Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung hochangereicherter Kulturen von Astrozyten, die aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems postnataler Mäuse stammen, und deren direkte Umwandlung in funktionelle Neuronen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.
Abstract
Die direkte neuronale Reprogrammierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, um funktionelle Neuronen aus verschiedenen Starterzellpopulationen zu erzeugen, ohne multipotente Zwischenprodukte zu durchlaufen. Diese Technik verspricht nicht nur im Bereich der Krankheitsmodellierung große Versprechungen, da sie es beispielsweise ermöglicht, Fibroblasten für Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen in Neuronen umzuwandeln, sondern stellt auch eine vielversprechende Alternative für zellbasierte Ersatztherapien dar. Ein großer wissenschaftlicher Durchbruch war in diesem Zusammenhang der Nachweis, dass differenzierte nicht-neuronale Zellen innerhalb des Zentralnervensystems, wie Astrozyten, in vitro in funktionelle Neuronen umgewandelt werden können. Seitdem hat die direkte In-vitro-Reprogrammierung von Astrozyten in Neuronen substanzielle Einblicke in die molekularen Mechanismen geliefert, die der erzwungenen Identitätsumwandlung zugrunde liegen, und die Hürden, die eine effiziente Reprogrammierung verhindern. Die Ergebnisse von In-vitro-Experimenten, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, sind jedoch aufgrund der Unterschiede in den Methoden zur Isolierung, Kultur und Neuprogrammierung von Astrozyten schwer zu vergleichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Isolierung und Kultivierung von Astrozyten mit hoher Reinheit aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems von Mäusen im postnatalen Alter mittels Magnetzellsortierung. Darüber hinaus bieten wir Protokolle zur Umprogrammierung kultivierter Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Transfektion an. Mit diesem schlanken und standardisierten Protokoll können die molekularen Mechanismen untersucht werden, die der Aufrechterhaltung der Zellidentität, der Etablierung einer neuen neuronalen Identität sowie der Generierung spezifischer neuronaler Subtypen und ihrer funktionellen Eigenschaften zugrunde liegen.
Introduction
Das zentrale Nervensystem (ZNS) von Säugetieren ist hochkomplex und besteht aus Hunderten von verschiedenen Zelltypen, darunter eine große Anzahl verschiedener neuronaler Subtypen 1,2,3,4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Organen oder Geweben 7,8,9 hat das ZNS von Säugetieren eine sehr begrenzte Regenerationsfähigkeit; Der neuronale Verlust nach einer traumatischen Hirnverletzung oder Neurodegeneration ist irreversibel und führt häufig zu motorischen und kognitiven Defiziten10. Mit dem Ziel, Gehirnfunktionen zu retten, werden verschiedene Strategien zum Ersatz verlorener Neuronen intensiv untersucht11. Unter ihnen entwickelt sich die direkte Reprogrammierung von Körperzellen in funktionelle Neuronen zu einem vielversprechenden therapeutischen Ansatz12. Direkte Reprogrammierung oder Transdifferenzierung ist der Prozess der Umwandlung eines differenzierten Zelltyps in eine neue Identität, ohne einen intermediären proliferativen oder pluripotenten Zustand13,14,15,16 zu durchlaufen. Entwickelt durch die Identifizierung von MyoD1 als einen Faktor, der ausreicht, um Fibroblasten in Muskelzellenumzuwandeln 17,18, wurde diese Methode erfolgreich angewendet, um mehrere Zelltypen in funktionelle Neuronenumzuprogrammieren 19,20,21.
Astrozyten, die am häufigsten vorkommenden Makroglia im ZNS22,23, sind aus mehreren Gründen ein besonders vielversprechender Zelltyp für die direkte neuronale Reprogrammierung. Erstens sind sie weit und gleichmäßig über das ZNS verteilt und bieten eine reichlich vorhandene Lokquelle für neue Neuronen. Zweitens sind Astrozyten und Neuronen entwicklungseng miteinander verwandt, da sie während der Embryonalentwicklung einen gemeinsamen Vorfahren haben, die radialen Gliazellen24. Der gemeinsame embryonale Ursprung der beiden Zelltypen scheint die neuronale Umwandlung im Vergleich zur Reprogrammierung von Zellen aus verschiedenen Keimschichten zu erleichtern19,21. Darüber hinaus werden Musterinformationen, die von Astrozyten durch ihren radialen Glia-Ursprung geerbt werden, auch in erwachsenen Astrozyten 25,26,27 aufrechterhalten und scheinen zur Erzeugung regional geeigneter neuronaler Subtypen 28,29,30 beizutragen. Daher ist die Untersuchung und das Verständnis der Umwandlung von Astrozyten in Neuronen ein wichtiger Teil, um das volle Potenzial dieser Technik für zellbasierte Ersatzstrategien auszuschöpfen.
