Summary
Craniale vensters zijn een alomtegenwoordig geïmplementeerde chirurgische techniek geworden om intravitale beeldvorming bij transgene muizen mogelijk te maken. Dit protocol beschrijft het gebruik van een chirurgische robot die semi-geautomatiseerde botboringen van schedelvensters uitvoert en kan helpen de variabiliteit van chirurg tot chirurg te verminderen en thermische schade aan de bloed-hersenbarrière gedeeltelijk te verminderen.
Abstract
Craniale raamchirurgie maakt het mogelijk om hersenweefsel in levende muizen in beeld te brengen met behulp van multifotonen of andere intravitale beeldvormingstechnieken. Bij het uitvoeren van een craniotomie met de hand is er echter vaak thermische schade aan hersenweefsel, wat inherent variabel is van chirurgie tot operatie en afhankelijk kan zijn van de individuele chirurgtechniek. Het implementeren van een chirurgische robot kan de operatie standaardiseren en leiden tot een afname van thermische schade in verband met chirurgie. In deze studie werden drie methoden van robotboren getest om thermische schade te evalueren: horizontaal, punt voor punt en puntsgepulseerd punt voor punt. Horizontaal boren maakt gebruik van een continu boorschema, terwijl puntsgewijs verschillende gaten worden geboord die het schedelvenster omvatten. Gepulseerd puntsgewijs voegt een "2 s aan, 2 s uit" boorschema toe om koeling tussen het boren mogelijk te maken. Fluorescerende beeldvorming van Evans Blue (EB) kleurstof die intraveneus wordt geïnjecteerd, meet schade aan hersenweefsel, terwijl een thermokoppel dat onder de boorlocatie is geplaatst thermische schade meet. De resultaten van het thermokoppel wijzen op een significante afname van de temperatuurverandering in de gepulste punt-voor-punt (6,90 °C ± 1,35 °C) groep in vergelijking met de horizontale (16,66 °C ± 2,08 °C) en punt-voor-punt (18,69 °C ± 1,75 °C) groepen. Evenzo vertoonde de gepulseerde puntsgewijze groep ook significant minder EB-aanwezigheid na craniale raamboringen in vergelijking met de horizontale methode, wat wijst op minder schade aan bloedvaten in de hersenen. Een gepulseerde punt-voor-punt boormethode lijkt dus het optimale schema om thermische schade te verminderen. Een robotboor is een handig hulpmiddel om training, variabiliteit en thermische schade te minimaliseren. Met het toenemende gebruik van multifotonbeeldvorming in onderzoekslaboratoria is het belangrijk om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van resultaten te verbeteren. De methoden die hier worden behandeld, zullen anderen helpen informeren over hoe deze chirurgische robots beter kunnen worden gebruikt om het veld verder te ontwikkelen.
Introduction
Craniale vensters zijn alomtegenwoordig geworden op het gebied van neurowetenschappen, neurale engineering en biologie om directe visualisatie en beeldvorming van de cortex bij levende dieren mogelijk te maken 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . De krachtige combinatie van transgene muizen en multifotonenbeeldvorming heeft uiterst waardevolle inzichten opgeleverd in circuitactiviteit en andere biologische inzichten in de in vivo hersenen 12,13,14,15,16,17,18. Miniatuurmicroscopen die op de schedel zijn gemonteerd, hebben deze mogelijkheden verder uitgebreid om opnames mogelijk te maken bij wakkere, vrij bewegende dieren19. Het proces van het maken van een schedelvenster vereist krachtboren om het schedelbot te verdunnen of volledig te verwijderen om voldoende grote craniotomieën te produceren om een transparant stuk glas over de cortex20 te bevestigen. Polydimethylsiloxaan (PDMS) en andere polymeren zijn ook getest als craniale raammaterialen 9,21. Uiteindelijk is het ideale schedelvenster er een die de normale endogene activiteit eronder niet verandert of verstoort. Het is echter algemeen aanvaard dat craniale raamboringen het onderliggende weefsel verergeren, wat leidt tot schade aan de hersenen, verstoring van de omgeving en het beïnvloeden van hersenvliezen tot het punt van het afsluiten van multifotonbeelddiepte22. De resulterende neuro-inflammatie heeft een breed scala aan effecten, variërend van permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) tot activering en rekrutering van gliacellen rond de implantaatplaats23. Daarom is het karakteriseren van veiligere en meer reproduceerbare craniale raamboormethoden cruciaal voor een consistente beeldkwaliteit en het verminderen van verstorende factoren.
Hoewel er zorg wordt besteed aan het minimaliseren van trauma aan het onderliggende weefsel, heeft de handeling van het boren van het bot het potentieel om zowel thermische als mechanische verstoringen van de hersenen te veroorzaken24,25. Mechanisch trauma door toevallige boorpenetratie in de dura kan verder verschillende gradaties van corticale schade veroorzaken24. In een studie van Shoffstall et al.25 resulteerde de hitte van botboringen in een verhoogde BBB-permeabiliteit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van Evans Blue (EB) kleurstof in het hersenparenchym25. EB-kleurstof, intraveneus geïnjecteerd, bindt zich aan circulerend albumine in de bloedbaan en passeert daarom normaal gesproken geen gezonde BBB in merkbare concentraties. Als gevolg hiervan wordt EB-kleurstof vaak gebruikt als een gevoelige marker van BBB-permeabiliteit26,27. Hoewel hun studie niet direct de impact van de BBB-permeabiliteit op de daaropvolgende biologische sequelae in studie heeft gemeten, hebben eerdere studies BBB-permeabiliteit gecorreleerd aan een verhoogde neuro-inflammatoire respons op chronisch geïmplanteerde micro-elektroden en veranderingen in de motorische functie28.
Afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek kan de omvang van thermische en mechanische schade bijdragen aan een bron van experimentele fouten, die de strengheid en reproduceerbaarheid van het onderzoek negatief beïnvloeden. Er zijn tientallen aangehaalde methoden voor het produceren van schedelramen, elk met behulp van verschillende boorapparatuur, snelheden, technieken en gebruikers 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporteerden dat de waargenomen variatie in de verwarmingsresultaten werd toegeschreven aan variabiliteit in de uitgeoefende kracht, toevoersnelheid en toepassingshoek van de boor, naast andere aspecten die niet kunnen worden gecontroleerd bij het boren met de hand 25. Er is een overtuiging dat geautomatiseerde boorsystemen en andere stereotaxische apparatuur de reproduceerbaarheid en uitkomstconsistentie kunnen verbeteren, maar gepubliceerde methodestudies hebben de temperatuur of BBB-permeabiliteit niet rigoureus geëvalueerd als een van de uitkomsten. Daarom is er behoefte aan meer reproduceerbare en consistent toegepaste methoden om schedelvensters te produceren, evenals methoden die rigoureus worden toegepast om de impact van craniale raamboringen op onderliggend neuraal weefsel te beoordelen.
