrı veya rahatsızlıktan kaçınmak için anestezi dikkatle izlendi.
1. Hazırlık
- 0,3 cm genişliğinde pudrasız lastik eldiven ve gazlı bez şeritlerini kesin.
- 8-10 haftalık C57BL/6J erkek fareleri satın alın. Hayvanları, 12 saatlik açık-karanlık döngüsünün yanı sıra yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayan klimalı bir ortamda barındırın.
- Ameliyattan önce gazlı bez, pamuklu çubuklar, makas ve forsepsleri otoklav edin.
- Betadin,% 70 etanol ve antiseptik el yıkama elde edin.
- Bir maske, önlük ve steril eldivenler giyin.
2. Cerrahi prosedür
- Ameliyattan 2-4 saat önce çiğnenebilir karprofen tabletlerini (5 mg / kg doz) 8-10 haftalık bir C57BL / 6J fareye besleyin. Ardından, fareyi% 1,5 -% 2'lik bir akış hızında izofluran içeren bir indüksiyon odasına (206 mm x 210 mm x 140 mm) yerleştirin.
- Solunum gözle görülür şekilde yavaşlayana kadar fareyi yaklaşık 5 dakika izleyin. Ameliyattan önce farenin ağrı stimülasyonuna yanıt vermediğinden emin olun.
- Gözlere oftalmik bir merhem uygulayın ve bir ısıtma yastığı veya battaniye ile termal destek sağlayın. Cerrahi prosedür sırasında her 15 dakikada bir ayak parmağı tutamağı ile anestezi derinliğini onaylayın.
- Farenin karın kıllarını elektrikli kesme makinesi veya epilasyon kremi kullanarak tıraş edin. Tıraş edilen bölgeyi betadin ile sürünceme, ardından dairesel bir hareketle birkaç kez% 70 etanol ile silin. Steriliteyi korumak için eldivenleri değiştirin.
- Alt karın bölgesinde karın orta hattı boyunca ~ 1,5 cm'lik bir kesi yapmak için makas kullanın.
- İnfrarenal aort görünene kadar bağırsağı dikkatlice çıkarmak için normal salin ile nemlendirilmiş steril bir pamuklu çubuk kullanın.
- Bağ dokusunu ve yağını infrarenal aorttan yaklaşık 0.5 cm'lik bir kesit için diseke edin. Küçük damarları sırt tarafına not edin ve yırtılmaktan kaçının. Abdominal aortu abdominal ana venden ayırmaya gerek yoktur.
- Salin batırılmış kauçuk eldiven şeridinin bir parçasını abdominal aort ve abdominal ana venin altına yerleştirin. Fazla sıvıyı silmek için pamuklu çubukla temizleyin.
- İnfrarenal abdominal vaskülatürün adventitiasında 0,5 M CaCl2 ile ıslatılmış bir gazlı bez parçasını 10 dakika boyunca paketleyin. Sahte fare grubu için 0,5 M CaCl2'yi normal salin ile değiştirin.
- Gazlı bezi çıkarın ve aortun adventitiasında in situ CaPO4 kristalleri üretmek için 5 dakika boyunca PBS çözeltisi ile ıslatılmış başka bir gazlı bez parçası paketleyin.
- Kauçuk eldiven şeridini ve gazlı bezi dikkatlice çıkarın. Farenin bağırsak sistemini sıfırlayın.
- Karın kesisini ve cildi 5-0 dikişle dikin.
- Fare bilincini yeniden kazanana kadar fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Yerel hayvan etik komitesine göre, ameliyat sonrası ağrı iyileşme konutu ve analjezi sağlayın.
- Fareyi 14 gün daha bekletin. Ameliyattan sonra fareyi yakından izleyin ve daha sonra her gün en az 1 kat gözlemleyin. Bu dönemde herhangi bir fare ölürse hemen bir nekropsi yapın.
3. Aortların görüntülenmesi için hasat
- Ameliyattan 14 gün sonra, CO 2 kullanarak fareleri fedaedin.
- Fare torasik ve abdominal boşluklarını ventralal olarak kesin ve sağ atriyumu açın.
- Aorttaki kanı çıkarmak için PBS tamponu ile fareleri kalbin sol ventrikülünden geçirin ve daha sonra daha önce tarif edildiği gibi% 4 paraformaldehit ile perfüzeedin 8.
- Aortu stereoskop altında hasat edin.