Die Umwandlung von in vitro kultivierten Astrozyten in Neuronen hat zu mehreren Durchbrüchen auf dem Gebiet der direkten neuronalen Reprogrammierung geführt, darunter: i) die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die ausreichen, um Neuronen aus Astrozyten zu erzeugen15,19,31, ii) die Entschlüsselung molekularer Mechanismen, die durch verschiedene Reprogrammierungsfaktoren im selben zellulären Kontext ausgelöst werden 32 , und iii) Hervorhebung des Einflusses des Entwicklungsursprungs der Astrozyten auf die Induktion verschiedener neuronaler Subtypen28,29,33. Darüber hinaus löste die direkte In-vitro-Umwandlung von Astrozyten mehrere Haupthürden, die die direkte neuronale Reprogrammierung 34,35 begrenzen, wie z.B. eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) 34 und Unterschiede zwischen dem mitochondrialen Proteom von Astrozyten und Neuronen 35. Daher unterstützen diese Beobachtungen nachdrücklich die Verwendung von Primärkulturen von Astrozyten als Modell für die direkte neuronale Reprogrammierung, um mehrere grundlegende Fragen in der Biologiezu untersuchen 12, die sich auf die Aufrechterhaltung der Zellidentität, Straßensperren, die Veränderungen des Zellschicksals verhindern, sowie die Rolle des Stoffwechsels bei der Reprogrammierung beziehen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Astrozyten von Mäusen im postnatalen (P) Alter mit sehr hoher Reinheit, wie durch Isolierung von Astrozyten aus dem murinen Rückenmarkgezeigt wird 29. Wir bieten auch Protokolle zur Umprogrammierung von Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Plasmid-Transfektion an. Reprogrammierte Zellen können 7 Tage nach der Transduktion (7 DPT) analysiert werden, um verschiedene Aspekte wie Reprogrammierungseffizienz und neuronale Morphologie zu beurteilen, oder sie können mehrere Wochen in Kultur gehalten werden, um ihre Reifung im Laufe der Zeit zu beurteilen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll nicht spezifisch für Rückenmarksastrozyten ist und leicht angewendet werden kann, um Astrozyten aus verschiedenen anderen Gehirnregionen zu isolieren, einschließlich der kortikalen grauen Substanz, des Mittelhirns und des Kleinhirns.
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Protocol
Das folgende Verfahren folgt den Tierpflegerichtlinien des Helmholtz Zentrums München gemäß der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere. Bitte achten Sie auf die Einhaltung der Tierpflegerichtlinien der Einrichtung, in der die Dissektion durchgeführt wird.
1. Vorbereitung von Sezier-, Dissoziations- und Kulturmaterialien
HINWEIS: Bereiten Sie alle Kulturreagenzien in einer biologischen Sicherheitswerkbank vor und arbeiten Sie nur mit autoklavierten oder sterilen Geräten. Dissektions- und Dissoziationsreagenzien können außerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank hergestellt werden.
- Bereiten Sie Kulturkolben vor, indem Sie einen T25-Kulturkolben mit Poly-D-Lysin (Stamm 1 mg/ml; Arbeitslösung 20 μg/ml) inH2Ofür mindestens 2 h beschichten. Danach 3x mit H 2 O abspülen und an der Luft trocknen.
- Bereiten Sie den Dissektionspuffer vor, indem Sie 5 ml 1 M HEPES-Pufferlösung zu 500 ml Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) hinzufügen.
- Bereiten Sie ein C-Röhrchen (siehe Materialtabelle) pro sechs Rückenmark vor, indem Sie 1950 μL Puffer X aus dem Neuralgewebe-Dissoziationskit hinzufügen (siehe Materialtabelle). Während der Dissektion auf Eis lagern. Bereiten Sie eine enzymatische Verdauungs-Mastermischung vor, indem Sie 20 μL Puffer Y und 10 μL Puffer A pro C-Röhrchen (Teil des neuralen Gewebedissoziationskits; siehe Materialtabelle) hinzufügen. Gut mischen und bei 4 °C lagern, bis es nötig ist.
- 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) mit Kalzium und Magnesium zubereiten und auf Eis legen. Bereiten Sie das Basiskulturmedium vor, indem Sie 5 ml Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration, 100 U/ml), 5 ml 45% D-Glukose und 5 ml Glutaminpräparat (Endkonzentration 2 mM; siehe Materialtabelle) zu 485 ml DMEM/F12 hinzufügen. Basic Medium ist 4 Wochen lang bei 4 °C stabil.
- Bereiten Sie Astrozytenkulturmedium vor, indem Sie 1 ml B27-Ergänzung und 5 ml fetales Rinderserum (FBS) zu 44 ml Basiskulturmedium hinzufügen. Ergänzungsmedium mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) (jeweils 10 ng/ml). EGF und bFGF kurz vor der Verwendung zu der entsprechenden Menge an Medium hinzufügen.
- Verwenden Sie für die Dissektion von Rückenmarksgewebe ein Paar große Pinzetten mit gebogener Spitze, ein Paar kleine Pinzetten mit gebogener Spitze, ein Paar kleine Pinzetten, eine kleine Schere und einen kleinen Spatel.
2. Astrozyten-Isolierung
- Isolieren Sie Astrozyten aus dem Rückenmark postnataler Mäuse, um ihre direkte Reprogrammierung in funktionelle Neuronen durchzuführen (Abbildung 1A). Für dieses Protokoll sammeln Sie Rückenmarksgewebe von Mäusen am Tag 2-3 nach der Geburt. Sammeln Sie sechs bis acht Rückenmark für die Astrozytenisolierung. Verwenden Sie dasselbe Protokoll, um Astrozyten aus anderen Regionen des Nervensystems wie Kortex, Mittelhirn und Kleinhirn zu isolieren. Für diese Regionen erhalten Sie Zellen fünf bis sieben Tage nach der Geburt.
