Summary
Este protocolo descreve um modelo de rato com aneurisma da aorta abdominal induzido por fosfato de cálcio (AAA) para estudar as características patológicas e os mecanismos moleculares dos AAAs.
Abstract
Um aneurisma da aorta abdominal (AAA) é uma doença cardiovascular com risco de vida que ocorre em todo o mundo e é caracterizada por dilatação irreversível da aorta abdominal. Atualmente, vários modelos de AAA murino quimicamente induzidos são usados, cada um simulando um aspecto diferente da patogênese do AAA. O modelo AAA induzido por fosfato de cálcio é um modelo rápido e custo-efetivo em comparação com os modelos AAA induzidos por angiotensina II e elastase. A aplicação de cristais de CaPO4 na aorta do rato resulta em degradação de fibras elásticas, perda de células musculares lisas, inflamação e deposição de cálcio associada à dilatação da aorta. Este artigo apresenta um protocolo padrão para o modelo AAA induzido por CaPO4. O protocolo inclui o preparo do material, a aplicação cirúrgica do CaPO4 na adventícia da aorta abdominal infrarrenal, a colheita de aortas para visualização de aneurismas da aorta e análises histológicas em camundongos.
Introduction
Um aneurisma da aorta abdominal (AAA) é uma doença cardiovascular letal caracterizada por dilatação permanente da aorta abdominal, com altas taxas de mortalidade uma vez que ocorre a ruptura. O AAA está associado ao envelhecimento, tabagismo, sexo masculino, hipertensão arterial e hiperlipidemia1. Vários processos patológicos demonstraram contribuir para a formação de AAA, incluindo proteólise de fibra de matriz extracelular, infiltração de células imunes e perda de células musculares lisas vasculares. Atualmente, os mecanismos patológicos do AAA permanecem elusivos, e não há medicamentos comprovados para o tratamento do AAA1. A pesquisa em AAA humano é limitada devido à existência de poucas amostras de aorta humana; assim, vários modelos de AAA animal induzidos por modificação química foram estabelecidos e amplamente adotados, incluindo infusão subcutânea de angiotensina II (AngII), incubação de elastase perivascular ou intraluminal e aplicação de fosfato de cálcio perivascular2. Um modelo de camundongo comumente utilizado é a aplicação de fosfato de cálcio (CaPO4) na adventícia da aorta abdominal infrarrenal, que é custo-efetiva e não requer modificação genética.
A aplicação direta de CaCl2 na artéria carótida de coelhos para induzir alteração aneurismática foi inicialmente relatada por Gertz et al.3 e posteriormente aplicada nas aortas abdominais de camundongos. O modelo foi desenvolvido por Yamanouchi et al. para acelerar a dilatação da aorta utilizando cristais CaPO 4 em camundongos4. A infiltração de CaPO4 em aortas de camundongos recapitula muitas características patológicas observadas em AAAs humanos, incluindo infiltração profunda de macrófagos, degradação da matriz extracelular e deposição de cálcio. Os fatores de risco do AAA humano, como a hiperlipidemia, também aumentam o AAA induzido por CaPO4 em camundongos5. Em contraste com o AAA induzido por perfusão AngII em camundongos ApoE-/- ou LDLR-/-, o AAA induzido por CaPO 4 ocorre na região aórtica infrarrenal, que imita o AAA humano. Atualmente, esse método tem sido amplamente aplicado para avaliar a suscetibilidade ao desenvolvimento de AAA em camundongos geneticamente modificados e avaliar os efeitos anti-AAA de fármacos 6,7.
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Protocol
Os estudos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim e foram aprovados pelo Comitê de Ética Biomédica da Universidade de Pequim (LA2015142). Todos os camundongos para cirurgia foram anestesiados com isoflurano (1,5%-2%), e a anestesia foi cuidadosamente monitorada para evitar dor ou desconforto para os camundongos.
1. Preparação
- Corte tiras de 0,3 cm de largura de luvas de borracha e gaze sem pó.
- Compre ratos machos C57BL/6J de 8-10 semanas de idade. Abrigar os animais em um ambiente climatizado com um ciclo claro-escuro de 12 horas e livre acesso a comida e água.
- Autoclave a gaze, cotonetes, tesouras e fórceps antes da cirurgia.
- Obtenha betadina, etanol a 70% e lavagem antisséptica das mãos.
- Coloque uma máscara, avental e luvas estéreis.
2. Procedimento cirúrgico
- Alimentar comprimidos de carprofeno mastigável (dose de 5 mg/kg) a um rato C57BL/6J de 8-10 semanas de idade 2-4 h antes da cirurgia. Em seguida, coloque o rato numa câmara de indução (206 mm x 210 mm x 140 mm) com isoflurano a um caudal de 1,5%-2%.
