Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Bob A. Hersbach; Tatiana Simon; Giacomo Masserdotti

doi:10.3791/64175

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Articolo metodologico

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

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DOI:

10.3791/64175

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7 luglio 2022

Bob A. Hersbach¹^,²^,³ , Tatiana Simon² , Giacomo Masserdotti¹^,²

¹Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, ²Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, ³Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Abstract

La riprogrammazione neuronale diretta è un approccio potente per generare neuroni funzionali da diverse popolazioni di cellule starter senza passare attraverso intermedi multipotenti. Questa tecnica non solo ha grandi promesse nel campo della modellazione delle malattie, in quanto consente di convertire, ad esempio, i fibroblasti per i pazienti affetti da malattie neurodegenerative in neuroni, ma rappresenta anche un'alternativa promettente per le terapie sostitutive basate sulle cellule. In questo contesto, un importante passo avanti scientifico è stata la dimostrazione che le cellule non neurali differenziate all'interno del sistema nervoso centrale, come gli astrociti, potrebbero essere convertite in neuroni funzionali in vitro. Da allora, la riprogrammazione diretta in vitro degli astrociti in neuroni ha fornito informazioni sostanziali sui meccanismi molecolari alla base della conversione forzata dell'identità e sugli ostacoli che impediscono una riprogrammazione efficiente. Tuttavia, i risultati di esperimenti in vitro eseguiti in diversi laboratori sono difficili da confrontare a causa delle differenze nei metodi utilizzati per isolare, coltivare e riprogrammare gli astrociti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e coltivare in modo affidabile astrociti con elevata purezza da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi in età postnatale tramite selezione di cellule magnetiche. Inoltre, forniamo protocolli per riprogrammare astrociti coltivati in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del DNA. Questo protocollo semplificato e standardizzato può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base del mantenimento dell'identità cellulare, la creazione di una nuova identità neuronale, nonché la generazione di specifici sottotipi neuronali e le loro proprietà funzionali.

Introduzione

Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi è altamente complesso, costituito da centinaia di diversi tipi di cellule, tra cui un vasto numero di diversi sottotipi neuronali 1,2,3,4,5,6. A differenza di altri organi o tessuti ^7,8,9, il SNC dei mammiferi ha una capacità rigenerativa molto limitata; la perdita neuronale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche o neurodegeneraz....