HINWEIS: Wenn Astrozyten aus Regionen isoliert werden sollen, die in diesem Protokoll nicht erwähnt werden, sollten das Alter und das Eingangsmaterial experimentell bestimmt werden.
3. Dissektion des Rückenmarksgewebes
HINWEIS: Die Dissektion von Gewebe kann außerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
- Opfere Mäuse bei P2-P3 durch Enthauptung, ohne das Tier zu betäuben. Den Torso in eine 35 mm Petrischale geben und auf Eis legen.
- Öffnen Sie die Haut mit einer Schere, entfernen Sie den Wirbel mit einer kleinen Schere, extrahieren Sie das Rückenmark und legen Sie es in den Dissektionspuffer auf Eis. Entfernen Sie unter einem stereotaktischen Dissektionsmikroskop mit 2-facher Vergrößerung die Hirnhäute mit einer Pinzette aus dem isolierten Rückenmark und übertragen Sie seziertes und gereinigtes Rückenmarksgewebe in ein C-Röhrchen.
4. Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS)
- Fügen Sie 50 μL Enzym P aus dem Dissoziationskit des neuronalen Gewebes (siehe Materialtabelle) und 30 μL zuvor hergestellte Enzymmischung zu jedem C-Rohr hinzu. Drehen Sie die C-Rohre um und legen Sie sie auf einen beheizten Dissoziator (siehe Materialtabelle), wobei Sie sicherstellen, dass das gesamte Gewebe im Deckel des Röhrchens gesammelt ist.
- Führen Sie das 37_NTDK_1 Dissoziationsprogramm mit einer Laufzeit von ca. 22 min aus. Legen Sie kurz vor Ende des Programms ein 70-μm-Sieb (siehe Materialtabelle) auf eine Anzahl von 15-ml-Röhrchen, die der Anzahl der verwendeten C-Röhrchen entspricht, und benetzen Sie das Sieb mit 2 ml eiskaltem PBS vor. Lagern Sie 1x PBS während des gesamten MACS-Vorgangs auf Eis.
- Entfernen Sie nach Abschluss des Programms die C-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie kurz, um das Gewebe am Boden der Röhrchen zu sammeln. Übertragen Sie das dissoziierte Gewebe von den C-Röhrchen zu den 15 ml-Röhrchen, die durch das Sieb vorbereitet wurden. Lassen Sie das Sieb auf 15 ml Schläuchen.
- Spülen Sie das C-Rohr mit 10 ml 1x PBS, um übrig gebliebenes Gewebe zu sammeln und es im selben 15 ml Schlauch zu sammeln, indem Sie das Sieb erneut passieren. Zentrifugieren Sie die 15 ml Röhrchen mit dissoziiertem Gewebe bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Kühlen Sie die Zentrifuge nach diesem Schritt auf 4 °C ab. - Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, bevor Sie die Zellen in 80 μL von 1x PBS wieder suspendieren; 10 μL blockierendes Reagenz aus dem Maus-Anti-ACSA-2 MicroBead-Kit hinzufügen (siehe Materialtabelle). Vorsichtig durch Pipettieren vermischen.
- Bei 4 °C 10 min im Dunkeln inkubieren (Kühlschrank). Fügen Sie 10 μL Antigen-2-gekoppelte Antigen-2-gekoppelte Mikrokügelchen gegen Astrozytenzellen hinzu (siehe Materialtabelle) und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. 15 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml 1x PBS und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Setzen Sie während der Zentrifugation einen Magnetseparator (siehe Materialtabelle) zusammen, indem Sie die entsprechende Anzahl von magnetischen Sortiersäulen (siehe Materialtabelle) mit einem 15-ml-Auffangrohr darunter auf den Separator legen. Spülen Sie die Säulen mit 500 μL 1x PBS.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL von 1x PBS, bevor Sie die Zellsuspensionen auf die magnetischen Säulen übertragen. Lassen Sie durch die Schwerkraft abfließen. Die 15 ml Röhrchen mit 500 μL 1x PBS waschen und auf die Säule auftragen. Waschsäulen mit 500 μL 1x PBS für weitere zwei Wäschen.
- Eluieren Sie Zellen, indem Sie die Säule aus dem Separator entfernen, 800 μL Astrozytenkulturmedium hinzufügen und Zellen mit dem mitgelieferten Kolben aus der Säule drücken.
- Plattenzellen in den zuvor präparierten Kulturkolben durch Zugabe von 4,2 ml Astrozytenkulturmedium, ergänzt mit EGF und bFGF und Kultur bei 37 °C und 5% CO2.
HINWEIS: Die Beschichtung von Kulturflaschen ist für Astrozyten, die aus anderen Hirnregionen isoliert wurden, nicht erforderlich, bietet jedoch ein besseres Substrat für Astrozyten, die aus dem Rückenmark isoliert wurden. - Kulturzellen für ca. 7 Tage bis zum Zusammenfluss (80%-90%). Wenn die Zellen nach 7 Tagen nicht konfluent sind, warten Sie bis zu 10 Tage, bevor Sie sie plattieren. Nach 10 Tagen vermehren sich die Zellen nicht mehr und die Reprogrammierungseffizienz nimmt ab.
5. Aussaat von Astrozyten zur Reprogrammierung
HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit einer Sicherheitsstufe 1 (SL1) durchgeführt werden.
