Summary
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione.
Abstract
La riprogrammazione neuronale diretta è un approccio potente per generare neuroni funzionali da diverse popolazioni di cellule starter senza passare attraverso intermedi multipotenti. Questa tecnica non solo ha grandi promesse nel campo della modellazione delle malattie, in quanto consente di convertire, ad esempio, i fibroblasti per i pazienti affetti da malattie neurodegenerative in neuroni, ma rappresenta anche un'alternativa promettente per le terapie sostitutive basate sulle cellule. In questo contesto, un importante passo avanti scientifico è stata la dimostrazione che le cellule non neurali differenziate all'interno del sistema nervoso centrale, come gli astrociti, potrebbero essere convertite in neuroni funzionali in vitro. Da allora, la riprogrammazione diretta in vitro degli astrociti in neuroni ha fornito informazioni sostanziali sui meccanismi molecolari alla base della conversione forzata dell'identità e sugli ostacoli che impediscono una riprogrammazione efficiente. Tuttavia, i risultati di esperimenti in vitro eseguiti in diversi laboratori sono difficili da confrontare a causa delle differenze nei metodi utilizzati per isolare, coltivare e riprogrammare gli astrociti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e coltivare in modo affidabile astrociti con elevata purezza da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi in età postnatale tramite selezione di cellule magnetiche. Inoltre, forniamo protocolli per riprogrammare astrociti coltivati in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del DNA. Questo protocollo semplificato e standardizzato può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base del mantenimento dell'identità cellulare, la creazione di una nuova identità neuronale, nonché la generazione di specifici sottotipi neuronali e le loro proprietà funzionali.
Introduction
Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi è altamente complesso, costituito da centinaia di diversi tipi di cellule, tra cui un vasto numero di diversi sottotipi neuronali 1,2,3,4,5,6. A differenza di altri organi o tessuti 7,8,9, il SNC dei mammiferi ha una capacità rigenerativa molto limitata; la perdita neuronale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche o neurodegenerazione è irreversibile e spesso si traduce in deficit motori e cognitivi10. Con l'obiettivo di salvare le funzioni cerebrali, diverse strategie per sostituire i neuroni persi sono oggetto di intense indagini11. Tra questi, la riprogrammazione diretta delle cellule somatiche in neuroni funzionali sta emergendo come un approccio terapeutico promettente12. La riprogrammazione diretta, o transdifferenziazione, è il processo di conversione di un tipo di cellula differenziata in una nuova identità senza passare attraverso uno stato proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Pioniere dell'identificazione di MyoD1 come fattore sufficiente per convertire i fibroblasti in cellule muscolari17,18, questo metodo è stato applicato con successo per riprogrammare diversi tipi di cellule in neuroni funzionali 19,20,21.
Gli astrociti, la macroglia più abbondante nel SNC22,23, sono un tipo di cellula particolarmente promettente per la riprogrammazione neuronale diretta per diversi motivi. In primo luogo, sono ampiamente e uniformemente distribuiti attraverso il SNC, fornendo un'abbondante fonte in loco per i nuovi neuroni. In secondo luogo, gli astrociti e i neuroni sono strettamente correlati allo sviluppo, in quanto condividono un antenato comune durante lo sviluppo embrionale, le cellule gliali radiali24. L'origine embrionale comune dei due tipi di cellule sembra facilitare la conversione neuronale rispetto alla riprogrammazione di cellule provenienti da diversi strati germinali19,21. Inoltre, le informazioni di pattern ereditate dagli astrociti attraverso la loro origine glia radiale sono mantenute anche negli astrociti adulti 25,26,27 e sembrano contribuire alla generazione di sottotipi neuronali appropriati a livello regionale 28,29,30. Quindi, studiare e comprendere la conversione degli astrociti in neuroni è una parte importante del raggiungimento del pieno potenziale di questa tecnica per le strategie di sostituzione basate sulle cellule.