De focus van deze studie ligt op het bepalen en ontwikkelen van consistente en veilige boormethoden voor schedelramen. De grootte van de craniotomie voor craniale raaminstallatie is aanzienlijk groter dan standaard craniotomieën voor hersengeïmplanteerde micro-elektroden. Dergelijke craniotomieën kunnen niet worden voltooid met een enkel braamgat bij gebruik van standaardapparatuur, waardoor meer inter-chirurgentechniek variabiliteit wordt geïntroduceerd wanneer ze met de hand worden uitgevoerd20. Chirurgische boorrobots zijn geïntroduceerd in het veld, maar zijn niet op grote schaal toegepast 1,6,29. Automatisering van boren biedt controle over variabelen die bijdragen aan waargenomen trial-to-trial variatie, wat suggereert dat het gebruik van de apparatuur inter- en intra-chirurgeneffecten kan verminderen. Dit is van bijzonder belang gezien de extra moeilijkheid van de grotere craniotomie die nodig is voor het plaatsen van schedelvensters. Hoewel men zou kunnen aannemen dat er duidelijke voordelen zijn voor de controle die wordt geboden door het automatiseren van het boren, is er weinig beoordeling geweest van de implementatie van deze apparatuur. Hoewel er geen zichtbare laesies zijn waargenomen5, is de hogere gevoeligheidstest met EB gewenst.
Hier wordt de BBB-permeabiliteit gemeten met behulp van een in de handel verkrijgbare chirurgische boorrobot met bijbehorende software, die het mogelijk maakt om stereotaxische coördinaten, craniotomieplanning / mapping en een selectie van boorstijlen ("puntsgewijs" versus "horizontaal") te programmeren, verwijzend naar het gerouteerde pad van de boor. In eerste instantie worden acht "zaad" -punten geboord (figuur 1A), die het schedelvenster schetsen. Vanaf hier wordt de ruimte tussen de zaden uitgesneden met behulp van de "punt-voor-punt" of "horizontale" boormethode. "Point-by-point" voert verticale pilot hole cuts uit (vergelijkbaar met een CNC-boorpers), terwijl "horizontaal" horizontale sneden uitvoert langs de omtrek van het schedelvenster dat het gat omlijnt (vergelijkbaar met een CNC-router). Het resultaat voor beide methoden is een stuk schedel dat kan worden verwijderd om het schedelvenster te onthullen. Om schade door boren te isoleren, wordt het schedelvenster niet fysiek verwijderd, om extra schade te voorkomen. Een combinatie van EB-kleurstof in combinatie met fluorescerende beeldvorming wordt gebruikt om BBB-permeabiliteit te meten na het uitvoeren van craniotomieën bij muizen, en een ingebracht thermokoppel wordt gebruikt om de temperatuur van het hersenoppervlak tijdens het boren direct te meten (figuur 1B, C). Eerdere waarnemingen gaven aan dat gepulseerd boren aan/uit met 2 s intervallen voldoende was om boorverwarming25 te verminderen, en daarom is opgenomen in de experimentele aanpak voor de chirurgische robot.
De bedoeling van het gepresenteerde werk is om methoden te demonstreren voor het beoordelen van thermische schade door craniotomieboringen. Hoewel de methoden worden gepresenteerd in de context van geautomatiseerd boren, kunnen dergelijke methoden ook worden toegepast op handmatige boorschema's. Deze methoden kunnen worden gebruikt om het gebruik van apparatuur en/of boorschema's te valideren voordat ze als standaardprocedure worden aangenomen.
Figuur 1: Experimenteel pijplijnschema. Schematisch aantonen van het proces dat dieren ondergingen voor EB-kwantificering na de craniale vensterprocedure. (A) Schematische opstelling van de muis met het stereotaxische frame en de chirurgische robotboor. Een voorbeeld van een schedelvenster wordt getoond over de motorische cortex met zaadpunten (groen) en randpunten (blauw). (B) De perfusie-opstelling omvat het injecteren van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het hele dier om bloed te verwijderen, gevolgd door extractie van de hersenen. (C) De hersenen worden vervolgens in de EB fluorescerende beeldvormingssysteemkamer geplaatst om fluorescerende beeldvorming op de Evans Blue-kleurstof uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en dierverzorgingspraktijken werden beoordeeld, goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met het Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Installatie van chirurgische robothardware
- Volg vóór de operatie de handleiding en handleiding van de chirurgische robot (zie Materiaaltabel) om de hardware en software in te stellen. Voer framekalibratie uit zoals beschreven in de handleiding. Als de boor of het frame wordt verplaatst, wordt aanbevolen om de boor opnieuw te kalibreren om de nauwkeurigheid te garanderen.
2. Software voorbereiding
- Navigeer naar de chirurgische software (zie Materiaaltabel) en maak een nieuw project door Starten met een schoon project te selecteren. Stel het onderwerp bovenaan in als Muis om de te gebruiken boorcoördinaten aan te geven.
- Selecteer Nieuw project starten.
- Klik vanaf hier op Planning in de linkerbenedenhoek om naar het boorcoördinatenplanningsscherm te navigeren. Maak het boorschema voor de uit te voeren craniale raamtechniek.
- Klik hiervoor ergens op de stereotaxische atlas. Gebruik Bregma als referentie en voer de volgende coördinaten in voor de motorische cortex: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Druk op Enter op het toetsenbord om de geselecteerde coördinaten bij te werken.
OPMERKING: De Dorsal-Ventrale (DV) coördinaten geven de diepte van het boren aan en hebben hier dus geen invoer nodig. - Klik op Doel opslaan om deze coördinaten op te slaan en een juiste naam in te voeren. Klik vanaf hier op de knop Verplaatsen linksonder om terug te gaan naar het hoofdboorscherm.
- Klik hiervoor ergens op de stereotaxische atlas. Gebruik Bregma als referentie en voer de volgende coördinaten in voor de motorische cortex: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Druk op Enter op het toetsenbord om de geselecteerde coördinaten bij te werken.
- Klik op Extra > Project > Opslaan als om dit sjabloonproject opnieuw te gebruiken voor latere projecten. Hierdoor blijven de boorcoördinaten automatisch behouden voor later gebruik.
3. Voorbereiding op de operatie
- Verdoof PrismPlus muizen30,31 (zie Materiaaltabel) in een isofluraankamer (3,5% in 1,5 L/minØ 2). Breng oogglijmiddel aan om uitdroging van de ogen te voorkomen, scheer het hoofd met een tondeuse en knip de nagels om te voorkomen dat de muizen hechtingen uitkrabben.