- Bereiten Sie 24-Well-Platten mit Poly-D-Lysin-beschichteten Glasabdeckungen auf die gleiche Weise vor, wie Kulturflaschen zuvor vorbereitet wurden. Um die Anzahl der benötigten Platten zu bestimmen, sollten Sie berücksichtigen, dass Astrozyten mit einer Dichte von 5-5,5 x 104 Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte plattiert sind. Normalerweise ergibt die Isolierung von sechs Rückenmarks von P2-Mäusen etwa 1 x 106 Zellen.
- Aspirieren Sie Medien aus den T25-Kulturflaschen mit den kultivierten Astrozyten und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS. Die Astrozyten werden durch Zugabe von 0,5 ml 0,05% Trypsin/EDTA aus dem Kulturkolben gelöst und 5 min bei 37 °C inkubiert. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um Zellen von der Kulturflaschenoberfläche freizusetzen, und überprüfen Sie die Ablösung unter einem Hellfeldmikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung.
- Stoppen Sie die Trypsinisierung mit 2,5 ml Astrozytenkulturmedium und sammeln Sie die Zellsuspension in 15 ml Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Astrozytenkulturmedium. Berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzählsystem.
- Basierend auf der Anzahl der Zellen verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischem Astrozytenmedium, um eine Lösung von 1-1,1 x 105 Zellen pro ml zu erhalten. Ergänzen Sie das Medium mit EGF und bFGF zu 10 ng/ml pro Faktor. 500 μL Zellsuspension, entsprechend 5-5,5 x 104 Zellen, zu jeder Vertiefung der zuvor präparierten 24-Well-Platten und Kulturzellen bei 37 °C und 5% CO2 hinzufügen.
6. Erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren
HINWEIS: Bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren, ist es wichtig, das Experiment richtig zu entwerfen. Insbesondere ist es wichtig, immer eine Negativkontrolle für die Neuprogrammierung einzubeziehen, nämlich eine Bedingung, bei der kein Reprogrammierfaktor ausgedrückt wird. Wenn zum Beispiel Vektoren verwendet werden, die die cDNA für den Reprogrammierungsfaktor und einen Reporter tragen (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP), DsRed), wird die Negativkontrolle durch denselben Vektor dargestellt, der nur den Reporter trägt. Bei der Angabe mehrerer Faktoren, die unterschiedliche Reporter tragen, sollte die Negativkontrolle entsprechend angepasst werden.
- Überprüfen Sie am Tag nach dem Plattieren die 24-Well-Platten, um sicherzustellen, dass die Zellen an den Deckgläsern haften.
- Basierend auf dem experimentellen Ziel und den verfügbaren Ressourcen kann die erzwungene Expression von Reprogrammierungsfaktoren durch virale Transduktion (siehe Schritt 6.3) oder DNA-Transfektion (siehe Schritt 6.4) erreicht werden.
HINWEIS: Die Verwendung von Retrovirus oder Lentivirus erfordert die Genehmigung von Regierungsbehörden und muss unter einer biologischen Sicherheitswerkbank in einem Labor mit Sicherheitsstufe 2 (SL2) durchgeführt werden. - Programmieren Sie die Astrozyten um, indem Sie die Zellen mit dem Retrovirus oder Lentivirus transduzieren, das die genetische Information trägt, um die interessierenden Reprogrammierungsfaktoren wie unten beschrieben auszudrücken.
- Transduzieren Sie Zellen mit einem hohen Virustiter von 1 x10 10-1 x10 12 Partikeln /ml, indem Sie 1 μL der Zellsuspension direkt in das Astrozytenmedium geben. Dies sorgt für eine hohe Infektionsrate. Kultivieren Sie die Zellen mit dem Astrozytenmedium, das Viruspartikel enthält, bei 37 °C für 24-36 h, bevor Sie je nach Zweck des Experiments mit Abschnitt 7 oder Abschnitt 8 fortfahren.
HINWEIS: Verschiedene Promotoren können verwendet werden, um die Expression der Transgene zu steuern (siehe auch Repräsentative Ergebnisse). Konstitutive Promotoren (z. B. CMV, CAG) induzieren die Expression des Transgens früher als induzierbare Promotoren; Beide Arten von Promotortypen wurden jedoch erfolgreich verwendet, um Zellen in Neuronen umzuprogrammieren.
- Transduzieren Sie Zellen mit einem hohen Virustiter von 1 x10 10-1 x10 12 Partikeln /ml, indem Sie 1 μL der Zellsuspension direkt in das Astrozytenmedium geben. Dies sorgt für eine hohe Infektionsrate. Kultivieren Sie die Zellen mit dem Astrozytenmedium, das Viruspartikel enthält, bei 37 °C für 24-36 h, bevor Sie je nach Zweck des Experiments mit Abschnitt 7 oder Abschnitt 8 fortfahren.
- DNA-Plasmide können auch über DNA-Transfektion in Astrozyten eingeführt werden, wie unten beschrieben.