La conversione di astrociti in coltura in vitro in neuroni ha portato a diverse scoperte nel campo della riprogrammazione neuronale diretta, tra cui: i) l'identificazione di fattori di trascrizione sufficienti a generare neuroni dagli astrociti 15,19,31, ii) il dipanarsi di meccanismi molecolari innescati da diversi fattori di riprogrammazione nello stesso contesto cellulare 32 , e iii) evidenziando l'impatto dell'origine evolutiva degli astrociti sull'induzione di diversi sottotipi neuronali 28,29,33. Inoltre, la conversione diretta in vitro degli astrociti ha svelato diversi ostacoli importanti che limitano la riprogrammazione neuronale diretta34,35, come l'aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS)34 e le differenze tra il proteoma mitocondriale degli astrociti e i neuroni35. Quindi, queste osservazioni supportano fortemente l'uso di colture primarie di astrociti come modello per la riprogrammazione neuronale diretta per indagare diverse questioni fondamentali in biologia12, relative al mantenimento dell'identità cellulare, agli ostacoli che impediscono i cambiamenti del destino cellulare e al ruolo del metabolismo nella riprogrammazione.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per isolare astrociti da topi in età postnatale (P) con purezza molto elevata, come dimostrato isolando astrociti dal midollo spinale murino29. Forniamo anche protocolli per riprogrammare gli astrociti in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del plasmide del DNA. Le cellule riprogrammate possono essere analizzate a 7 giorni dopo la trasduzione (7 DPT) per valutare vari aspetti, come l'efficienza di riprogrammazione e la morfologia neuronale, oppure possono essere mantenute in coltura per diverse settimane, per valutarne la maturazione nel tempo. È importante sottolineare che questo protocollo non è specifico per gli astrociti del midollo spinale e può essere prontamente applicato per isolare gli astrociti da varie altre regioni del cervello, tra cui la materia grigia corticale, il mesencefalo e il cervelletto.
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Protocol
La seguente procedura segue le linee guida per la cura degli animali dell'Helmholtz Zentrum Munich in conformità con la direttiva 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Assicurati di rispettare le linee guida per la cura degli animali dell'istituzione in cui viene eseguita la dissezione.
1. Preparazione di materiali per dissezione, dissociazione e coltura
NOTA: Preparare tutti i reagenti di coltura all'interno di un armadio di sicurezza biologica e lavorare utilizzando solo apparecchiature autoclavate o sterili. I reagenti di dissezione e dissociazione possono essere preparati al di fuori di un armadio di sicurezza biologica.
- Preparare i palloni di coltura rivestendo un matraccio di coltura T25 con poli-D-lisina (brodo 1 mg/mL; soluzione di lavoro 20 μg/mL) in H2O per un minimo di 2 ore. Successivamente, risciacquare 3 volte con H2O e asciugare all'aria.
- Preparare il tampone di dissezione aggiungendo 5 ml di soluzione tampone HEPES da 1 M a 500 ml di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank.
- Preparare un tubo C (vedi Tabella dei materiali) per sei midollo spinale aggiungendo 1950 μL di tampone X dal kit di dissociazione del tessuto neurale (vedere Tabella dei materiali). Conservare sul ghiaccio durante la dissezione. Preparare il master mix di digestione enzimatica aggiungendo 20 μL di tampone Y e 10 μL di tampone A per tubo C (parte del kit di dissociazione del tessuto neurale; vedere Tabella dei materiali). Mescolare bene e conservare a 4 °C fino a quando necessario.
- Preparare 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) con calcio e magnesio e mettere su ghiaccio. Preparare il terreno di coltura di base aggiungendo 5 mL di penicillina-streptomicina (concentrazione finale, 100 U / mL), 5 mL di D-glucosio al 45% e 5 mL di integratore di glutammina (concentrazione finale 2 mM; vedere Tabella dei materiali) a 485 mL di DMEM / F12. Il mezzo di base è stabile a 4 °C per 4 settimane.
- Preparare il terreno di coltura degli astrociti aggiungendo 1 mL di integratore B27 e 5 mL di siero bovino fetale (FBS) a 44 mL di terreno di coltura di base. Mezzo di integrazione con fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) (10 ng / mL ciascuno). Aggiungere EGF e bFGF appena prima dell'uso alla quantità appropriata di supporto.
- Per la dissezione del tessuto del midollo spinale, utilizzare un paio di grandi pinze con punta piegata, un paio di piccole pinze con punta piegata, un paio di piccole pinze, un paio di piccole forbici e una piccola spatola.
2. Isolamento degli astrociti
- Isolare gli astrociti dal midollo spinale dei topi postnatali per eseguire la loro riprogrammazione diretta in neuroni funzionali (Figura 1A). Per questo protocollo, raccogliere il tessuto del midollo spinale dai topi al giorno 2-3 dopo la nascita. Raccogli da sei a otto midollo spinale per l'isolamento degli astrociti. Utilizzare questo stesso protocollo per isolare gli astrociti da altre regioni del sistema nervoso, come la corteccia, il mesencefalo e il cervelletto. Per queste regioni, ottenere cellule a cinque o sette giorni dopo la nascita.
NOTA: Quando si mira a isolare astrociti da regioni che non sono menzionate in questo protocollo, l'età e il materiale in ingresso devono essere determinati sperimentalmente.
3. Dissezione del tessuto del midollo spinale
NOTA: la dissezione del tessuto può essere eseguita al di fuori di un armadio di sicurezza biologica.