OPMERKING: PrismPlus-muizen zijn een soort transgene fluorescerende soorten die worden gebruikt in multifotonenbeeldvorming. De heterozygote PrismPlus-muizen missen de fluorescerende genen en werden daarom hier gebruikt om dierlijk afval van andere lopende studies te verminderen, en omdat er geen multifotonenbeeldvorming in deze studie is. Van wild-type muizen wordt verwacht dat ze vergelijkbare resultaten laten zien. - Dien subcutane injecties van antibiotische cefazoline (24 mg / kg), analgetische carprofen (5 mg / kg) en buprenorfine (0,05-0,10 mg / kg) toe aan de verdoofde muizen. Dien voorafgaand aan een incisie een enkele subcutane injectie van marcaïne (0,25%, 100 μL) toe onder de incisieplaats (1 inch langs de middellijn van de schedel die achter de ogen begint).
OPMERKING: Medicijnen die hier worden gebruikt, volgen eerder vastgestelde IACUC-protocollen. Het wordt echter aanbevolen om EMLA-crème te overwegen als een actueel verdovingsmiddel voor een multimodaal effect vóór de operatie en staartaderinjectie, evenals Meloxicam SR in plaats van Carprofen. EMLA en Meloxicam SR kunnen worden verstrekt voorafgaand aan isofluraananesthesie. - Monteer het dier op het stereotaxische frame van de chirurgische robot, met behulp van meegeleverde oorbars, en handhaaf de anesthesie met 0,5% -2% isofluraan via inademing door een neuskegel.
- Zorg ervoor dat de anesthesiediepte nauwlettend wordt gecontroleerd door een getrainde dierenartstechnicus of personeel, op basis van de responsiviteit van de muis, ademhaling (~ 55-65 ademhalingen / min), hartslag (300-450 bpm) en kleur (roze). Snorharen en regelmatige teenknijp kunnen ook worden gebruikt als een maat om de diepte van de anesthesie te bepalen. De waarden van vitals worden bepaald door institutionele IACUC-voorschriften.
- Handhaaf de lichaamstemperatuur van dieren op een circulerend waterkussen en controleer vitale functies met behulp van een bloed-zuurstof- en hartslagmeetsysteem.
- Schrob het operatiegebied met chloorhexidinegluconaat (CHG) en 70% isopropanol voor sterilisatie. Om de steriliteit tijdens de operatie te behouden, plaatst u een steriele plastic folie over de muis en het stereotaxische frame.
OPMERKING: Hoewel deze protocollen zijn ontwikkeld voor overlevingsoperaties, weerspiegelen de gepresenteerde gegevens het gebruik van niet-overlevingsdieren, omdat de focus lag op het testen en bepalen van de juiste boorprotocolmethoden.
4. Schedelvoorbereiding
- Voer met behulp van een scalpelmes een incisie van 1 inch uit op de middellijn van de schedel, beginnend aan de achterkant van de ogen.
- Trek de huid naar achteren om de schedel bloot te leggen en gebruik (optioneel) retractors om het operatievenster te behouden. Verwijder eventueel achtergebleven weefsel en membraan met steriele applicatoren met katoenpunt.
- Droog en reinig de schedel met 3% waterstofperoxide met katoenen applicators.
OPMERKING: Hierdoor worden de hechtingen van de schedel zichtbaar. Bregma en Lambda moeten gemakkelijk te zien zijn. Zo niet, breng dan meer waterstofperoxide aan of vergroot de grootte van de incisie. - Zorg voor "auto-stop" -functionaliteit door de krokodillenklemkabel van de chirurgische robotbooropstelling aan de muis te bevestigen, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. "Auto-stop" werkt door een verandering in impedantie te detecteren, dus zodra de boor contact maakt met hersenvocht (CSF) in plaats van bot, zal de boor stoppen met boren, waardoor schade aan de hersenen wordt voorkomen.
5. Evans Blue staartader injectie
LET OP: EB is een mogelijk kankerverwekkende stof. Gebruik handschoenen bij het hanteren.
- Om de staart voor te bereiden op een gemakkelijke injectie, veegt u af met een alcoholdoekje. Optioneel kan wintergroene olie topisch worden aangebracht om de ader te verwijden35.
- Pak de staart in de ene hand terwijl u de spuit met EB in de andere hand hanteert. Buig met de duim en wijsvinger de staart om de staartader bovenop de bocht van de staart bloot te leggen. Plaats de spuit (1 of 2 ml, 30 g insulinespuit) parallel aan de ader en injecteer langzaam het volume EB. EB (4% m/v) wordt toegediend in een concentratie van 2 ml/kg lichaamsgewicht via staartaderinjectie.
OPMERKING: Minimale tot geen weerstand om van de spuit in de staart te stromen kan worden gevoeld als de naald correct is ingebracht. Als er weerstand is of EB-kleurstof in de staart verschijnt, ga dan naar beneden op de staart en probeer het opnieuw. - Wacht na het injecteren 5 minuten om EB door de muis te laten circuleren voordat het boren begint. Succesvolle injectie wordt onmiddellijk geverifieerd als de ledematen en het chirurgische venster van de muis blauw worden.
6. Chirurgische robot boorprocedure
- Zodra de schedel is voorbereid om te boren, navigeert u terug naar de chirurgische software. Open het sjabloonproject dat is gedefinieerd in stap 2.4 waarin de coördinaten voor het boren zijn aangegeven.
- Volg Tools > Project > New > Selecteer een sjabloonproject en kies het sjabloonproject dat is aangewezen in stap 2 (softwarevoorbereiding).
- Selecteer Dezelfde protocolelementen > Planning (doelpunten) > Boorparameters om over te dragen naar dit nieuwe project.
- Klik op Nieuw project starten.
- Corrigeer vervolgens de boor en het frame om rekening te houden met de kanteling en schaal van de muizenschedel van het huidige dier. Klik op Extra en selecteer Corrigeren voor Kantelen en Schalen... om het correctiescherm te openen. Zorg er bovenaan het scherm voor dat de boormachine actief is (niet de spuit), door op de lichtrode boorknop te klikken.
OPMERKING: Eenmaal geactiveerd, wordt de Drill-knop donker/felrood. De spuitknop kan worden genegeerd, omdat die in dit protocol niet wordt gebruikt.- Corrigeer eerst de Schaal, Toonhoogte en Geeuw door in te stellen waar Bregma en Lambda zich op het huidige dier bevinden. Gebruik de toetsenbordbediening of de bedieningselementen op het scherm om de boor te verplaatsen. Zodra de boor zich boven Bregma bevindt, laat je hem zakken totdat hij net de schedel raakt en klik je op Bregma instellen. Herhaal dit voor Lambda.
- Pas vervolgens aan voor de specifieke rol van de schedel. Klik op de knop Ga naar middelpunt om de boor automatisch naar het midden van de schedel aan te passen. Klik 2 mm naar links en laat de boor langzaam zakken totdat de schedel wordt aangeraakt. Klik op Linkerpunt instellen.
- Herhaal stap 6.2.2 voor de rechterkant van de hersenen. Nu is het systeem opgezet voor deze specifieke schedel.
