Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

चूहों में क्रैनियल विंडो सर्जरी के लिए रोबोट-ड्रिल किए गए क्रैनियोटॉमी से थर्मल क्षति का आकलन

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64188
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Advanced Platform Technology Center, Louis Stokes Cleveland VA Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

ट्रांसजेनिक चूहों में इंट्रावाइटल इमेजिंग की अनुमति देने के लिए कपाल खिड़कियां एक सर्वव्यापी रूप से कार्यान्वित शल्य चिकित्सा तकनीक बन गई हैं। यह प्रोटोकॉल एक सर्जिकल रोबोट के उपयोग का वर्णन करता है जो कपाल खिड़कियों की अर्ध-स्वचालित हड्डी ड्रिलिंग करता है और सर्जन-से-सर्जन परिवर्तनशीलता को कम करने और थर्मल रक्त-मस्तिष्क बाधा क्षति को आंशिक रूप से कम करने में मदद कर सकता है।

Abstract

कपाल खिड़की सर्जरी मल्टीफोटॉन या अन्य इंट्रावाइटल इमेजिंग तकनीकों के उपयोग के साथ जीवित चूहों में मस्तिष्क के ऊतकों की इमेजिंग के लिए अनुमति देती है। हालांकि, हाथ से किसी भी क्रैनियोटॉमी करते समय, मस्तिष्क के ऊतकों को अक्सर थर्मल क्षति होती है, जो स्वाभाविक रूप से परिवर्तनशील सर्जरी-टू-सर्जरी है और व्यक्तिगत सर्जन तकनीक पर निर्भर हो सकती है। एक सर्जिकल रोबोट को लागू करने से सर्जरी को मानकीकृत किया जा सकता है और सर्जरी से जुड़े थर्मल क्षति में कमी आ सकती है। इस अध्ययन में, थर्मल क्षति का मूल्यांकन करने के लिए रोबोटिक ड्रिलिंग के तीन तरीकों का परीक्षण किया गया था: क्षैतिज, बिंदु-दर-बिंदु, और स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु। क्षैतिज ड्रिलिंग एक निरंतर ड्रिलिंग योजनाबद्ध का उपयोग करती है, जबकि बिंदु-दर-बिंदु कपाल खिड़की को शामिल करने वाले कई छेदों का अभ्यास करती है। स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग के बीच ठंडा करने की अनुमति देने के लिए "2 एस ऑन, 2 एस ऑफ" ड्रिलिंग योजना जोड़ता है। इवांस ब्लू (ईबी) डाई की फ्लोरोसेंट इमेजिंग अंतःशिरा रूप से मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान को मापती है, जबकि ड्रिलिंग साइट के नीचे रखा गया एक थर्मोकपल थर्मल क्षति को मापता है। थर्मोकपल के परिणाम क्षैतिज (16.66 डिग्री सेल्सियस ± 2.08 डिग्री सेल्सियस) और बिंदु-दर-बिंदु (18.69 डिग्री सेल्सियस ± 1.75 डिग्री सेल्सियस) समूहों की तुलना में स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु (6.90 डिग्री सेल्सियस ± 1.35 डिग्री सेल्सियस) समूह में तापमान परिवर्तन में महत्वपूर्ण कमी का संकेत देते हैं। इसी तरह, स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु समूह ने क्षैतिज विधि की तुलना में कपाल खिड़की ड्रिलिंग के बाद काफी कम ईबी उपस्थिति दिखाई, जो मस्तिष्क में रक्त वाहिकाओं को कम नुकसान का संकेत देती है। इस प्रकार, एक स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग विधि थर्मल क्षति को कम करने के लिए इष्टतम योजना प्रतीत होती है। एक रोबोटिक ड्रिल प्रशिक्षण, परिवर्तनशीलता को कम करने और थर्मल क्षति को कम करने में मदद करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। अनुसंधान प्रयोगशालाओं में मल्टीफोटॉन इमेजिंग के बढ़ते उपयोग के साथ, परिणामों की कठोरता और प्रजनन क्षमता में सुधार करना महत्वपूर्ण है। यहां संबोधित तरीके दूसरों को सूचित करने में मदद करेंगे कि क्षेत्र को आगे बढ़ाने के लिए इन सर्जिकल रोबोटों का बेहतर उपयोग कैसे किया जाए।

Introduction

कपाल खिड़कियां तंत्रिका विज्ञान, तंत्रिका इंजीनियरिंग और जीव विज्ञान के क्षेत्रों में सर्वव्यापी रूप से उपयोग की जाती हैं ताकि जीवित जानवरों में कॉर्टेक्स के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन और इमेजिंग की अनुमति मिल सके 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11।. ट्रांसजेनिक चूहों और मल्टीफोटॉन इमेजिंग के शक्तिशाली संयोजन ने विवो मस्तिष्क 12,13,14,15,16,17,18 में सर्किट गतिविधि और अन्य जैविक अंतर्दृष्टि में बेहद मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। खोपड़ी पर लगाए गए लघु माइक्रोस्कोप ने जागृत, स्वतंत्र रूप से चलनेवाले जानवरों में रिकॉर्डिंग को सक्षम करने के लिए इन क्षमताओं को और बढ़ाया है। कपाल खिड़की बनाने की प्रक्रिया में कपाल की हड्डी को पतला या पूरी तरह से हटाने के लिए पावर-ड्रिलिंग की आवश्यकता होती है ताकि कॉर्टेक्स20 पर कांच के पारदर्शी टुकड़े को सुरक्षित करने के लिए बड़े पर्याप्त क्रैनियोटॉमी का उत्पादन किया जा सके। पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) और अन्य पॉलिमर को कपाल खिड़की सामग्री 9,21 के रूप में भी परीक्षण किया गया है। अंततः, आदर्श कपाल खिड़की वह है जो नीचे सामान्य अंतर्जात गतिविधि में बदलाव या हस्तक्षेप नहीं करती है। हालांकि, यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि कपाल खिड़की ड्रिलिंग अंतर्निहित ऊतक को बढ़ाती है, जिससे मस्तिष्क को नुकसान होता है, पर्यावरण का विघटन होता है, और मल्टीफोटॉन इमेजिंग गहराई22 को बाधित करने के बिंदु तक मेनिंगेस को प्रभावित करता है। परिणामस्वरूप न्यूरोइन्फ्लेमेशन में रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की पारगम्यता से लेकर प्रत्यारोपण स्थल23 के आसपास ग्लियल कोशिकाओं की सक्रियता और भर्ती तक के प्रभावों की एक विस्तृत श्रृंखला होती है। इसलिए, सुरक्षित और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कपाल खिड़की ड्रिलिंग विधियों को चिह्नित करना लगातार इमेजिंग गुणवत्ता और भ्रामक कारकों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