- Sacrifica topi a P2-P3 per decapitazione senza anestetizzare l'animale. Posizionare il busto in una capsula di Petri da 35 mm e tenerlo sul ghiaccio.
- Aprire la pelle con le forbici, rimuovere la vertebra con piccole forbici, estrarre il midollo spinale e metterlo nel tampone di dissezione sul ghiaccio. Sotto un microscopio di dissezione stereotassica con ingrandimento 2x, rimuovere le meningi dal midollo spinale isolato usando una pinza e trasferire il tessuto del midollo spinale sezionato e pulito a un tubo C.
4. Ordinamento magnetico delle celle attivate (MACS)
- Aggiungere 50 μL di enzima P dal kit di dissociazione del tessuto neurale (vedere Tabella dei materiali) e 30 μL di miscela enzimatica precedentemente preparata a ciascun tubo C. Invertire i tubi a C e posizionarli su un dissociatore riscaldato (vedi Tabella dei materiali), assicurandosi che tutto il tessuto sia raccolto nel coperchio del tubo.
- Eseguire il programma di dissociazione 37_NTDK_1 con un tempo di esecuzione di circa 22 minuti. Poco prima della fine del programma, posizionare un filtro da 70 μm (vedi Tabella dei materiali) su un numero di tubi da 15 ml pari al numero di tubi C utilizzati e pre-bagnare il filtro con 2 mL di PBS ghiacciato. Conservare 1x PBS su ghiaccio durante l'intera procedura MACS.
- Dopo il completamento del programma, rimuovere i tubi C e centrifugarli brevemente per raccogliere il tessuto sul fondo dei tubi. Trasferire il tessuto dissociato dai tubi C ai tubi da 15 ml preparati facendolo passare attraverso il filtro. Lasciare il filtro su tubi da 15 ml.
- Risciacquare il tubo C con 10 mL di 1x PBS per raccogliere il tessuto residuo e raccoglierlo nello stesso tubo da 15 mL passando ancora una volta attraverso il filtro. Centrifugare i tubi da 15 ml contenenti tessuto dissociato a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Raffreddare la centrifuga fino a 4 °C dopo questo passaggio. - Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare prima di risospendere le cellule in 80 μL di 1x PBS; aggiungere 10 μL di reagente bloccante dal kit microsfere anti-ACSA-2 del mouse (vedere Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
- Incubare a 4 °C per 10 minuti al buio (frigorifero). Aggiungere 10 μL di microsfere accoppiate all'antigene-2 della superficie delle cellule anti-astrocita (vedere Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Incubare per 15 minuti a 4 °C al buio.
- Lavare le celle aggiungendo 3 mL di 1x PBS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C. Durante la centrifugazione, assemblare un separatore magnetico (vedi Tabella dei materiali) posizionando il numero appropriato di colonne di smistamento magnetico (vedi Tabella dei materiali) sul separatore con un tubo di raccolta da 15 ml sotto. Risciacquare le colonne con 500 μL di 1x PBS.
- Rimuovere il surnatante e risospesere le cellule in 500 μL di 1x PBS prima di trasferire le sospensioni cellulari alle colonne magnetiche. Lasciare scolare per gravità. Lavare i tubi da 15 mL con 500 μL di 1x PBS e applicare alla colonna. Lavare le colonne con 500 μL di 1x PBS per altri due lavaggi.
- Eluire le cellule rimuovendo la colonna dal separatore, aggiungendo 800 μL di terreno di coltura degli astrociti e spingendo le cellule fuori dalla colonna con lo stantuffo incluso.
- Cellule piatte nei palloni di coltura precedentemente preparati aggiungendo 4,2 mL di terreno di coltura di astrociti integrato con EGF e bFGF e coltura a 37 °C e 5% di CO2.
NOTA: Il rivestimento dei palloni di coltura non è necessario per gli astrociti isolati da altre regioni del cervello, ma fornisce un substrato migliore per gli astrociti isolati dal midollo spinale. - Cellule di coltura per circa 7 giorni fino alla confluenza (80%-90%). Se le cellule non sono confluenti dopo 7 giorni, attendere fino a 10 giorni prima di placcarle. Dopo 10 giorni, le cellule non proliferano più e l'efficienza di riprogrammazione diminuisce.
5. Semina di astrociti per la riprogrammazione
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in un armadio di sicurezza biologica con un livello di sicurezza 1 (SL1).
- Preparare piastre a 24 pozzetti con coperture in vetro rivestito in poli-D-lisina nello stesso modo in cui i palloni di coltura sono stati preparati in precedenza. Per determinare il numero di piastre necessarie, si consideri che gli astrociti sono placcati ad una densità di 5-5,5 x 104 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Di solito, isolando sei midollo spinale dai topi P2 si ottengono circa 1 x 106 cellule.