OPMERKING: Correctie hier is van cruciaal belang om de juiste boorcoördinaten en diepte te garanderen. De muis moet zo dicht mogelijk bij het recht worden gemonteerd om de noodzaak van correctie zoveel mogelijk te verminderen. Als grote correcties nodig zijn, kan dit leiden tot een slechte nauwkeurigheid van het boren.
- Nadat de correctie is uitgevoerd, komt u uit het correctievenster door te klikken op Sluiten in het midden onderaan het scherm. Navigeer naar het boorscherm door te klikken op Gereedschap en selecteer vervolgens Boor... om de boorprocedure te starten.
- Zorg ervoor dat Craniotomie-Vorm is gekozen uit de vervolgkeuzelijst Drill boven aan het scherm. Klik vervolgens op Boorcentrum &-vorm selecteren en kies het vooraf gedefinieerde doel dat in stap 2.3.1 is benoemd. Selecteer onder dit scherm Cirkel als de vorm voor het doel en voer 2,60 mm in als de diameter2 van de cirkel. Klik op Weergeven.
OPMERKING: De diameter van het schedelvenster wordt gemaakt met behulp van het midden van de boor als het midden van de zaadpunten. Een kleine boor (diameter = 0,6 mm of de aanbevolen bitgrootte die door de leverancier wordt verstrekt) wordt gebruikt om de extra diameter die wordt toegevoegd als gevolg van het gebruik van een grotere boor te minimaliseren. Speciale boren worden specifiek gebruikt voor de chirurgische robot. De acht zaadpunten en randpunten verschijnen nu op de schedel als respectievelijk groene en blauwe stippen. - Klik op het hoofdvenster en gebruik de sneltoets Control + Shift + D om het menu Drill Points aan de rechterkant van het scherm te openen. Dit maakt het mogelijk om specifieke boorpuntdieptes en statussen te bekijken.
- Voordat het boren begint, past u indien nodig de auto-stop-functie aan door op de knop naast het selectievakje Auto-Stop te klikken. Deze knop is standaard ingesteld op Gemiddeld, wat overeenkomt met de gevoeligheid voor de auto-stopfunctie.
LET OP: Dit kan vooraf getest worden om de juiste gevoeligheid voor de dieren te vinden. In dit protocol werd de hoogste gevoeligheid gebruikt om te zorgen voor minimale boringen door de hersenen. - Zodra de auto-stop-functie is ingeschakeld en aangepast, begint u met het boren van het seed-punt. Klik op Automatisch scannen zodat de drill automatisch begint bij Seed 1. Zodra de boor de liquor raakt, detecteert de auto-stop-functie een verandering in de impedantie, wat leidt tot een onderbreking in het boren en intrekken van het bit uit de schedel.
- Houd het boren goed in de gaten voor het geval de auto-stop geen wijzigingen detecteert. De Escape-toets kan worden ingedrukt om het boren handmatig te annuleren. De roze cirkel onder aan het menu Drill en rechts van de impedantiewaarden kan ook worden aangeklikt om het boren te starten of te stoppen.
OPMERKING: De boor boort automatisch tot een diepte die gelijk is aan de geschatte schedeldikte (of totdat de auto-stop-functie is geactiveerd). - Als auto-stop niet is geactiveerd voordat de geschatte diepte is bereikt, verschijnt er een scherm waarin de gebruiker wordt gevraagd om: 1) door te gaan met boren en dalen # mm verder, 2) Markeer op de huidige diepte en ga door, 3) Sla het huidige punt over en ga door, of 4) Stop het proces (kan later worden voortgezet). Kies een van de opties zoals hieronder beschreven.
- Voer voor Doorgaan met boren en # mm verder afdalen een afstand in voor de boor om verder te gaan. Standaard wordt 0,1 mm gebruikt. Een kleinere afstand kan worden voorgesteld om onbedoelde penetratie van de hersenen te voorkomen.
- Als wordt aangenomen dat de dura op dit scherm is bereikt, selecteert u de optie Markeren op huidige diepte en doorgaan voor het systeem om de dura op die diepte te markeren en door te gaan naar het volgende zaad.
- Gebruik het huidige punt overslaan en doorgaan en Stop het proces (kan later worden voortgezet) om problemen met de boor op te lossen of schoon te maken en terug te keren zodra de automatische stop weer werkt.
- Zodra alle zaadpunten zijn geboord, als ze niet klaar zijn met de auto-stop-functie, controleert u de diepte van het gat handmatig met behulp van een dura-pick. Dit zal ervoor zorgen dat de geboorde diepte wel door de schedel is doorgedrongen.
- Voordat u begint met het boren van randpunten, bepaalt u welk type 'randsnede' gewenst is door de vervolgkeuzelijst naast de tekst Randsnede in het menu Inzoomen te selecteren. De twee opties zijn puntsgewijs en horizontaal.
- Selecteer puntsgewijs om elk randpunt afzonderlijk in te zoomen en op een diepte die wordt bepaald door de aangrenzende beginpuntdiepten. Pas de schaling indien nodig aan via de knop Randschaling... hieronder, hoewel de standaardinstelling Geen schalen meestal voldoende is.
- Selecteer Horizontaal om te beginnen met boren bij randpunt 1 en gebruik een continue boorbeweging om rond de gehele omtrek van de boorcirkel te gaan. Standaard snijdt de horizontale snede met intervallen van 100 μm, helemaal rond de omtrek van het venster voordat hij nog eens 100 μm dieper gaat. Wijzig indien nodig de intervaldiepte en boorsnelheid onder de knop Snijopties... hieronder.
- Gebruik de automatisch gesneden verschuiving (onder het vak Randsnede ) om de automatisch gesneden diepte aan te passen door een vooraf bepaalde verschuiving te nemen van de aangrenzende zaadpunten. In dit protocol werd een auto-cut offset van 20 μm gebruikt. Verdere tests kunnen worden uitgevoerd om een optimale compensatie per dier te bepalen.
- Zodra de instellingen voor het snijden van randen zijn bepaald, begint u met het boren van randpunten door op de knop Automatisch knippen in het midden van het menu Inboren te klikken. Voor puntsgewijs boren is de boorprocedure, zodra de laatste rand is geboord, voltooid. Ga voor horizontaal boren door totdat er voldoende schedel is geboord om het schedelvenster los te maken.
OPMERKING: Hoewel er wordt geboord totdat het venster kan worden vrijgegeven, wordt het venster hier niet fysiek vrijgegeven om schade aan het onderliggende weefsel te voorkomen. Het is belangrijk om de schade als gevolg van alleen boren te isoleren om verschillende boorschema's te evalueren.- Zodra de horizontale boring de diepte van één zaadpunt heeft bereikt, klikt u met de rechtermuisknop op dat zaad (of selecteert u eerst meerdere punten) in het menu Borenpunten en klikt u op Diepte vergrendelen. Hierdoor kan horizontaal snijden doorgaan zonder dieper te snijden voor dat gebied (waardoor wordt voorkomen dat de hersenen worden binnengedrongen).
