Summary
Este protocolo describe un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal (AAA) inducido por fosfato de calcio para estudiar las características patológicas y los mecanismos moleculares de los AAA.
Abstract
Un aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una enfermedad cardiovascular potencialmente mortal que ocurre en todo el mundo y se caracteriza por una dilatación irreversible de la aorta abdominal. Actualmente, se utilizan varios modelos murinos AAA inducidos químicamente, cada uno simulando un aspecto diferente de la patogénesis de AAA. El modelo AAA inducido por fosfato de calcio es un modelo rápido y rentable en comparación con los modelos AAA inducidos por angiotensina II y elastasa. La aplicación de cristales de CaPO4 a la aorta del ratón da como resultado la degradación de la fibra elástica, la pérdida de células musculares lisas, la inflamación y la deposición de calcio asociada con la dilatación aórtica. Este artículo presenta un protocolo estándar para el modelo AAA inducido por CaPO4. El protocolo incluye la preparación de materiales, la aplicación quirúrgica del CaPO4 a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal, la recolección de aortas para visualizar aneurismas aórticos y análisis histológicos en ratones.
Introduction
Un aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una enfermedad cardiovascular letal caracterizada por la dilatación permanente de la aorta abdominal, con altas tasas de mortalidad una vez que se produce la ruptura. El AAA se asocia con el envejecimiento, el tabaquismo, el sexo masculino, la hipertensión y la hiperlipidemia1. Se ha demostrado que varios procesos patológicos contribuyen a la formación de AAA, incluida la proteólisis de fibras de la matriz extracelular, la infiltración de células inmunes y la pérdida de células del músculo liso vascular. Actualmente, los mecanismos patológicos de AAA siguen siendo difíciles de alcanzar, y no hay medicamentos probados para el tratamiento de AAA1. La investigación sobre AAA humanos es limitada debido a la existencia de pocas muestras de aorta humana; por lo tanto, se han establecido y adoptado ampliamente varios modelos animales AAA inducidos por modificación química, incluida la infusión subcutánea de angiotensina II (AngII), la incubación de elastasa perivascular o intraluminal y la aplicación de fosfato de calcio perivascular2. Un modelo de ratón comúnmente utilizado es la aplicación de fosfato de calcio (CaPO4) a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal, que es rentable y no requiere modificación genética.
La aplicación periaórtica directa de CaCl2 a la arteria carótida de conejos para inducir un cambio aneurismático fue reportada inicialmente por Gertz et al.3 y posteriormente se aplicó a las aortas abdominales de ratones. El modelo fue desarrollado por Yamanouchi et al. para acelerar la dilatación aórtica mediante el uso de cristales de CaPO 4 en ratones4. La infiltración de CaPO4 en aortas de ratones recapitula muchas características patológicas observadas en AAA humanos, incluida la infiltración profunda de macrófagos, la degradación de la matriz extracelular y la deposición de calcio. Los factores de riesgo del AAA humano, como la hiperlipidemia, también aumentan el AAA inducido por CaPO4 en ratones5. En contraste con el AAA inducido por perfusión AngII en ratones ApoE-/- o LDLR-/-, el AAA inducido por CaPO4 ocurre en la región aórtica infrarrenal, que imita el AAA humano. Actualmente, este método ha sido ampliamente aplicado para evaluar la susceptibilidad al desarrollo de AAA en ratones modificados genéticamente y evaluar los efectos anti-AAA de los fármacos 6,7.
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Protocol
Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín y fueron aprobados por el Comité de Ética Biomédica de la Universidad de Pekín (LA2015142). Todos los ratones para cirugía fueron anestesiados con isoflurano (1,5%-2%), y la anestesia fue monitoreada cuidadosamente para evitar dolor o molestias para los ratones.
1. Preparación
- Corte tiras de 0,3 cm de ancho de guantes de goma sin polvo y gasa.
- Compre ratones machos C57BL / 6J de 8-10 semanas de edad. Aloje a los animales en un ambiente climatizado con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso gratuito a alimentos y agua.
- Autoclave la gasa, hisopos de algodón, tijeras y fórceps antes de la cirugía.
- Obtenga betadina, etanol al 70% y lavado de manos antiséptico.
- Póngase una máscara, bata y guantes estériles.
2. Procedimiento quirúrgico
- Alimente con tabletas masticables de carprofeno (dosis de 5 mg / kg) a un ratón C57BL / 6J de 8-10 semanas de edad 2-4 h antes de la cirugía. Luego, coloque el ratón en una cámara de inducción (206 mm x 210 mm x 140 mm) con isoflurano a un caudal de 1.5% -2%.