- Aspirare i mezzi dai palloni di coltura T25 contenenti gli astrociti coltivati e lavare una volta con 1x PBS. Staccare gli astrociti dal matraccio di coltura aggiungendo 0,5 ml di tripsina/EDTA allo 0,05% e incubare a 37 °C per 5 minuti. Picchiettare delicatamente il lato del pallone per rilasciare le cellule dalla superficie del pallone di coltura e controllare il distacco al microscopio a campo luminoso utilizzando un ingrandimento 10X.
- Interrompere la tripsinizzazione con 2,5 mL di terreno di coltura di astrociti e raccogliere la sospensione cellulare in tubi da 15 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirare il surnatante e risospesiare le cellule in 1 mL di terreno di coltura astrocitario. Calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un sistema automatizzato di conteggio delle cellule.
- In base al numero di cellule, diluire la sospensione cellulare con mezzo astrocitario fresco per ottenere una soluzione di 1-1,1 x 105 cellule per ml. Integrare il mezzo con EGF e bFGF a 10 ng/mL per fattore. Aggiungere 500 μL di sospensione cellulare, equivalenti a 5-5,5 x 104 celle, a ciascun pozzetto delle piastre a 24 pozzetti precedentemente preparate e alle cellule di coltura a 37 °C e al 5% di CO2.
6. Espressione forzata dei fattori di trascrizione
NOTA: Prima di procedere con il protocollo, è essenziale progettare correttamente l'esperimento. In particolare, è importante includere sempre un controllo negativo per la riprogrammazione, vale a dire una condizione in cui non viene espresso alcun fattore di riprogrammazione. Ad esempio, quando si utilizzano vettori che trasportano il cDNA per il fattore di riprogrammazione e un reporter (ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP), DsRed), il controllo negativo è rappresentato dallo stesso vettore che trasporta solo il reporter. Quando si esprimono più fattori che trasportano diversi reporter, il controllo negativo dovrebbe essere regolato di conseguenza.
- Il giorno dopo la placcatura, ispezionare le piastre a 24 pozzetti per assicurarsi che le cellule abbiano aderito alle coperture.
- Sulla base dell'obiettivo sperimentale e delle risorse disponibili, l'espressione forzata dei fattori di riprogrammazione può essere ottenuta mediante trasduzione virale (vedi fase 6.3) o trasfezione del DNA (vedi fase 6.4).
NOTA: L'uso di retrovirus o lentivirus richiede l'approvazione delle autorità governative e deve essere eseguito sotto un armadio di sicurezza biologica all'interno di un laboratorio con livello di sicurezza 2 (SL2). - Riprogrammare gli astrociti trasducendo le cellule con il retrovirus o il lentivirus che trasportano le informazioni genetiche per esprimere il fattore o i fattori di riprogrammazione di interesse come descritto di seguito.
- Trasdurre cellule con un alto titolo virale di 1 x 1010-1 x 1012 particelle/ml aggiungendo 1 μL di sospensione cellulare direttamente al mezzo astrocitario. Ciò garantisce un alto tasso di infezione. Coltivare le cellule con il mezzo astrocitario contenente particelle virali a 37 °C per 24-36 ore prima di procedere con il paragrafo 7 o il paragrafo 8, a seconda dello scopo dell'esperimento.
NOTA: diversi promotori possono essere utilizzati per guidare l'espressione dei transgeni (vedi anche Risultati rappresentativi). I promotori costitutivi (ad esempio, CMV, CAG) inducono l'espressione del transgene prima dei promotori inducibili; tuttavia, entrambi i tipi di tipi di promotori sono stati utilizzati con successo per riprogrammare le cellule in neuroni.
- Trasdurre cellule con un alto titolo virale di 1 x 1010-1 x 1012 particelle/ml aggiungendo 1 μL di sospensione cellulare direttamente al mezzo astrocitario. Ciò garantisce un alto tasso di infezione. Coltivare le cellule con il mezzo astrocitario contenente particelle virali a 37 °C per 24-36 ore prima di procedere con il paragrafo 7 o il paragrafo 8, a seconda dello scopo dell'esperimento.
- I plasmidi del DNA possono anche essere introdotti negli astrociti tramite trasfezione del DNA come descritto di seguito.
NOTA: Questo può essere fatto sotto un gabinetto di sicurezza biologica approvato per SL1.- Prima della trasfezione, ottenere il reagente di trasfezione, un DNA plasmidico dei costrutti desiderati, un mezzo astrocitario fresco e un mezzo ridotto al siero (vedere Tabella dei materiali). Calcolare la quantità richiesta di siero ridotto (vedi Tabella dei materiali) considerando che ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti richiede 300 μL di terreno ridotto al siero. Aggiungere la quantità appropriata di siero ridotto a un tubo da 50 ml e riscaldarlo a 37 °C.