- Hasat edilen aortları 48 saat boyunca 5 mL% 4 paraformaldehit içeren tüplere yerleştirin.
- Adventitial dokuyu ve yağları stereoskop altında dikkatlice çıkarın ve aortu böcek iğneleriyle siyah bir balmumu plakasına sabitleyin.
- Aort görüntüleri elde edin.
4. Elastik liflerin parçalanmasının değerlendirilmesi
- Aort anevrizması dokularını seri kriyozitler halinde (7 μm kalınlığında) kesin.
- Elastik elyafları, üreticinin protokolüne göre ticari bir elastik van Gieson (EVG) boyama kiti kullanarak analiz edin.
- Elastin bozunmasını derecelendirin. Sınıf 1: <% 25 bozulma; sınıf 2:% 25 ila% 50 bozulma; sınıf 3:% 50 ila% 75 bozulma; veya sınıf 4: >75% bozulma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CaPO4 uygulamasından 14 gün sonra, C57BL / 6J erkek fareleri ötenazi yapıldı ve aortları hasat edildi ve temizlendi. AAA oluşumunu görselleştirmek için aortların morfolojisi görüntülendi. Şekil 1A-B'de gösterildiği gibi, CaPO 4 uygulaması infrarenal abdominal aortun genişlemesine yol açmıştır. Histolojik olarak, CaPO4, elastin kırılmaları ile gösterildiği gibi, elastik liflerin dramatik bir şekilde bozulmasına neden olmuştur (Şekil 1C).
Şekil 1: 8 haftalık erkek C57BL/6J fareler,14 gün sonra hasat edilen salin (sahte) veya CaPO 4 ile tedavi edildi. (A) İnfrarenal abdominal aortun stereoskop altında temsili görüntüleri. (B) Farelerden gelen aortların temsili morfoloji görüntüleri; ölçek çubuğu = 1 mm. (C) Aortların elastik van Gieson boyamasının temsili görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CaPO4'ün periaortik uygulaması, farelerde AAA'yı indüklemek için sağlam bir yaklaşımdır. Birkaç çalışma CaPO4 modelini kullanmış ve sürekli olarak bunun farelerde AAA'yı incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu bildirmiştir 7,9. Bu modelin insan aort anevrizmasının özelliklerinin bir kısmını özetlediği ve inflamasyon ve hücre dışı matriks yıkımı da dahil olmak üzere AAA patogenezi hakkında mekanik bilgiler sağladığı düşünülmektedir.
İnsan AAA'sının risk faktörleri başlıca yaşlanma, erkek cinsiyet, sigara, hiperlipidemi, hipertansiyon ve aterosklerozdur10. Sistematik olarak çalışılmamasına rağmen, hiperlipideminin CaPO4 modelini kullanırken fareleri AAA genişlemesine yatkın hale getirdiği bulunmuştur. İnsanlardan farklı olarak, yaşlanma fare CaPO4 model5'te AAA oluşumunda küçük bir rol oynar. Önceki büyük epidemiyolojik çalışmalar, diyabetin insan AAA11'in bağımsız bir negatif risk faktörü olduğunu göstermiştir. Bazı veriler diyabetik bir ilaç olan metforminin bu etkiye neden olduğunu öne sürerken, alternatif olarak CaPO4 modelinde hipergliseminin makrofaj aktivasyonunun baskılanması ile aort genişlemesini inhibe etmesi ilgi çekicidir12.
Şu anda, elastaz inkübasyonu, CaPO4 inkübasyonu ve subkutan AngII perfüzyonu2 dahil olmak üzere kimyasal olarak indüklenen birkaç murin AAA modeli kurulmuştur. Genel olarak, elastaz ve CaPO4 modelleri 8-10 haftalık erkek vahşi tip farelerde gerçekleştirilmiştir ve AngII modeli hiperlipidemi farelerde (ApoE / - ve LDLR / - fareler gibi) veya AAA13'ü indüklemek için 5-6 aylık farelerde gerçekleştirilmiştir. Her üç model de elastik lif yıkımı ve immün hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere insan AAA'sının ana patolojik özelliklerini fenokopyalar. Diğer iki modelle karşılaştırıldığında, CaPO 4 uygulaması, ameliyattan 7 gün sonra aortun hızlı ve 1.5 kattan fazla genişlemesine yol açarak, dramatik elastin yıkımı ve kalsiyum birikimi4 ile ilişkilidir. CaPO4 modeli, insan AAA durumunu taklit eden infrarenal abdominal aortta fusiform bir dilatasyona neden olurken, AngII perfüzyonu hem suprarenal AAA hem de torasik aort anevrizmasını indükler. Elastaz, AngII ve ozmotik mini pompanın maliyeti göz önüne alındığında, CaPO4 modelini gerçekleştirmek daha uygun maliyetlidir. Bununla birlikte, CaPO4 modelinin mural trombüs oluşumu ve aort rüptürü gibi AAA özelliklerini indükleyemediğini ve modelin hızlı olduğunu ve dolayısıyla mevcut AAA ile müdahale çalışmaları yapmak için daha az uygun olduğunu belirtmek doğru olur. CaPO4 modeli, AAA gelişimine duyarlılığı değerlendirmek için genetiği değiştirilmiş farelerle çalışmak için idealdir.