OPMERKING: Als er zaaipunten zijn met verschillende duradiepten, kan dit verschillen veroorzaken in de diepte die nodig is voor de horizontale boorprocedure.
- Zodra de horizontale boring de diepte van één zaadpunt heeft bereikt, klikt u met de rechtermuisknop op dat zaad (of selecteert u eerst meerdere punten) in het menu Borenpunten en klikt u op Diepte vergrendelen. Hierdoor kan horizontaal snijden doorgaan zonder dieper te snijden voor dat gebied (waardoor wordt voorkomen dat de hersenen worden binnengedrongen).
- Als de auto-stop-functie niet correct werkt, zorg er dan voor dat de boor volledig schoon is van vuil of mogelijk bloed, zoutoplossing, enz., Omdat deze de basisimpedantie van de bit kunnen beïnvloeden. Kies bovendien uit een van de verschillende handmatige booropties die hieronder worden beschreven voor het geval de automatische stop niet consistent werkt.
- Navigeer in het menu Drill handmatig naar elk zaadje door met de rechtermuisknop op het zaad of de rand te klikken en Ga naar item te kiezen. Er zijn ook opties om de gemarkeerde diepten vrij te maken, het gat opnieuw in te stellen en andere opties die kunnen helpen bij de boorprocedure.
- Regel handmatig de voortgang van de boordiepte door een diepte te selecteren in de vervolgkeuzelijst naast de tekst Geavanceerd: boven aan het menu Inzoomen. Klik op de knop Geavanceerd direct hieronder om de oefening de ingestelde afstand te vergroten.
OPMERKING: Deze functie kan worden gebruikt in combinatie met de knoppen Dura instellen en Oppervlak instellen onder de knop Geavanceerd om het systeem handmatig te vertellen waar zowel het oppervlak van de schedel als de dura zich bevinden. Gebruik waar mogelijk de auto-stop functie, maar indien nodig volstaan ook deze handmatige opties. - Als u handmatig boort, wees dan voorzichtiger tussen elk boordiepte-interval om ervoor te zorgen dat de boor de dura niet overschrijdt. Controleer het geboorde gat met behulp van een dura-pick tussen de diepte-intervallen om te bevestigen of de dura is bereikt. Zodra alle handmatige zaadboringen zijn voltooid, gaat u verder met de procedure voor het snijden van randen zoals hierboven beschreven.
- Pulsmethode
- Om handmatige pulsboringen uit te voeren, schakelt u de auto-stop-functie uit door het selectievakje naast de optie Auto-Stop in het menu Drill uit te schakelen. Dit moet zijn uitgeschakeld om te kunnen controleren wanneer de boor is uitgeschakeld voor het pulseren.
OPMERKING: Pulsboren volgt een patroon van 2 s boren gevolgd door 2 s niet boren om de schedel te laten afkoelen. - Selecteer in het menu Boren 100 μm als de boordiepte vooruit, dit komt overeen met ~ 2 s van neerwaartse boringen.
- Als u klaar bent, klikt u op Advance (Vooruit) om te beginnen met boren.
OPMERKING: Wees klaar om de boor snel te stoppen zodra deze 100 μm vooruit is gegaan, omdat de boor op de diepte blijft draaien totdat de ontsnapping wordt ingedrukt (waardoor onnodige warmte wordt gegenereerd). - Zodra de boor 100 μm is gevorderd, drukt u tweemaal op Escape om de boor te stoppen. Herhaal na 2 s deze cyclus voor de diepte van de schedel.
OPMERKING: Alleen de puntsgewijze methode kan worden uitgevoerd met behulp van de gepulseerde methode vanwege software- en mechanische beperkingen. Continu horizontaal boren kan niet op deze manier worden uitgevoerd. - Boor alle zaad- en randpunten met behulp van deze hierboven beschreven methode. Zorg ervoor dat u Dura instelt met behulp van de knop in het boormenu zodra de dura is bereikt.
- Om handmatige pulsboringen uit te voeren, schakelt u de auto-stop-functie uit door het selectievakje naast de optie Auto-Stop in het menu Drill uit te schakelen. Dit moet zijn uitgeschakeld om te kunnen controleren wanneer de boor is uitgeschakeld voor het pulseren.
- Zorg ervoor dat Craniotomie-Vorm is gekozen uit de vervolgkeuzelijst Drill boven aan het scherm. Klik vervolgens op Boorcentrum &-vorm selecteren en kies het vooraf gedefinieerde doel dat in stap 2.3.1 is benoemd. Selecteer onder dit scherm Cirkel als de vorm voor het doel en voer 2,60 mm in als de diameter2 van de cirkel. Klik op Weergeven.
7. Perfusie en hersenextractie
- Zodra het boren van het zaad en de randpunten is voltooid, houdt u het dier nog eens 1 uur onder isofluraananesthesie om de EB-kleurstof te laten circuleren en extravaseren door de beschadigde BBB. Voer hartperfusie uit om bloed of vloeistoffen uit de bloedvaten te verwijderen en verwijder vervolgens de hersenen voor beeldvorming en analyse zoals hieronder beschreven.
- Na de 1 h EB-circulatieperiode na het creëren van het schedelvenster, injecteert u een cocktail van ketamine (160 mg / kg) en xylazine (20 mg / kg) intraperitoneaal in het dier. Zodra u niet meer reageert, voert u een hartperfusie uit.
- Knip de buik van de muis open met een schaar en leg het hart bloot door verticaal door de ribbenkast en horizontaal over het middenrif te snijden. Trek de ribbenkast in om het hart duidelijk te zien. Steek een vlindernaald in de linker ventrikel van het hart en begin met het inbrengen van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door het hele lichaam. Knip een klein deel van het rechter atrium van het hart om de drukopbouw los te laten.
- Nadat 25 ml 1x PBS door het hele lichaam is doorgedrongen, stopt u de perfusie en onthoofdt u de muis als secundair euthanasiemiddel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de institutioneel goedgekeurde methode van euthanasie en / of eindpuntperfusie uitvoert voor het dier om de hersenen te isoleren. - Haal vanaf hier de hersenen uit de schedel door het bot en weefsel met rongeurs te verwijderen.
- Stel de geëxtraheerde hersenen voor met een fluorescerend beeldvormingssysteem om de hoeveelheid EB in de hersenen rond de boorlocaties te observeren.
OPMERKING: EB bindt aan circulerend albumine. Als vasculaire schade optreedt in de hersenen, zal EB uitlekken en zich binden aan het hersenweefsel, wat leidt tot een duidelijke visuele indicator van schade.