- Quando il mezzo ridotto al siero è caldo, aspirare il mezzo astrocitario da tutti i pozzetti e raccoglierlo in un tubo da 50 ml. Filtrare il mezzo astrocitario raccolto con un filtro a siringa da 0,45 μM per rimuovere le cellule staccate.
- Aggiungere un volume uguale di mezzo astrocitario fresco al mezzo filtrato per ottenere una soluzione sufficiente per aggiungere 1 mL di mezzo astrocitario per pozzetto. Mantenere il mezzo condizionato dagli astrociti nell'incubatrice a 37 °C fino all'uso (fase 6.4.9).
NOTA: il supporto della coltura viene riutilizzato in quanto contiene diversi fattori secreti che supportano la redditività della coltura. - Aggiungere 300 μL di siero ridotto preriscaldato a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra da 24 pozzetti nell'incubatrice.
- Preparare la soluzione A, costituita da DNA e mezzo ridotto al siero. Per ogni pozzetto, utilizzare un totale di 0,6 μg di DNA e aggiungerlo a 50 μL di terreno a ridotto siero. Conservare la soluzione A a temperatura ambiente fino all'uso.
NOTA: in genere, viene considerato un triplice tecnico per condizione. Pertanto, viene preparata una miscela sufficiente per una reazione di 3,5 (ad esempio, 2,1 μg di DNA totale diluito in 175 μL di mezzo a ridotto siero) per garantire materiale sufficiente per trasfettare tre pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. - Preparare la soluzione B, composta dal reagente di trasfezione e dal mezzo a riduzione del siero. Per ogni pozzetto, aggiungere 0,75 μL di reagente di trasfezione a 50 μL di mezzo a riduzione del siero. Poiché questa soluzione è comune a tutte le condizioni di trasfezione, prepararla alla rinfusa per ridurre la variabilità tra le trasfezioni.
- Incubare la soluzione B a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere la soluzione B alla soluzione A goccia a goccia con un rapporto 1:1 e mescolare delicatamente. Non vortice. Incubare la soluzione A + B per 20-30 minuti a temperatura ambiente sotto il cofano.
- Ripetere i passaggi 6.4.5-6.4.7 per tutte le condizioni di trasfezione. Dopo 20-30 minuti, aggiungere la soluzione A+B a ciascun pozzetto goccia a goccia per un volume finale di 100 μL. Agitare delicatamente la piastra e riporre le cellule nell'incubatrice a 37 °C per 4 ore.
- Dopo 4 ore, rimuovere il mezzo di trasfezione e aggiungere 1 mL del mezzo condizionato dagli astrociti preriscaldato preparato al punto 6.4.3. Mantenere le celle per 36-48 ore prima di procedere con la sezione 7 o la sezione 8, a seconda dello scopo dell'esperimento.
7. Riprogrammazione degli astrociti (analisi di 7 giorni)
- Preparare il mezzo di differenziazione neuronale aggiungendo 1 mL di integratore B27 a 49 mL di terreno di coltura di base (vedere passo 1.4). Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate (vedere rispettivamente i passaggi 6.3 e 6.4), sostituire il mezzo astrocitario con 1 mL di mezzo di differenziazione neuronale per pozzo e cellule di coltura a 37 °C e 9% di CO2.
NOTA: Le celle possono anche essere mantenute al 5% di CO2 se non è disponibile un incubatore a CO2 al 9%. Tuttavia, la riprogrammazione neuronale è più efficiente in queste condizioni. - Facoltativo: Per aumentare l'efficienza di riprogrammazione, integrare il mezzo di differenziazione neuronale con Forskolin (concentrazione finale di 30 μM) e Dorsomorfina (concentrazione finale di 1 μM) quando si sostituisce il mezzo astrocitario al mezzo di differenziazione. Quando si sceglie di trattare le cellule con Forskolin e Dorsomorfina, fornire una seconda dose di Dorsomorfina 2 giorni dopo il trattamento iniziale. Aggiungere questo secondo trattamento direttamente al terreno di coltura.
- La riprogrammazione diretta degli astrociti murini in cellule neuronali avviene normalmente entro 7 giorni dal cambio del mezzo. Quindi, 7 giorni dopo l'inizio della riprogrammazione neuronale, fissare o raccogliere cellule per l'analisi a valle.