- Controle al ratón durante unos 5 minutos hasta que la respiración disminuya visiblemente. Asegúrese de que el ratón no tenga respuesta a la estimulación del dolor antes de la cirugía.
- Aplique un ungüento oftálmico en los ojos y proporcione soporte térmico con una almohadilla térmica o una manta. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie cada 15 minutos durante el procedimiento quirúrgico.
- Afeite el vello abdominal del ratón con una cortadora eléctrica o crema depilatoria. Frote y limpie el área afeitada con betadina, seguida de etanol al 70%, varias veces con movimientos circulares. Cámbiese los guantes para mantener la esterilidad.
- Use tijeras para hacer una incisión de ~ 1.5 cm en la parte inferior del abdomen a lo largo de la línea media del abdomen.
- Use un hisopo de algodón estéril humedecido con solución salina normal para extraer cuidadosamente el intestino hasta que la aorta infrarrenal sea visible.
- Diseccionar el tejido conectivo y la grasa de la aorta infrarrenal durante una sección de aproximadamente 0,5 cm. Tenga en cuenta los pequeños vasos en el lado dorsal y evite rasgarlos. No hay necesidad de separar la aorta abdominal de la vena principal abdominal.
- Empaque un pedazo de la tira de guante de goma empapada en solución salina debajo de la aorta abdominal y la vena principal abdominal. Use un hisopo de algodón para limpiar el exceso de líquido.
- Empaque un trozo de gasa empapado con CaCl2 0.5 M en la adventicia de la vasculatura abdominal infrarrenal durante 10 min. Para el grupo de ratones simulados, sustituya el CaCl2 de 0,5 M por solución salina normal.
- Retire la gasa y empaque otra pieza de gasa empapada con solución de PBS durante 5 min para generar cristales de CaPO4 in situ en la adventicia de la aorta.
- Retire con cuidado la tira del guante de goma y la gasa. Restablezca el tracto intestinal del ratón.
- Suturar la incisión abdominal y la piel con una sutura 5-0.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica hasta que el ratón recupere la conciencia. Proporcionar alojamiento de recuperación del dolor postquirúrgico y analgesia, de acuerdo con el comité local de ética animal.
- Aloja el ratón durante otros 14 días. Controle al ratón de cerca después de la cirugía y observe al menos 1 vez al día posteriormente. Realice una necropsia inmediatamente si algún ratón muere durante este período.
3. Recolección para imágenes de aortas
- 14 días después de la cirugía, sacrifique a los ratones usandoCO2.
- Abra las cavidades torácica y abdominal del ratón ventralmente y abra la aurícula derecha.
- Perfundir los ratones con tampón PBS a través del ventrículo izquierdo del corazón para eliminar la sangre en la aorta, y luego perfundir con paraformaldehído al 4% como se describió anteriormente8.
- Cosecha la aorta bajo el estereoscopio.
- Coloque las aortas cosechadas en tubos que contengan 5 ml de paraformaldehído al 4% durante 48 h.
- Retire el tejido adventicio y la grasa con cuidado debajo del estereoscopio y fije la aorta en una placa de cera negra con agujas para insectos.
- Adquirir imágenes aórticas.
4. Evaluación de la degradación de las fibras elásticas
- Cortar los tejidos del aneurisma aórtico en criosecciones seriadas (7 μm de espesor).
- Analice las fibras elásticas utilizando un kit de tinción elástico comercial van Gieson (EVG) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Grado de degradación de elastina. Grado 1: degradación del <25%; grado 2: degradación del 25% al 50%; grado 3: 50% a 75% de degradación; o grado 4: >75% de degradación.
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Representative Results
14 días después de la aplicación de CaPO4, los ratones machos C57BL / 6J fueron sacrificados, y sus aortas fueron cosechadas y limpiadas. Se obtuvo una imagen de la morfología de las aortas para visualizar la formación de AAA. Como se muestra en la Figura 1A-B, la aplicación de CaPO4 condujo a la dilatación de la aorta abdominal infrarrenal. Histológicamente, CaPO4 resultó en una degradación dramática de las fibras elásticas, como lo ilustran las roturas de elastina (Figura 1C).
Figura 1: Los ratones machos C57BL / 6J de 8 semanas de edad fueron tratados con solución salina (simulada) o CaPO4 cosechada después de 14 días. (A) Imágenes representativas de la aorta abdominal infrarrenal bajo un estereoscopio. (B) imágenes morfológicas representativas de aortas de ratones; barra de escala = 1 mm. (C) Imágenes representativas de la tinción elástica de van Gieson de las aortas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La aplicación periártica de CaPO4 es un enfoque robusto para inducir AAA en ratones. Varios estudios han utilizado el modelo CaPO4 y consistentemente informaron que este es un método rápido y reproducible para estudiar AAA en ratones 7,9. Se considera que este modelo recapitula parte de las características del aneurisma aórtico humano y proporciona información mecanicista sobre la patogénesis AAA, incluida la inflamación y la degradación de la matriz extracelular.