8. Evans Blue beeldvorming en analyse
- Hardware initialisatie
- Schakel de computer in die is aangesloten op het EB-fluorescentiebeeldvormingssysteem en start de beeldbewerkingssoftware (zie Materiaaltabel) terwijl andere items worden voorbereid. Schakel de lichtbron, het platform en de camera in, in die volgorde.
- Navigeer naar de beeldbewerkingssoftware en klik op Initialiseren onder het configuratiescherm voor acquisitie. Het systeem en de kamer geven een signaal van rood naar groen zodra de initialisatie is voltooid.
OPMERKING: Initialiseer het EB fluorescerende beeldvormingssysteem 30 minuten voorafgaand aan elke beeldvorming om de temperatuur van de lichtbron optimale niveaus te laten bereiken.
- Beeldvorming van de hersenen
- Plaats de geëxplanteerde hersenen in een heldere schaal in het midden van het podium voor beeldvorming.
- Pas onder het Configuratiescherm Acquisitie de instellingen voor de afbeelding aan. Selecteer de belichtingstijd: 1 s; Binning: Gemiddeld; F / Stop: F1; Excitatie: 535 tot 675 nm; Emissie: Cy 5.5; Lampniveau: Hoog; en FOV: 5 cm. Laat het filter vergrendeld en de overlay van fotografie en fluorescentie gecontroleerd. Deze instellingen zijn gebaseerd op eerdere laboratoriumervaring en andere gepubliceerde methoden voor het in beeld brengen van EB36.
- Laad EB fluorescerende beeldvormingssysteembeelden in open access beeldverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen) en genereer drie interessegebieden uit de vrije hand (ROI's) om de fluorescerende intensiteit van EB te vinden door de gemiddelde uitstraling over de achtergrond, het hele brein en het schedelvenster te meten.
- Normaliseer het schedelvenster en de metingen van de hele hersenen tegen de overeenkomstige ROI op de achtergrond.
- Beeld elk brein onder verschillende excitatiefilters (535-675 nm) om de golflengte te vinden met de hoogste signaal-ruisverhouding (605 nm werd gekozen) tussen de experimentele groepen tot de zoutoplossingscontrole.
- Isoleer de gemiddelde straling onder de juiste golflengte en het gemiddelde om de gemiddelde gemiddelde straling of fluorescerende intensiteit voor de ROI's van de hele hersenen en het schedelvenster te verkrijgen.
- Zoek en normaliseer de gemiddelde gemiddelde uitstraling over het schedelvenstergebied voor elke groep tegen de zoutoplossingscontrole.
9. Evaluatie van het thermokoppel
- Meet de veranderingen in temperatuur van de schedel en hersenen met behulp van een thermokoppel (zie materiaaltabel) in combinatie met de drie verschillende boorschema's. Het thermokoppel is aangesloten op een data-acquisitiesysteem (DAQ) waarmee de meting in MATLAB kan worden ingelezen.
- Monteer een kadavermuis op het stereotaxische frame en de robotbooropstelling. Boor handmatig een klein gaatje (even groot als zaadpunt) ~ 2 mm verwijderd van waar het schedelvenster in de zijkant van de schedel wordt gemaakt25. Met dit gat kan het thermokoppel in positie worden geschoven waar het schedelvenster wordt geboord (figuur 2D).
OPMERKING: Kadavermuizen worden gebruikt omdat het openboren van de zijkant van de schedel nodig is om het thermokoppel over het boorgebied van het schedelvenster te schuiven. Deze kadavermuis is een ander dier dan het dier dat eerder werd gebruikt voor Evans Blue-analyse. - Begin het boorproces voor elk van de drie schema's zoals eerder gedaan (stap 6). Terwijl de boor door de schedel gaat, zullen er pieken in temperatuurverandering zijn, wat wijst op verwarming in de buurt van de hersenen.
- Registreer en plot de resultaten in MATLAB om het maximale temperatuurverschil te berekenen. Dit moet afzonderlijk worden gedaan voor het zaaien en het randboren om horizontaal versus puntsgewijs boren te evalueren, samen met de gepulseerde handmatige boormethode.
10. Statistieken
- Voer statistische analyse uit voor thermokoppel en EB fluorescerende beeldvorming in R met behulp van een Kruskal-Wallis rangsomtest met Benjamini-Hochberg-correctie gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen met behulp van de Wilcoxon rangsom exacte test25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermische evaluatie
Het potentieel voor thermische schade werd geëvalueerd door de temperatuurverandering ten opzichte van de basislijn te meten als gevolg van boringen met behulp van horizontale (figuur 2A), puntsgewijze (figuur 2B) en gepulseerde puntsgewijze (figuur 2C) methoden. Figuur 2D toont de experimentele opstelling voor het verkrijgen van thermische gegevens. Voor thermische evaluatie werd een steekproefgrootte van N = 4 schedelvensters gebruikt. Horizontaal en puntsgewijs gebruiken hetzelfde zaadboorschema, maar variëren afhankelijk van hoe de randpunten worden gesneden. Gepulseerd puntsgewijs maakt gebruik van een gepulseerde methode voor zowel zaad- als randboorgedeelten. Voor de horizontale methode vertoonde zaadboringen een maximale temperatuurverandering van 16,66 °C ± 2,08 °C, terwijl randboringen 9,08 °C ± 0,37 °C vertoonden. Voor de puntsgewijze methode toonde zaadboringen een maximale temperatuurverandering van 18,69 °C ± 1,75 °C, terwijl randboringen 8,53 °C ± 0,36 °C vertoonden. Voor de gepulseerde puntsgewijze methode vertoonde zaadboringen een maximale temperatuurverandering van 6,90 °C ± 1,35 °C, terwijl randboringen 4,10 °C ± 0,51 °C vertoonden. Zowel de horizontale als de puntsgewijze boorschema's vertonen niet-significante verschillen voor thermische veranderingen. Het overschakelen naar een gepulseerde punt-voor-puntmethode resulteerde echter in aanzienlijk minder verwarming (p < 0,05) van de hersenen dan zowel horizontaal als puntsgewijs boren (figuur 2E, F). De duur van de operatie werd ook geregistreerd, omdat dat van invloed kan zijn op de overlevingskansen van dieren voor levende operaties. Voor beide geautomatiseerde methoden duurde het zaaien gemiddeld 360 s. Horizontaal randboren duurde 300 s, terwijl puntsgewijs randboren 200 s duurde. De gepulseerde methode duurde het langst, met zaad- en randboringen die elk ongeveer 500 s duurden. Niettemin zijn deze verschillen niet groot genoeg om enige overweging te rechtvaardigen, omdat operaties meestal meer dan 2-3 uur kunnen duren.