8. Riprogrammazione degli astrociti in neuroni maturi (colture a lungo termine)
- Preparare il mezzo di differenziazione neuronale aggiungendo 1 mL di integratore B27 a 49 mL di terreno di coltura di base (vedere passo 1.4). Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate (vedere rispettivamente i passaggi 6.3 e 6.4), sostituire il mezzo astrocitario con 1 mL di mezzo di differenziazione neuronale integrato con Forskolin (concentrazione finale di 30 μM) e Dorsomorfina (concentrazione finale di 1 μM) per pozzetto e cellule di coltura a 37 °C e 9% CO2.
NOTA: Le celle possono anche essere mantenute al 5% di CO2 se non è disponibile un incubatore a CO2 al 9%. Tuttavia, la riprogrammazione neuronale è più efficiente in queste condizioni. - Ripetere il trattamento con Dorsomorfina 2 giorni dopo il trattamento iniziale aggiungendolo direttamente al mezzo di differenziazione neuronale.
- Dopo 7 giorni dall'inizio della riprogrammazione neuronale, preparare il mezzo di maturazione aggiungendo 6 μL di N2, 1,2 μL di NT3 (stock 20 μg/mL), 1,2 μL di BDNF (stock 20 μg/mL), 1,2 μL di GDNF (stock 20 μg/mL) e 1,2 μL di cAMP (stock 100 mM) a 189,2 μL di mezzo di differenziazione neuronale. Integrare il mezzo di differenziazione neuronale presente in ciascun pozzetto con 200 μL di terreno di maturazione.
NOTA: Il mezzo di maturazione viene integrato solo per il primo trattamento. Tutti i trattamenti successivi vengono eseguiti sostituendo parzialmente il mezzo di differenziazione neuronale come descritto di seguito. - Ripetere il trattamento con piccole molecole rimuovendo 200 μL di mezzo di differenziazione neuronale e aggiungendo 200 μL di terreno di maturazione fresco due volte a settimana per un massimo di 6 settimane. Durante la maturazione, utilizzare le cellule per esperimenti elettrofisiologici (in genere, al giorno 21 o successivo) o fissare per l'analisi a valle (ad esempio, immunofluorescenza).
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Representative Results
Le colture primarie di astrociti raggiungono tipicamente l'80% -90% di confluenza tra 7 e 10 giorni dopo lo smistamento e la placcatura MAC (Figura 1B). Generalmente, un singolo pallone di coltura T25 produce circa 1-1,5 x 106 cellule, che è sufficiente per 20-30 coverslip quando si seminano le cellule ad una densità di 5-5,5 x 104 cellule per pozzetto. Il giorno dopo la placcatura, le celle coprono in genere il 50%-60% della superficie del coverslip (Figura 1C). In questa fase, le colture sono costituite quasi esclusivamente da astrociti, mentre altri tipi di cellule, come i neuroblasti, sono praticamente assenti (Figura 1D)29.
I fattori di riprogrammazione possono essere consegnati agli astrociti sia attraverso la trasduzione retrovirale o lentivirale o attraverso la trasfezione di plasmidi del DNA. Di solito, la trasduzione virale infetta più cellule rispetto alla trasfezione. Poiché la conversione neuronale diretta provoca una notevole quantità di morte cellulare34,35, la trasduzione retrovirale o lentivirale è preferita per massimizzare il numero di cellule per l'analisi. Diversi promotori possono essere utilizzati per controllare l'espressione dei fattori di riprogrammazione: costitutivi (ad esempio, CMV, CAG)15,32, inducibili (ad esempio, elementi Tet-responsive, Tet-ON)21, o specifici del tipo di cellula (ad esempio, promotore GFAP)36,37. Quando si utilizzano promotori costitutivi o specifici del tipo cellulare, gli astrociti iniziano ad esprimere livelli rilevabili dei transgeni, valutati mediante espressione di reporter fluorescente (ad esempio, GFP, DsRed), entro 24 ore dalla consegna del gene, con ogni cellula indipendente dalle altre. Viceversa, i promotori inducibili permettono di sincronizzare l'espressione dei transgeni attraverso le cellule trasdotte, in quanto vengono attivati in seguito all'aggiunta di una piccola molecola (ad esempio, doxiciclina) al terreno di coltura. I livelli rilevabili dei fattori di trascrizione vengono solitamente raggiunti 18-20 ore dopo l'attivazione del promotore. Nella maggior parte dei casi, il picco dell'espressione del fattore di riprogrammazione viene raggiunto intorno alle 48 ore, con l'espressione mediata dal lentivirus che richiede un po 'più di tempo.