HINWEIS: Dies kann unter einer für SL1 zugelassenen biologischen Sicherheitswerkbank erfolgen.- Vor der Transfektion erhalten Sie das Transfektionsreagenz, eine Plasmid-DNA der gewünschten Konstrukte, frisches Astrozytenmedium und serumreduziertes Medium (siehe Materialtabelle). Berechnen Sie die erforderliche Menge an serumreduziertem Medium (siehe Materialtabelle), indem Sie berücksichtigen, dass jede Vertiefung einer 24-Well-Platte 300 μL serumreduziertes Medium benötigt. Fügen Sie die entsprechende Menge an serumreduziertem Medium in ein 50-ml-Röhrchen hinzu und erwärmen Sie es auf 37 ° C.
- Wenn das serumreduzierte Medium warm ist, aspirieren Sie Astrozytenmedium aus allen Vertiefungen und sammeln Sie es in einer 50-ml-Röhre. Filtern Sie das gesammelte Astrozytenmedium mit einem 0,45 μM-Spritzenfilter, um abgelöste Zellen zu entfernen.
- Fügen Sie dem filtrierten Medium ein gleiches Volumen an frischem Astrozytenmedium hinzu, um eine Lösung zu erhalten, die ausreicht, um 1 ml Astrozytenmedium pro Vertiefung hinzuzufügen. Das astrozytenkonditionierte Medium im Inkubator wird bis zur Verwendung bei 37 °C gehalten (Schritt 6.4.9).
HINWEIS: Das Kulturmedium wird wiederverwendet, da es mehrere abgesonderte Faktoren enthält, die die Lebensfähigkeit der Kultur unterstützen. - Fügen Sie 300 μL vorerwärmtes serumreduziertes Medium zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die 24-Well-Platte zurück in den Inkubator.
- Bereiten Sie Lösung A vor, bestehend aus DNA und serumreduziertem Medium. Verwenden Sie für jede Vertiefung insgesamt 0,6 μg DNA und fügen Sie sie zu 50 μL serumreduziertem Medium hinzu. Lagern Sie Lösung A bei Raumtemperatur bis zur Verwendung.
HINWEIS: In der Regel wird ein technischer Triplikat pro Bedingung in Betracht gezogen. Daher wird eine Mischung hergestellt, die für eine 3,5-Reaktion ausreicht (z. B. 2,1 μg Gesamt-DNA, verdünnt in 175 μL serumreduziertem Medium), um sicherzustellen, dass genügend Material vorhanden ist, um drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu transfizieren. - Bereiten Sie Lösung B vor, die aus dem Transfektionsreagenz und dem serumreduzierten Medium besteht. Für jede Vertiefung werden 0,75 μL Transfektionsreagenz zu 50 μL serumreduziertem Medium hinzugefügt. Da diese Lösung allen Transfektionsbedingungen gemeinsam ist, bereiten Sie sie in großen Mengen vor, um die Variabilität zwischen Transfektionen zu reduzieren.
- Lösung B bei Raumtemperatur 5 min inkubieren. Geben Sie Lösung B zu Lösung A Tropfen für Tropfen im Verhältnis 1:1 und mischen Sie vorsichtig. Wirbeln Sie nicht. Inkubieren Sie die Lösung A+B für 20-30 min bei Raumtemperatur unter der Haube.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.4.5-6.4.7 für alle Transfektionsbedingungen. Nach 20-30 min geben Sie Lösung A + B zu jeder Vertiefung tropfenweise für ein endgültiges Volumen von 100 μL. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und legen Sie die Zellen für 4 h bei 37 °C zurück in den Inkubator.
- Nach 4 h wird das Transfektionsmedium entfernt und 1 ml des in Schritt 6.4.3 hergestellten vorerwärmten astrozytenkonditionierten Mediums zugegeben. Pflegen Sie die Zellen für 36-48 Stunden, bevor Sie mit Abschnitt 7 oder Abschnitt 8 fortfahren, abhängig vom Zweck des Experiments.
7. Reprogrammierung von Astrozyten (7-Tage-Analyse)
- Vorbereiten des neuronalen Differenzierungsmediums durch Zugabe von 1 ml B27-Ergänzung zu 49 ml Basiskulturmedium (siehe Schritt 1.4). Nach 24-48 h, je nachdem, ob Zellen transduziert oder transfiziert wurden (siehe Schritte 6.3 bzw. 6.4), ersetzen Astrozytenmedium durch 1 ml neuronales Differenzierungsmedium pro Well und Kulturzellen bei 37 °C und 9% CO2.
HINWEIS: Zellen können auch bei 5% CO 2 gehalten werden, wenn kein 9% CO2 Inkubator verfügbar ist. Die neuronale Reprogrammierung ist unter diesen Bedingungen jedoch effizienter. - Optional: Um die Reprogrammierungseffizienz zu erhöhen, ergänzen Sie das neuronale Differenzierungsmedium mit Forskolin (Endkonzentration von 30 μM) und Dorsomorphin (Endkonzentration von 1 μM), wenn das Astrozytenmedium durch das Differenzierungsmedium ersetzt wird. Wenn Sie sich für die Behandlung von Zellen mit Forskolin und Dorsomorphin entscheiden, geben Sie 2 Tage nach der Erstbehandlung eine zweite Dosis Dorsomorphin ab. Fügen Sie diese zweite Behandlung direkt dem Kulturmedium hinzu.
- Die direkte Reprogrammierung von murinen Astrozyten in neuronale Zellen erfolgt normalerweise innerhalb von 7 Tagen nach dem Wechsel des Mediums. Daher werden 7 Tage nach Beginn der neuronalen Reprogrammierung Zellen für die nachgelagerte Analyse fixiert oder gesammelt.