- Monitore o mouse por cerca de 5 minutos até que a respiração esteja visivelmente mais lenta. Certifique-se de que o rato não tem resposta à estimulação da dor antes da cirurgia.
- Aplique uma pomada oftálmica nos olhos e forneça suporte térmico com uma almofada de aquecimento ou cobertor. Confirme a profundidade da anestesia com uma pitada no dedo do pé a cada 15 minutos durante o procedimento cirúrgico.
- Raspe os pelos abdominais do rato usando um cortador elétrico ou creme de depilação. Esfregue e limpe a área raspada com betadine, seguida de etanol a 70%, várias vezes em movimento circular. Troque as luvas para manter a esterilidade.
- Use uma tesoura para fazer uma incisão de ~ 1,5 cm no abdômen inferior ao longo da linha média do abdômen.
- Use um cotonete estéril umedecido com solução salina normal para remover cuidadosamente o intestino até que a aorta infrarrenal esteja visível.
- Dissecar o tecido conjuntivo e a gordura da aorta infrarrenal por uma seção de aproximadamente 0,5 cm. Observe os pequenos vasos para o lado dorsal e evite rasgá-los. Não há necessidade de separar a aorta abdominal da veia principal abdominal.
- Embale um pedaço da tira de luva de borracha embebida em solução salina sob a aorta abdominal e a veia principal abdominal. Use um cotonete para limpar o excesso de líquido.
- Embale um pedaço de gaze embebido com CaCl2 0,5 M na adventícia da vasculatura abdominal infrarrenal por 10 min. Para o grupo de camundongos simulados, substitua o CaCl2 0,5 M por solução salina normal.
- Retire a gaze e embale outro pedaço de gaze embebido com solução de PBS por 5 min para gerar cristais de CaPO4 in situ na adventícia da aorta.
- Retire cuidadosamente a tira de luva de borracha e a gaze. Redefina o trato intestinal do rato.
- Suture a incisão abdominal e a pele com uma sutura 5-0.
- Coloque o rato numa almofada de aquecimento até que o rato recupere a consciência. Fornecer alojamento de recuperação da dor pós-cirúrgica e analgesia, de acordo com o comitê de ética animal local.
- Abrigue o mouse por mais 14 dias. Monitore o rato de perto após a cirurgia e observe pelo menos 1x todos os dias posteriormente. Realize uma necropsia imediatamente se algum rato morrer durante este período.
3. Colheita para imagem de aortas
- 14 dias após a cirurgia, sacrifique os ratos usando CO2.
- Abra as cavidades torácica e abdominal do rato ventralmente e abra o átrio direito.
- Perfundir os camundongos com tampão PBS através do ventrículo esquerdo do coração para remover o sangue na aorta e, em seguida, perfundir com paraformaldeído a 4%, conforme descrito anteriormente8.
- Colha a aorta sob o estereoscópio.
- Colocar as aortas colhidas em tubos contendo 5 mL de paraformaldeído a 4% por 48 h.
- Remova o tecido adventício e a gordura cuidadosamente sob o estereoscópio e prenda a aorta em uma placa de cera preta com agulhas de insetos.
- Adquira imagens da aorta.
4. Avaliação da degradação das fibras elásticas
- Corte os tecidos do aneurisma da aorta em criosecções seriadas (7 μm de espessura).
- Analise as fibras elásticas usando um kit de coloração elástica comercial van Gieson (EVG) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Classifique a degradação da elastina. Grau 1: <25% de degradação; grau 2: 25% a 50% de degradação; grau 3: 50% a 75% de degradação; ou grau 4: >75% de degradação.
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Representative Results
14 dias após a aplicação do CaPO4, os camundongos machos C57BL/6J foram sacrificados e suas aortas foram colhidas e limpas. A morfologia das aortas foi fotografada para visualizar a formação de AAA. Como mostra a Figura 1A-B, a aplicação do CaPO4 levou à dilatação da aorta abdominal infrarrenal. Histologicamente, o CaPO4 resultou em uma degradação dramática das fibras elásticas, como ilustrado pelas quebras de elastina (Figura 1C).
Figura 1: Os camundongos machos C57BL/6J de 8 semanas de idade foram tratados com soro fisiológico (sham) ou CaPO4 colhidos após 14 dias. (A) Imagens representativas da aorta abdominal infrarrenal sob estereoscópio. (B) Imagens morfológicas representativas de aortas de camundongos; barra de escala = 1 mm. (C) Imagens representativas da coloração elástica de van Gieson de aortas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A aplicação periaórtica de CaPO4 é uma abordagem robusta para induzir AAA em camundongos. Vários estudos têm utilizado o modelo CaPO4 e consistentemente relatado que este é um método rápido e reprodutível para estudar AAA em camundongos 7,9. Este modelo é considerado para recapitular parte das características do aneurisma da aorta humana e fornecer insights mecanicistas sobre a patogênese AAA, incluindo inflamação e degradação da matriz extracelular.