Los factores de riesgo del AAA humano incluyen principalmente el envejecimiento, el sexo masculino, el tabaquismo, la hiperlipidemia, la hipertensión y la aterosclerosis10. Aunque no se estudió sistemáticamente, también se encontró que la hiperlipidemia predispone a los ratones a la expansión AAA cuando se utiliza el modelo CaPO4 . A diferencia de los humanos, el envejecimiento juega un papel menor en la formación de AAA en el ratón CaPO4 modelo5. Grandes estudios epidemiológicos previos han demostrado que la diabetes es un factor de riesgo negativo independiente del AAA humano11. Mientras que algunos datos sugieren que la metformina, un medicamento para la diabetes, causa este efecto, alternativamente es de interés que, en el modelo CaPO4 , la hiperglucemia inhibe la dilatación aórtica por la supresión de la activación de macrófagos12.
Actualmente, se han establecido varios modelos de AAA murino inducidos químicamente, incluida la incubación de elastasa, la incubación de CaPO4 y la perfusión subcutánea de AngII2. En general, los modelos de elastasa y CaPO4 se han realizado en ratones machos de tipo salvaje de 8-10 semanas de edad, y el modelo AngII se ha realizado en ratones con hiperlipidemia (como ratones ApoE-/- y LDLR-/-) o ratones de 5-6 meses de edad para inducir AAA13. Los tres modelos fenocopian las principales características patológicas del AAA humano, incluida la degradación de la fibra elástica y la infiltración de células inmunes. En comparación con los otros dos modelos, la aplicación de CaPO 4 conduce a una expansión rápida y más de 1,5 veces de la aorta 7 días después de la cirugía, asociada con una degradación dramática de la elastina y la deposición de calcio4. El modelo CaPO4 induce una dilatación fusiforme en la aorta abdominal infrarrenal, que imita la condición humana AAA, mientras que la perfusión AngII induce tanto AAA suprarrenal como aneurisma aórtico torácico. Teniendo en cuenta el costo de la elastasa, AngII y la minibomba osmótica, es más rentable realizar el modelo CaPO4. Sin embargo, es justo afirmar que el modelo CaPO4 no puede inducir características AAA como la formación de trombos murales y la ruptura aórtica, y el modelo es rápido y, por lo tanto, menos adecuado para realizar estudios de intervención con AAA existente. El modelo CaPO4 es ideal para trabajar con ratones modificados genéticamente para evaluar la susceptibilidad al desarrollo de AAA.
El mecanismo subyacente a la formación de AAA inducida por CaPO4 aún no se ha dilucidado completamente. Estudios previos sugieren que el ion calcio puede unirse directamente a los principales componentes estructurales arteriales, elastina y colágeno, facilitando la degradación de la matriz extracelular y la disminución de la estabilidad de la pared del vaso14. También se han identificado cristales de CaPO 4 que desencadenan una activación inflamatoria significativa de la proteína receptora 3 similar a NOD (NLRP3) y la apoptosis de las células del músculo liso 4,15. Además, los cristales de microcalcificación son capaces de inducir células mononucleares en células similares a osteoclastos y promover la producción de metaloproteinasa de matriz (MMP) y, en última instancia, pueden resultar en expansión aórtica16.
Al realizar el modelo CaPO4 , se deben evitar varios problemas para mejorar la tasa de éxito. Se debe evitar el desgarro de los vasos sanguíneos de la rama dorsal, evitar la adición de exceso de solución de CaCl2 en la cavidad abdominal y evitar una sobredosis de anestesia. Los ratones con sangrado severo durante la cirugía o con infección postoperatoria deben ser excluidos del experimento. Como se informó anteriormente, cuando el número de observaciones es suficiente, los diámetros máximos de las aortas en el modelo CaPO4 generalmente se distribuyen normalmente, lo cual es diferente del modelo AngII7. Por lo tanto, recomendamos una comparación de los diámetros máximos de las aortas en lugar de la incidencia de AAA cuando se utiliza el modelo CaPO4 .
En general, el modelo AAA de ratones inducidos por CaPO4 es un enfoque rápido y rentable para explorar los mecanismos moleculares y las estrategias terapéuticas de AAA y podría aplicarse en paralelo con los otros modelos para imitar completamente las características del AAA humano.
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Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 y 91529203) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFA 0801600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
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