8. Umprogrammierung von Astrozyten in reife Neuronen (Langzeitkulturen)
- Vorbereiten des neuronalen Differenzierungsmediums durch Zugabe von 1 ml B27-Ergänzung zu 49 ml Basiskulturmedium (siehe Schritt 1.4). Nach 24-48 h, je nachdem, ob die Zellen transduziert oder transfiziert wurden (siehe Schritte 6.3 bzw. 6.4), ersetzen Sie das Astrozytenmedium durch 1 ml neuronales Differenzierungsmedium, ergänzt mit Forskolin (Endkonzentration von 30 μM) und Dorsomorphin (Endkonzentration von 1 μM) pro Vertiefung und Kulturzellen bei 37 °C und 9% CO2.
HINWEIS: Zellen können auch bei 5% CO 2 gehalten werden, wenn kein 9% CO2 Inkubator verfügbar ist. Die neuronale Reprogrammierung ist unter diesen Bedingungen jedoch effizienter. - Wiederholen Sie die Behandlung mit Dorsomorphin 2 Tage nach der Erstbehandlung, indem Sie es direkt in das neuronale Differenzierungsmedium geben.
- Nach 7 Tagen nach Beginn der neuronalen Reprogrammierung wird das Reifungsmedium durch Zugabe von 6 μL N2, 1,2 μL NT3 (Stamm 20 μg/ml), 1,2 μL BDNF (Stamm 20 μg/ml), 1,2 μL GDNF (Stamm 20 μg/ml) und 1,2 μL cAMP (Vorrat 100 mM) bis 189,2 μL neuronalem Differenzierungsmedium hergestellt. Ergänzen Sie das in jeder Vertiefung vorhandene neuronale Differenzierungsmedium mit 200 μL Reifungsmedium.
HINWEIS: Das Reifungsmedium wird nur für die erste Behandlung ergänzt. Alle nachfolgenden Behandlungen werden durchgeführt, indem das neuronale Differenzierungsmedium wie unten beschrieben teilweise ersetzt wird. - Wiederholen Sie die Behandlung mit kleinen Molekülen, indem Sie 200 μL neuronales Differenzierungsmedium entfernen und 200 μL frisches Reifungsmedium zweimal pro Woche für bis zu 6 Wochen hinzufügen. Verwenden Sie während der Reifung Zellen für elektrophysiologische Experimente (typischerweise am Tag 21 oder später) oder fixieren Sie sie für die nachgelagerte Analyse (z. B. Immunfluoreszenz).
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Representative Results
Primärkulturen von Astrozyten erreichen typischerweise zwischen 7 und 10 Tagen nach der MAC-Sortierung und -Beschichtung eine Konfluenz von 80% -90% (Abbildung 1B). Im Allgemeinen liefert ein einzelner T25-Kulturkolben etwa 1-1,5 x 106 Zellen, was für 20-30 Deckgläser ausreicht, wenn Zellen mit einer Dichte von 5-5,5 x 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät werden. Am Tag nach der Beschichtung bedecken die Zellen in der Regel 50 % bis 60 % der Deckglasoberfläche (Abbildung 1C). In diesem Stadium bestehen Kulturen fast ausschließlich aus Astrozyten, während andere Zelltypen, wie Neuroblasten, praktisch fehlen (Abbildung 1D)29.
Reprogrammierungsfaktoren können Astrozyten entweder durch retrovirale oder lentivirale Transduktion oder durch Transfektion von DNA-Plasmiden zugeführt werden. Normalerweise infiziert die virale Transduktion mehr Zellen als die Transfektion. Da die direkte neuronale Umwandlung einen erheblichen Zelltod verursacht34,35, wird die retrovirale oder lentivirale Transduktion bevorzugt, um die Anzahl der zu analysierenden Zellen zu maximieren. Verschiedene Promotoren können verwendet werden, um die Expression der Reprogrammierungsfaktoren zu steuern: konstitutiv (z. B. CMV, CAG) 15,32, induzierbar (z. B. Tet-responsive Elemente, Tet-ON)21 oder zelltypspezifisch (z. B. GFAP-Promotor) 36,37. Bei Verwendung konstitutiver oder zelltypspezifischer Promotoren beginnen Astrozyten innerhalb von 24 Stunden nach der Genabgabe nachweisbare Konzentrationen der Transgene zu exprimieren, die durch fluoreszierende Reporterexpression (z. B. GFP, DsRed) beurteilt werden, wobei jede Zelle unabhängig von den anderen ist. Umgekehrt ermöglichen induzierbare Promotoren, die Expression der Transgene über die transduzierten Zellen hinweg zu synchronisieren, da sie nach Zugabe eines kleinen Moleküls (z. B. Doxycyclin) zum Kulturmedium aktiviert werden. Detektierbare Werte der Transkriptionsfaktoren werden in der Regel 18-20 h nach der Aktivierung des Promotors erreicht. In den meisten Fällen wird der Höhepunkt der Reprogrammierungsfaktorexpression bei etwa 48 h erreicht, wobei die Lentivirus-vermittelte Expression etwas länger dauert.