Os fatores de risco do AAA humano incluem principalmente envelhecimento, sexo masculino, tabagismo, hiperlipidemia, hipertensão e aterosclerose10. Embora não tenha sido estudada sistematicamente, a hiperlipidemia também predispõe os camundongos à expansão AAA ao usar o modelo CaPO4 . Ao contrário dos seres humanos, o envelhecimento desempenha um papel menor na formação de AAA no rato CaPO4 modelo5. Grandes estudos epidemiológicos anteriores mostraram que o diabetes é um fator de risco negativo independente de AAA humano11. Embora alguns dados sugiram que a metformina, uma droga diabética, cause esse efeito, alternativamente é interessante que, no modelo CaPO4 , a hiperglicemia inibe a dilatação da aorta pela supressão da ativação de macrófagos12.
Atualmente, vários modelos de AAA murino quimicamente induzidos foram estabelecidos, incluindo incubação de elastase, incubação CaPO4 e perfusão subcutânea de AngII2. Geralmente, os modelos elastase e CaPO4 foram realizados em camundongos machos do tipo selvagem de 8-10 semanas de idade, e o modelo AngII foi realizado em camundongos com hiperlipidemia (como camundongos ApoE-/- e LDLR-/-) ou camundongos de 5-6 meses de idade para induzir AAA13. Todos os três modelos fenocopiam as principais características patológicas do AAA humano, incluindo a degradação da fibra elástica e a infiltração de células imunes. Em comparação com os outros dois modelos, a aplicação do CaPO 4 leva a uma expansão rápida e superior a 1,5 vezes da aorta 7 dias após a cirurgia, associada à degradação dramática da elastina e à deposição de cálcio4. O modelo CaPO4 induz uma dilatação fusiforme na aorta abdominal infrarrenal, que imita a condição AAA humana, enquanto a perfusão AngII induz AAA suprarrenal e aneurisma da aorta torácica. Considerando o custo da elastase, AngII e da minibomba osmótica, é mais econômico executar o modelo CaPO4. No entanto, é justo afirmar que o modelo CaPO4 não pode induzir características de AAA, como formação de trombos murais e ruptura da aorta, e o modelo é rápido e, portanto, menos adequado para a realização de estudos de intervenção com AAA existente. O modelo CaPO4 é ideal para trabalhar com camundongos geneticamente modificados para avaliar a suscetibilidade ao desenvolvimento de AAA.
O mecanismo subjacente à formação de AAA induzida por CaPO4 ainda não foi totalmente elucidado. Estudos prévios sugerem que o íon cálcio pode se ligar diretamente aos principais componentes estruturais arteriais, elastina e colágeno, facilitando a degradação da matriz extracelular e diminuindo a estabilidade da parede do vaso14. Os cristais de CaPO 4 também foram identificados como desencadeadores significativos de ativação significativa do inflamassoma da proteína 3 do receptor NOD (NLRP3) e apoptose de células musculares lisas 4,15. Além disso, os cristais de microcalcificação são capazes de induzir células mononucleares em células semelhantes a osteoclastos e promover a produção de metaloproteinase de matriz (MMP), podendo, em última análise, resultar em expansão aórtica16.
Ao executar o modelo CaPO4 , vários problemas devem ser evitados para melhorar a taxa de sucesso. Deve-se evitar rasgar os vasos sanguíneos do ramo dorsal, evitar a adição de excesso de solução de CaCl2 na cavidade abdominal e evitar uma overdose de anestesia. Camundongos com sangramento grave durante a cirurgia ou com infecção pós-operatória devem ser excluídos do experimento. Como relatado anteriormente, quando o número de observações é suficiente, os diâmetros máximos das aortas no modelo CaPO4 são geralmente normalmente distribuídos, o que é diferente do modelo AngII7. Portanto, recomenda-se uma comparação dos diâmetros máximos das aortas em vez da incidência de AAA ao usar o modelo CaPO4 .
No geral, o modelo AAA de camundongos induzidos por CaPO4 é uma abordagem rápida e econômica para explorar os mecanismos moleculares e as estratégias terapêuticas do AAA e pode ser aplicado em paralelo com os outros modelos para imitar totalmente as características do AAA humano.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 e 91529203) e do Programa Nacional de P & D de Chaves da China (2019YFA 0801600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
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