Mentre i cambiamenti trascrizionali a seguito dell'espressione dei fattori di riprogrammazione possono essere rilevati già a 4 ore32, i cambiamenti robusti si verificano dopo 24 ore e successivamente29,32. I cambiamenti morfologici seguono cambiamenti trascrizionali e i primi segni di conversione possono essere osservati intorno ai 3 giorni dopo la trasduzione / trasfezione (3 DPT). A 7 DPT, le cellule neuronali indotte sono chiaramente distinguibili dagli astrociti: il loro soma è più piccolo degli astrociti di controllo o non riprogrammati, hanno processi lunghi e sono positivi per il marcatore neuronale βIII-tub e sono negativi per il marcatore astrocitario GFAP (Figura 1E). Tuttavia, vale la pena notare che alcune cellule possono essere sia positive sia per GFAP che per βIII-tub, suggerendo che il programma neuronale è stato indotto ma l'identità astrocitaria non è stata inibita, o negativo per entrambi i marcatori, indicando la repressione dell'identità astrocitaria ma l'assenza di induzione della cascata neuronale. In entrambi i casi, le cellule di solito mantengono una morfologia astrocitaria.
Per analisi più funzionali, come l'elettrofisiologia o la valutazione dei sottotipi neuronali generati, le colture vengono generalmente mantenute per un minimo di 21 DPT e trattate con mezzo di maturazione. A 21 DPT, molti neuroni indotti sono in grado di attivare potenziali d'azione e sono positivi per il marcatore neuronale maturo NeuN e per la proteina pan-sinaptica Synaptophysin29 (Figura 1F).
Figura 1: Panoramica della coltura e della riprogrammazione degli astrociti. (A)Timeline della conversione diretta da astrociti a neurone. Ogni linea nera rappresenta un passo importante nel protocollo. (B) Immagini rappresentative in campo luminoso di astrociti derivati dal midollo spinale in coltura dopo 7 giorni in coltura. Le foto sono state scattate utilizzando un microscopio a campo luminoso e un obiettivo 10x. La barra della scala rappresenta 100 μm. (C) Immagini rappresentative in campo luminoso di astrociti del midollo spinale 1 giorno dopo la ri-placcatura ad una densità di 5,5 x 104 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio a campo luminoso e un obiettivo 10x. La barra della scala rappresenta 100 μm. (D) Immagine di immunofluorescenza di una vasca βIII, Sox9, tripla colorazione GFAP sugli astrociti fissata 1 giorno dopo la placcatura per dimostrare la purezza della coltura. Le cellule sono state fissate al 4% in paraformaldeide per 10 minuti e lavate due volte con 1x PBS. Le cellule sono state bloccate utilizzando un BSA al 3%, tritone-X 100 allo 0,5% in soluzione PBS 1x. Gli anticorpi primari sono stati diluiti alla giusta concentrazione (ad esempio, anti-GFAP 1:250; anti-βIII-tub 1:250; anti-Syp1 1:500) in soluzione bloccante e incubati per 2 ore a temperatura ambiente. Le cellule sono state lavate tre volte con 1x PBS e incubate con anticorpi secondari coniugati con fluoroforo per 1 ora a temperatura ambiente. I coverslip sono stati lavati tre volte con 1x PBS prima di essere montati con Aqua Poly/Mount. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza e un obiettivo 40x. La barra di scala rappresenta 20 μm. (E) Immagine di immunofluorescenza di una vasca βIII, doppia colorazione DsRed per dimostrare la conversione da astrociti a neurone con Ascl1 dopo 7 DPT. Protocollo di immunofluorescenza e acquisizione di immagini era come descritto sopra. La barra di scala rappresenta 20 μm. (F) Immagini di immunofluorescenza di una vasca βIII, DsRed, Synaptophysin 1 (Syp1) tripla colorazione per dimostrare la maturità neuronale dopo 21 DPT di riprogrammazione con Ascl1. Il protocollo di immunofluorescenza e acquisizione di immagini era come descritto sopra. La barra della scala rappresenta 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le colture primarie di astrociti murini sono un notevole sistema modello in vitro per studiare la riprogrammazione neuronale diretta. Infatti, nonostante siano isolate in uno stadio postnatale, le cellule esprimono i tipici marcatori astrocitari29, mantengono l'espressione dei genipatterning 28,29 e mantengono la capacità di proliferare, simile agli astrociti in vivo ad un'età comparabiledi 38 anni. Dopo l'isolamento mediato da MACS, le cellule aderiscono prima al pallone e poi iniziano a proliferare, dando origine a colture di astrociti altamente arricchite29. È importante sottolineare che gli astrociti in coltura non si dedifferenziano in uno stato cellulare multipotente né vengono immortalati. Inoltre, non generano spontaneamente neuroni in seguito all'espressione di una proteina reporter (ad esempio, DsRed o GFP), ma mantengono un'identità astrocitaria. Inoltre, non proliferano indefinitamente, ma piuttosto rallentano la loro proliferazione e transizione in uno stadio più maturo, che riduce il loro potenziale di riprogrammazione neuronale diretta32,39.
Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo: in primo luogo, è essenziale isolare attentamente la regione di interesse e rimuovere eventuali tessuti contaminanti. Ad esempio, per preparare gli astrociti del midollo spinale, il midollo spinale viene estratto dalle vertebre e i gangli della radice dorsale (DRG) vengono accuratamente rimossi. In secondo luogo, le cellule convertibili subiscono una significativa morte cellulare34, che ha un impatto negativo sulle cellule trasdotte e sulla coltura complessiva, a causa della stimolazione della fagocitosi da parte degli astrociti circostanti e dell'alterata osmolarità dei media. Pertanto, è importante sostituire il mezzo astrocitario con un adeguato volume di mezzo di differenziazione (di solito 1 ml / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti). Inoltre, la trasfezione del DNA plasmidico è un approccio facile e più accessibile rispetto alla trasduzione virale, che richiede una sala di coltura cellulare di livello di sicurezza 2 approvata. Tuttavia, il tasso di trasfezione e l'efficienza di riprogrammazione sono inferiori rispetto alla consegna virale dei fattori di riprogrammazione. Pertanto, la trasfezione può essere utilizzata come metodo rapido per testare il potenziale di riprogrammazione di nuovi fattori di riprogrammazione candidati o per vagliare pool di fattori. Per quanto riguarda la maturazione neuronale, le cellule riprogrammate di solito diventano elettrofisiologicamente attive a circa 3 settimane. Sebbene non sia necessario, il trattamento delle cellule con piccole molecole aumenta sia la sopravvivenza che la maturazione delle cellule riprogrammate, portando a una maggiore densità di neuroni indotti e a una morfologia più matura.
Sebbene il metodo descritto per isolare e coltivare gli astrociti sia robusto e affidabile, alcuni aspetti devono essere considerati. In primo luogo, mentre i metodi convenzionali basati sulla dissociazione meccanica dei tessuti producono un numero complessivamente più elevato di cellule in coltura per tessuto sezionato40, un approccio ordinato MAC richiede la dissezione del tessuto da sei a otto cuccioli per isolare un numero adeguato di cellule per esperimenti successivi. Inoltre, l'isolamento degli astrociti si basa sull'espressione della proteina Beta2 trasportante atPasi Na+/K+ (Atp1b2), riconosciuta dall'anticorpo ACSA-241. In linea di principio, gli astrociti che non esprimono Atp1b2 andrebbero persi nella preparazione, causando quindi un pregiudizio nella preparazione. Anche se non possiamo escludere che questo sia il caso, la nostra analisi del flusso MACS ha rivelato che poche cellule nella frazione negativa erano immunoreattive per i marcatori astroglia Sox9, suggerendo l'alta efficienza del protocollo di selezione MAC. Un secondo avvertimento riguardante Atp1b2 è legato alla sua espressione. Atp1b2 è specificamente espresso dagli astrociti allo stadio postnatale, mentre nel cervello adulto del topo lo esprimono altri tipi di cellule, in particolare oligodendrociti mielinizzanti e cellule ependimali27. Pertanto, è necessaria un'attenta dissezione dell'area di interesse e una fase di rimozione della mielina per isolare gli astrociti dal cervello adulto.
Rispetto ad altri metodi per isolare gli astrociti, l'approccio basato su MACS garantisce un'elevata purezza delle colture (>90% delle cellule Sox9+) e fornisce una procedura standardizzata per isolare gli astrociti da diverse regioni del SNC. Ciò è particolarmente importante quando si confrontano colture di diverse regioni del SNC, poiché la purezza della coltura ottenuta dalla dissociazione meccanica classica può variare notevolmente (>80% GFAP + / DAPI dalla materia grigia corticale, ~ 50% GFAP + / DAPI dal midollo spinale) 15,29. Un protocollo standardizzato riduce tale variabilità e fornisce un punto di partenza comune per esperimenti di riprogrammazione in vitro. Ciò consente, ad esempio, di confrontare sistematicamente l'identità molecolare di astrociti provenienti da diverse regioni28,29 e di studiare l'impatto dell'origine dello sviluppo sull'efficienza di riprogrammazione e l'identità del sottotipo dei neuroni indotti.
In sintesi, la riprogrammazione neuronale diretta in vitro di colture ottimizzate di astrociti è un approccio molto potente per svelare i meccanismi molecolari universali e specifici della regione della conversione da astrociti a neurone, fornendo informazioni essenziali per progettare strategie migliori e più efficaci per la conversione diretta in vivo degli astrociti del SNC residenti.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Ines Mühlhahn per aver clonato i costrutti per la riprogrammazione, Paulina Chlebik per la produzione virale e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak per i commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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