CaPO4 kaynaklı AAA oluşumunun altında yatan mekanizma henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Önceki çalışmalar, kalsiyum iyonunun ana arteriyel yapısal bileşenlere, elastin ve kollajene doğrudan bağlanabileceğini, hücre dışı matriks yıkımını kolaylaştırdığını ve damar duvarı stabilitesini azalttığını göstermektedir14. CaPO4 kristallerinin ayrıca önemli NOD benzeri reseptör proteini 3 (NLRP3) enflamatuar aktivasyonunu ve düz kas hücresi apoptozu 4,15'i tetiklediği tespit edilmiştir. Ayrıca, mikrokalsifikasyon kristalleri, mononükleer hücreleri osteoklast benzeri hücrelere indükleyebilir ve matris metalloproteinaz (MMP) üretimini teşvik edebilir ve sonuçta aort genişlemesine neden olabilir16.
CaPO4 modelini gerçekleştirirken, başarı oranını artırmak için çeşitli sorunlardan kaçınılmalıdır. Dorsal dal kan damarlarının yırtılmasından kaçınılmalı, karın boşluğuna fazla CaCl2 çözeltisinin eklenmesinden kaçınılmalı ve aşırı dozda anesteziden kaçınılmalıdır. Ameliyat sırasında şiddetli kanaması olan veya postoperatif enfeksiyonu olan fareler deneyden çıkarılmalıdır. Daha önce bildirildiği gibi, gözlemlerin sayısı yeterli olduğunda, CaPO4 modelindeki aortların maksimum çapları genellikle AngII model7'den farklı olarak normal olarak dağıtılır. Bu nedenle, CaPO4 modelini kullanırken AAA insidansı yerine aortların maksimum çaplarının karşılaştırılmasını öneririz.
Genel olarak, CaPO4 kaynaklı fareler AAA modeli, AAA'nın moleküler mekanizmalarını ve terapötik stratejilerini araştırmak için hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır ve insan AAA'sının özelliklerini tam olarak taklit etmek için diğer modellere paralel olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 ve 91529203) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2019YFA 0801600) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
- Kent, K. C. Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371, 2101-2108 (2014).
- Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
- Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
- Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
- Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
- Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
- Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21 (2022).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Yu, B., et al. CYLD deubiquitinates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 contributing to adventitial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1698-1709 (2017).
- Altobelli, E., Rapacchietta, L., Profeta, V. F., Fagnano, R. Risk factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2805 (2018).
- Theivacumar, N. S., Stephenson, M. A., Mistry, H., Valenti, D. Diabetes mellitus and aortic aneurysm rupture: A favorable association. Vascular and Endovascular Surgery. 48 (1), 45-50 (2014).
- Tanaka, T., Takei, Y., Yamanouchi, D. Hyperglycemia suppresses calcium phosphate-induced aneurysm formation through inhibition of macrophage activation. Journal of the American Heart Association. 5 (3), 003062 (2016).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Urry, D. W. Neutral sites for calcium ion binding to elastin and collagen: A charge neutralization theory for calcification and its relationship to atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (4), 810-814 (1971).
- Li, Z. Q., et al. Runx2 (runt-related transcription factor 2)-mediated microcalcification is a novel pathological characteristic and potential mediator of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (5), 1352-1369 (2020).
- Kelly, M. J., Igari, K., Yamanouchi, D. Osteoclast-like cells in aneurysmal disease exhibit an enhanced proteolytic phenotype. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4689 (2019).