Während transkriptionelle Änderungen nach der Expression von Reprogrammierungsfaktoren bereits ab 4 h 32 erkannt werden können, treten robuste Änderungen nach 24 h und später29,32 auf. Morphologische Veränderungen folgen auf transkriptionelle Veränderungen, und erste Anzeichen einer Konversion können etwa 3 Tage nach der Transduktion / Transfektion (3 DPT) beobachtet werden. Bei 7 DPT sind induzierte neuronale Zellen deutlich von Astrozyten zu unterscheiden: Ihr Soma ist kleiner als Kontroll- oder nicht umprogrammierte Astrozyten, sie haben lange Prozesse und sie sind positiv für den neuronalen Marker βIII-tub und sind negativ für den Astrozytenmarker GFAP (Abbildung 1E). Es ist jedoch erwähnenswert, dass einige Zellen entweder positiv für GFAP und βIII-tub sein können, was darauf hindeutet, dass das neuronale Programm induziert wurde, aber die Astrozytenidentität nicht gehemmt wurde, oder negativ für beide Marker, was auf die Unterdrückung der Astrozytenidentität, aber das Fehlen einer Induktion der neuronalen Kaskade hinweist. In beiden Fällen behalten die Zellen normalerweise eine Astrozytenmorphologie bei.
Für funktionellere Analysen, wie die Elektrophysiologie oder die Auswertung der erzeugten neuronalen Subtypen, werden Kulturen im Allgemeinen für ein Minimum von 21 DPT gehalten und mit Reifungsmedium behandelt. Bei 21 DPT sind viele induzierte Neuronen in der Lage, Aktionspotentiale abzufeuern und sind positiv für den reifen neuronalen Marker NeuN sowie für das pansynaptische Protein Synaptophysin29 (Abbildung 1F).
Abbildung 1: Überblick über Astrozytenkultur und Reprogrammierung . (A) Zeitleiste der direkten Umwandlung von Astrozyten in Neuronen. Jede schwarze Linie stellt einen wichtigen Schritt im Protokoll dar. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von kultivierten Rückenmarks-abgeleiteten Astrozyten nach 7 Tagen in Kultur. Die Bilder wurden mit einem Hellfeldmikroskop und einem 10-fachen Objektiv aufgenommen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 100 μm. (C) Repräsentative Hellfeldbilder von Rückenmarksastrozyten 1 Tag nach der Neuplattierung bei einer Dichte von 5,5 x 10 4 Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte. Die Bilder wurden mit einem Hellfeldmikroskop und einem 10-fachen Objektiv aufgenommen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 100 μm. (D) Immunfluoreszenzbild einer βIII-Wanne, Sox9, GFAP-Dreifachverfärbung auf Astrozyten, die 1 Tag nach der Beschichtung fixiert wurde, um die Reinheit der Kultur zu demonstrieren. Die Zellen wurden 10 min lang in 4% Paraformaldehyd fixiert und zweimal mit 1x PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit einer 3% BSA, 0,5% Triton-X 100 in 1x PBS-Lösung blockiert. Primäre Antikörper wurden in der richtigen Konzentration (z.B. Anti-GFAP 1:250; Anti-βIII-Wanne 1:250; Anti-Syp1 1:500) in Blocklösung verdünnt und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit 1x PBS gewaschen und mit fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläser wurden dreimal mit 1x PBS gewaschen, bevor sie mit Aqua Poly/Mount montiert wurden. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop und einem 40-fachen Objektiv aufgenommen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 20 μm. (E) Immunfluoreszenzbild einer βIII-Wanne, DsRed-Doppelfärbung zur Demonstration der Astrozyten-Neuronen-Umwandlung mit Ascl1 nach 7 DPT. Das Protokoll der Immunfluoreszenz und Bildaufnahme war wie oben beschrieben. Der Maßstabsbalken repräsentiert 20 μm. (F) Immunfluoreszenzbilder einer βIII-Tub, DsRed, Synaptophysin 1 (Syp1) Dreifachfärbung zum Nachweis der neuronalen Reife nach 21 DPT der Reprogrammierung mit Ascl1. Das Protokoll der Immunfluoreszenz und Bildaufnahme war wie oben beschrieben. Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Primärkulturen muriner Astrozyten sind ein bemerkenswertes In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der direkten neuronalen Reprogrammierung. Tatsächlich exprimieren Zellen, obwohl sie in einem postnatalen Stadium isoliert wurden, typische Astrozytenmarker 29, behalten die Expression von Mustergenen28,29 bei und behalten die Fähigkeit zur Proliferation bei, ähnlich wie in vivo Astrozyten im vergleichbaren Altervon 38 Jahren. Nach der MACS-vermittelten Isolierung haften die Zellen zunächst am Kolben und beginnen sich dann zu vermehren, wodurch hochangereicherte Astrozytenkulturen entstehen29. Wichtig ist, dass kultivierte Astrozyten weder in einen multipotenten Zellzustand dedifferenzieren noch unsterblich werden. Darüber hinaus erzeugen sie nach der Expression eines Reporterproteins (z. B. DsRed oder GFP) keine spontanen Neuronen, sondern behalten eine Astrozytenidentität bei. Außerdem vermehren sie sich nicht unbegrenzt, sondern verlangsamen ihre Proliferation und den Übergang in ein reiferes Stadium, was ihr direktes neuronales Reprogrammierungspotenzialverringert 32,39.
Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll: Erstens ist es wichtig, die interessierende Region sorgfältig zu isolieren und kontaminierendes Gewebe zu entfernen. Zum Beispiel, um Rückenmarksastrozyten vorzubereiten, wird das Rückenmark aus den Wirbeln extrahiert und die dorsalen Wurzelganglien (DRG) werden vorsichtig entfernt. Zweitens erfahren konvertierende Zellen einen signifikanten Zelltod34, der sich aufgrund der Stimulation der Phagozytose durch umgebende Astrozyten sowie der veränderten Medienosmolarität negativ auf die transduzierten Zellen und die Gesamtkultur auswirkt. Daher ist es wichtig, das Astrozytenmedium durch ein angemessenes Volumen des Differenzierungsmediums (normalerweise 1 ml/Well einer 24-Well-Platte) zu ersetzen. Darüber hinaus ist die Transfektion von Plasmid-DNA ein einfacher und zugänglicherer Ansatz im Vergleich zur viralen Transduktion, die einen zugelassenen Zellkulturraum der Sicherheitsstufe 2 erfordert. Die Transfektionsrate und die Reprogrammierungseffizienz sind jedoch im Vergleich zur viral vermittelten Bereitstellung der Reprogrammierungsfaktoren geringer. Daher kann die Transfektion als schnelle Methode verwendet werden, um das Reprogrammierungspotenzial neuer Kandidaten-Reprogrammierungsfaktoren zu testen oder um Pools von Faktoren zu screenen. In Bezug auf die neuronale Reifung werden reprogrammierte Zellen in der Regel nach etwa 3 Wochen elektrophysiologisch aktiv. Obwohl dies nicht erforderlich ist, erhöht die Behandlung der Zellen mit kleinen Molekülen sowohl das Überleben als auch die Reifung der reprogrammierten Zellen, was zu einer höheren Dichte der induzierten Neuronen und einer reiferen Morphologie führt.
Obwohl die beschriebene Methode zur Isolierung und Kultivierung von Astrozyten robust und zuverlässig ist, müssen einige Aspekte berücksichtigt werden. Erstens, während herkömmliche Methoden, die auf mechanischer Dissoziation von Gewebe basieren, eine insgesamt höhere Anzahl von Zellen in Kultur pro seziertem Gewebe40 ergeben, erfordert ein MAC-sortierter Ansatz die Dissektion von Gewebe von sechs bis acht Welpen, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für nachfolgende Experimente zu isolieren. Darüber hinaus basiert die Isolierung von Astrozyten auf der Expression des ATPase Na+/K+ transportierenden Beta2-Proteins (Atp1b2), das durch den Antikörper ACSA-241 erkannt wird. Im Prinzip würden Astrozyten, die Atp1b2 nicht exprimieren, in der Zubereitung verloren gehen, was zu einer Verzerrung in der Vorbereitung führen würde. Obwohl wir nicht ausschließen können, dass dies der Fall ist, ergab unsere Analyse des MACS-Durchflusses, dass nur wenige Zellen in der negativen Fraktion immunoreaktiv für die Astroglia-Marker Sox9 waren, was auf die hohe Effizienz des MAC-Sortierprotokolls hindeutet. Ein zweiter Vorbehalt in Bezug auf Atp1b2 bezieht sich auf seinen Ausdruck. Atp1b2 wird spezifisch von Astrozyten im postnatalen Stadium exprimiert, während im erwachsenen Gehirn der Maus andere Zelltypen es exprimieren, insbesondere myelinisierende Oligodendrozyten und ependymale Zellen27. Daher ist eine sorgfältige Sezierung des interessierenden Bereichs und ein Myelinentfernungsschritt erforderlich, um Astrozyten aus erwachsenen Gehirnen zu isolieren.
Im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolierung von Astrozyten gewährleistet der MACS-basierte Ansatz eine hohe Reinheit der Kulturen (>90% der Sox9+-Zellen) und bietet ein standardisiertes Verfahren zur Isolierung von Astrozyten aus verschiedenen Regionen des ZNS. Dies ist besonders wichtig beim Vergleich von Kulturen aus verschiedenen ZNS-Regionen, da die durch klassische mechanische Dissoziation erhaltene Kulturreinheit bemerkenswert variieren kann (>80% GFAP+/DAPI aus kortikaler grauer Substanz, ~50% GFAP+/DAPI aus Rückenmark)15,29. Ein standardisiertes Protokoll reduziert diese Variabilität und bietet einen gemeinsamen Ausgangspunkt für In-vitro-Reprogrammierungsexperimente. Dies ermöglicht es beispielsweise, die molekulare Identität von Astrozyten aus verschiedenen Regionen systematisch zu vergleichen28,29 und den Einfluss des Entwicklungsursprungs auf die Reprogrammierungseffizienz und die Subtypidentität der induzierten Neuronen zu untersuchen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die direkte neuronale Reprogrammierung optimierter Kulturen von Astrozyten in vitro ein sehr leistungsfähiger Ansatz ist, um sowohl universelle als auch regionsspezifische molekulare Mechanismen der Astrozyten-zu-Neuronen-Umwandlung zu entschlüsseln und wesentliche Informationen zu liefern, um bessere und effektivere Strategien für die direkte In-vivo-Umwandlung von residenten ZNS-Astrozyten zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Ines Mühlhahn für das Klonen der Konstrukte für die Neuprogrammierung, Paulina Chlebik für die virale Produktion und Magdalena Götz und Judith Fischer-Sternjak für die Kommentare zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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