Figuur 2: Thermische evaluatie. Het potentieel voor thermische schade werd geëvalueerd op basis van maximale temperatuurveranderingen in de hersenen als gevolg van boormethoden. (A) Horizontaal boren en (B) punt-voor-punt boren genereerden vergelijkbare hoeveelheden warmte, terwijl (C) een gepulseerde 2 s aan, 2 s uit punt-voor-punt methode minimale verwarming vertoonde. (E) Zaadboringen en (F) randboringen resulteerden in aanzienlijk minder thermische verandering in de gepulseerde puntsgewijze boormethode (p < 0,05, N = 4 per toestand). (D) Het thermokoppel wordt onder de schedel van het muizenkadaver geplaatst waar het boren wordt gedaan. Gegevens worden verkregen via een DAQ en ingevoerd in een computer voor analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vasculaire schade
Figuur 3 geeft de relatie weer tussen boorschema en vasculaire schade. Tabel 1 geeft de p-waarde voor elk boorschema weer na statistische analyse zoals aangegeven in stap 10. Een steekproefgrootte van N = 4 per groep werd gebruikt voor eb-kleurstofevaluatie. De aanwezigheid van een hogere hoeveelheid EB is een directe indicator van schade aan de BBB, waarvan de puntsgetrouwe, horizontale en gepulste boormethoden aanzienlijk groter zijn dan die van de controle (allemaal met p = 0,043; Tabel 1). De puntsgewijze methode laat geen significant verschil zien in termen van EB-aanwezigheid ten opzichte van de horizontale boring (p = 0,411). Beide schema's gebruikten de auto-stop-functie om te voorkomen dat ze in de hersenen boren; Deze auto-stop functie slaagde er echter vaak niet in om schade te voorkomen. Dit falen van auto-stop in het gedeelde zaadboorgedeelte kan onbekende overtollige schade hebben veroorzaakt, waardoor het onderscheid tussen de technieken wordt bemoeilijkt. Daarom werd een paarsgewijze vergelijking met een gepulseerde puntsgewijze methode zonder automatische stop uitgevoerd om de andere twee methoden te evalueren zonder automatische stop op te nemen. Er was geen significant verschil wanneer gepulseerde punt-voor-punt werd vergeleken met punt-voor-punt (p = 0,486), terwijl de gepulste punt-voor-punt methode significant minder EB-aanwezigheid had dan de horizontale methode (p = 0,043). Niet-significantie tussen gepulseerde punt-voor-punt en punt-voor-punt methoden kan worden toegeschreven aan de grote variatie in punt-voor-punt boren (figuur 4).
Figuur 3 toont representatieve beelden van zowel horizontaal (figuur 3C) als puntsgewijs (figuur 3D) boren met de juiste auto-stop functies. Visueel, en door middel van EB fluorescerende beeldvorming, bleek boren via punt-voor-punt en horizontaal snijden schadelijk te zijn voor de vasculatuur in de hersenen in vergelijking met controlegroepen (figuur 3A, B). De gepulseerde punt-voor-punt-methode (figuur 3E) had minder gelokaliseerde schade aan het zaad- en randpunt, maar had nog steeds zichtbare EB-aanwezigheid in het schedelvenster.
Figuur 3: Vasculaire schade. EB-fluorescentiebeelden van geëxplanteerde hersenen (1) en bijbehorende ROIs (2) worden gebruikt om de gemiddelde uitstraling te bepalen van het gebied dat wordt beïnvloed door craniale venstercraniotomie. (A) De muis werd geïnjecteerd met EB zonder craniale vensterchirurgie om eb-aanwezigheid op de achtergrond van de hersenen in de hersenvasculatuur te verkrijgen. (B) De muis werd alleen met zoutoplossing geïnjecteerd en er werd een craniale venstercraniotomie uitgevoerd. Hieruit bleek dat de gemiddelde straling die werd gemeten werd toegeschreven aan de EB-accumulatie als gevolg van lekkende bloedvaten en vasculair trauma in de buurt van de plaats van het schedelvenster. (C) De muis werd geïnjecteerd met EB en het schedelvenster werd gecreëerd door de horizontale methode van automatisch boren. (D) De muis werd geïnjecteerd met EB en het schedelvenster werd gecreëerd door de puntsgewijze methode van automatisch boren. (E) Twee representatieve beelden van schedelvenster geproduceerd met de punt-voor-punt gepulseerde boormethode nadat de muizen (n = 2) met EB waren geïnjecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Visuele inspectie van schade
Visuele inspectie van de hersenen toont fysieke schade aan het oppervlak van de hersenen (figuur 4). De panelen A-D tonen de EB-aanwezigheid van de horizontale boring, panelen E-H de puntsgewijze methode en de panelen I-L zijn de gepulseerde puntsgewijze methode. "Point-by-point" voert verticale pilot hole cuts uit, terwijl "horizontaal" horizontale sneden uitvoert langs de omtrek van het schedelvenster dat het gat omlijnt. De "gepulseerde punt-voor-punt" maakt gebruik van dezelfde methoden als de punt-voor-punt zonder het gebruik van de auto-stop-functie, en is afhankelijk van de gebruiker die het boren stopt bij ingestelde stappen van diepte. Hoewel er een methode is gevonden die de hoeveelheid thermische schade aan de hersenen minimaliseert, is er nog steeds het probleem van mechanische schade door de boor. Idealiter zou een auto-stop-functie die CSF detecteert en stopt met boren voordat hersenweefsel wordt beschadigd, hier werken, maar leek niet consistent te werken. Zelfs met uiterste zorg bij gepulseerd handmatig boren, was er nog steeds visuele schade aan de hersenen. Dit kan het gevolg zijn van twee factoren: 1) het gebrek aan controle en gevoel dat gepaard gaat met handboren en 2) de scheidingsdiepte tussen de schedel en de hersenen voor een klein dier zoals een muis. Handboren kan een meer gecontroleerde methode bieden om door de schedel te komen zonder de hersenen te beschadigen met voldoende oefening en expertise. Er is echter veel hogere vaardigheid en training nodig in vergelijking met een plug-and-play robot, waardoor verschillende "chirurgen" kunnen bijdragen aan dezelfde studie - geen gangbare praktijk op het gebied van intracorticale micro-elektroden. Bij muizen is de afstand tussen de hersenen en de schedel extreem dun, dus zelfs de geringste overboor van 10 μm kan leiden tot mechanische schade aan de hersenen.
Figuur 4: Visuele inspectie van schade. Digitale beelden van alle hersenen verkregen voor visuele inspectie en representatie voor elk van de drie boormethoden. (A-D) Horizontaal vertoonde consequent schade rond het schedelvenster, hetzij door mechanische of thermische schade. (E-H) Punt-voor-punt vertoonde aanzienlijke variatie in resultaten, wat wijst op een minder betrouwbare methode voor boren. (I-L) Gepulseerd punt-voor-punt was consistenter en vertoonde minder visuele schade dan de andere methoden, overeenkomend met de verschillen in EB-fluorescerende analyse en thermokoppelresultaten. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Horizontaal | Punt | Gepulseerde | Beheersen | |
| Horizontaal | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| Punt | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| Gepulseerde | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
Tabel 1: Statistische analyse van eb fluorescerende beeldvormingsresultaten. Resultaten van het EB fluorescerende beeldvormingssysteem voor verschillende boortechnieken werden geanalyseerd met behulp van een Kruskal-Wallis rank sum test met Benjamin-Hochberg correctie gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen met behulp van de Wilcoxon rank sum exacte test (N = 4 per groep). Significante verschillen tussen groepen worden aangegeven met een sterretje *.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van EB-kleurstof en beeldvorming is eenvoudig, snel en nuttig voor het evalueren van vasculaire schade in de hersenen voor nieuwe methoden en technieken. Of het nu gaat om het gebruik van een chirurgische robot of het bevestigen van methoden die momenteel in het laboratorium worden gedaan, het is belangrijk om chirurgische methoden te valideren om de effecten van experimentele behandelingen versus chirurgische impact te isoleren en het dierenwelzijn te verbeteren. Een thermokoppelopstelling is ook nuttig bij het evalueren van boormethoden om ervoor te zorgen dat er geen verwarming optreedt. Van temperatuurstijgingen als gevolg van botboringen is bekend dat ze weefselschade veroorzaken, en zelfs een toename van 5 °C is voldoende om grote vasculaire schade in de hersenen te veroorzaken 32,33,34,35,36. Het wordt aanbevolen om de hier beschreven methoden te gebruiken om laboratorium- en chirurgische technieken te verbeteren.
Hoewel nuttig voor evaluatie, heeft thermokoppelevaluatie een paar beperkingen. Thermokoppelgegevens worden verkregen met behulp van kadavermuizen vanwege de noodzaak om een gat in de zijkant van de schedel te boren om het thermokoppel in de hersenen te passen en mogelijke schade aan de hersenen als gevolg daarvan. Als gevolg hiervan wordt het temperatuurverschil gemeten tijdens het boren in plaats van de fysiologische temperatuur van het dier. Bovendien kunnen er fysiologische temperatuurregulatiefuncties zijn die niet in de analyse zijn opgenomen.
Verschillende stappen tijdens het protocol zijn van cruciaal belang om een goede boring te garanderen. Ten eerste zal de uitlijning van de schedel, indien verkeerd uitgevoerd, leiden tot een slechte boornauwkeurigheid samen met schade aan de hersenen (als auto-stop niet werkt). Zorg ervoor dat de montage van het dier zo recht mogelijk is voordat u kantelt om dit probleem te voorkomen. Corrigeer eventuele kantelverschuivingen door het kantelcorrectieproces langzaam en zeker te volgen. In een paar gevallen tijdens dit onderzoek was de kanteling uitgeschakeld, waardoor het boorsysteem geloofde dat het in de schedel boorde, hoewel de boor niet eens contact had gemaakt met de schedel. Grotendeels is dit een probleem voor het nauwkeurig registreren van de schedeldikte en als het flagrant genoeg is, kan dit onnauwkeurigheid in de boorcoördinaten veroorzaken. Bovendien was de auto-stop-functie inconsistent en moet deze met zorg worden gebruikt. Vertrouw niet alleen op de auto-stop-functie om schade aan de hersenen te voorkomen. Controleer altijd het boorgat om er zeker van te zijn dat er niet te veel wordt geboord.
Ongeacht de auto-stop zijn er een paar optimalisaties die kunnen worden uitgevoerd voor de puntsgewijze en horizontale boormethoden. Om er zeker van te zijn dat er geen incidentele schade aan de hersenen optreedt, wordt punt voor punt een boorverschuiving gebruikt tijdens het snijden van de rand, maar de gebruiker moet deze instelling vooraf bepalen door middel van testen. Er zou een lineaire interpolatiemethode kunnen worden ingebouwd met het ondiepste zaadpunt als basis, zodat bij dikkere zaden rond de schedel geen schade in de hersenen zal optreden. Indien nodig kan de gebruiker altijd terugkeren naar een dikker deel van de schedel en dieper boren. De horizontale snijstap maakt gebruik van een dieptesnijinterval (standaard 100 μm) voor elke rotatie rond de randpunten. Dit kan ook worden bepaald op basis van schedeldikte om te voorkomen dat te diep wordt geboord en de hersenen worden beschadigd.
Transgene muizen zijn een krachtig experimenteel model voor intravitale multifotonenbeeldvorming. Hoewel het gebruik van een chirurgische robot voor schedelvensters bij transgene muizen in deze studie wordt benadrukt, is het belangrijk om het gebruik van een chirurgische robot bij andere schedeloperaties op te merken. De mogelijkheid om boringen te controleren en te standaardiseren biedt voordelen voor craniotomieën in grotere dierstudies in het hele veld. Hoewel enige mechanische schade visueel werd waargenomen, is dit hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de extreem kleine scheiding tussen de hersenen en de schedel bij muizen. Grotere dieren, zoals ratten, hebben meer subarachnoïdale ruimte en dikkere dura, waardoor er minder risico is op mechanische schade door robotboren25. In combinatie met de vermindering van thermische schade die hier wordt getoond met behulp van de gepulseerde methode, heeft de chirurgische robot het potentieel om de schade die is opgelopen door het boren in verschillende diermodellen aanzienlijk te verminderen.
Over het algemeen vertoonde de gepulseerde puntsgewijze methode de minste hoeveelheid schade, of het nu het gevolg was van minder verwarming of minder mechanische schade aan de hersenen. Met de hand boren kan een meer gecontroleerde methode bieden om schade te voorkomen, maar het is belangrijk om de voordelen van een chirurgische robot te benadrukken. Een robot heeft minder training nodig, kan helpen de variabiliteit van chirurg tot chirurg te verminderen en kan, eenmaal volledig geoptimaliseerd, een meer gestandaardiseerde procedure in laboratoria mogelijk maken. Bovendien is de leercurve voor een chirurgische robot veel lager dan die van een operatie met de hand. Dit vermindert niet alleen de tijd die nodig is om de techniek te leren, maar vermindert ook het aantal dieren dat wordt gebruikt voor trainingsdoeleinden. De prevalentie van craniale raamboringen is toegenomen met de innovatie van multifotonenbeeldvorming door de hersenen, zoals te zien is in gepubliceerde artikelen20,37. Het gebruik van karakteriserende methoden zoals thermokoppels en EB-kleurstofbeeldvorming zal helpen de boortechniek te optimaliseren, terwijl het gebruik van robots moeilijke operaties toegankelijker en wijdverspreider zal maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden. De inhoud vertegenwoordigt niet de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Veteranenzaken, de National Institutes of Health of de regering van de Verenigde Staten.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) en GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona), en Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) van het United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Daarnaast werd dit werk ook gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Health, het National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) en het National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. GRANT12635723. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen in dit materiaal zijn die van de auteur(s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