जबकि अंतर्निहित ऊतक को आघात को कम करने के लिए देखभाल की जाती है, हड्डी को ड्रिल करने के कार्यमें मस्तिष्क को थर्मल और यांत्रिक गड़बड़ी दोनों पैदा करने की क्षमता होती है। ड्यूरा में आकस्मिक ड्रिल प्रवेश से यांत्रिक आघात कॉर्टिकल चोटकी अलग-अलग डिग्री को प्रेरित कर सकता है। शॉफस्टाल एट अल .25 के एक अध्ययन में, हड्डी-ड्रिलिंग से गर्मी के परिणामस्वरूप बीबीबी पारगम्यता में वृद्धि हुई, जैसा कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा25 में इवांस ब्लू (ईबी) डाई की उपस्थिति से संकेत मिलता है। ईबी डाई, अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया जाता है, रक्तप्रवाह में एल्बुमिन को प्रसारित करने से बांधता है और इसलिए आमतौर पर सराहनीय सांद्रता में एक स्वस्थ बीबीबी को पार नहीं करता है। नतीजतन, ईबी डाई का उपयोग आमतौर पर बीबीबी पारगम्यता26,27 के संवेदनशील मार्कर के रूप में किया जाता है। हालांकि उनके अध्ययन ने अध्ययन के तहत बाद के जैविक सीक्वेल पर बीबीबी पारगम्यता के प्रभाव को सीधे नहीं मापा, पूर्व अध्ययनों ने बीबीबी पारगम्यता को क्रोनिक रूप से प्रत्यारोपित माइक्रोइलेक्ट्रोड और मोटर फ़ंक्शन28 में परिवर्तन के लिए बढ़ी हुई न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया से सहसंबद्ध किया है।

अध्ययन के लक्ष्यों के आधार पर, थर्मल और यांत्रिक क्षति का परिमाण प्रयोगात्मक त्रुटि के स्रोत में योगदान कर सकता है, अध्ययन की कठोरता और प्रजनन क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। कपाल खिड़कियों के उत्पादन के लिए दर्जनों उद्धृत विधियां हैं, जिनमें से प्रत्येक विभिन्न ड्रिलिंग उपकरण, गति, तकनीक और उपयोगकर्ता 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 का उपयोग करती है। शॉफस्टाल एट अल .25 ने बताया कि हीटिंग परिणामों में देखी गई भिन्नता को ड्रिल के लागू बल, फ़ीड दर और आवेदन के कोण में परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, अन्य पहलुओं के बीचजिन्हें हाथ से ड्रिलिंग करते समय नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। एक धारणा है कि स्वचालित ड्रिलिंग सिस्टम और अन्य स्टीरियोटैक्सिक उपकरण प्रजनन क्षमता और परिणाम स्थिरता में सुधार कर सकते हैं, लेकिन प्रकाशित विधि अध्ययनों ने परिणामों में से एक के रूप में तापमान या बीबीबी पारगम्यता का कड़ाई से मूल्यांकन नहीं किया है। इसलिए, कपाल खिड़कियों का उत्पादन करने के लिए अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लगातार लागू तरीकों की आवश्यकता है, साथ ही अंतर्निहित तंत्रिका ऊतक पर कपाल खिड़की ड्रिलिंग के प्रभाव का आकलन करने के लिए सख्ती से लागू विधियां भी हैं।

इस अध्ययन का फोकस कपाल खिड़कियों के लिए सुसंगत और सुरक्षित ड्रिलिंग विधियों को निर्धारित करना और विकसित करना है। क्रैनियल विंडो इंस्टॉलेशन के लिए क्रैनियोटॉमी का आकार मस्तिष्क प्रत्यारोपित माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए मानक क्रैनियोटॉमी से काफी बड़ा है। मानक उपकरणों का उपयोग करते समय इस तरह के क्रैनियोटॉमी को एक छेद के साथ पूरा नहीं किया जा सकता है,जिससे हाथ से किए जाने पर अधिक अंतर-सर्जन तकनीक परिवर्तनशीलता पेश की जाती है। सर्जिकल ड्रिलिंग रोबोट को क्षेत्र में पेश किया गया है, लेकिन व्यापक रूप से अपनाया नहीं गयाहै 1,6,29. ड्रिलिंग का स्वचालन देखे गए परीक्षण-से-परीक्षण भिन्नता में योगदान देने वाले चर पर नियंत्रण प्रदान करता है, यह सुझाव देता है कि उपकरण का उपयोग अंतर-और इंट्रा-सर्जन प्रभावों को कम कर सकता है। क्रैनियल विंडो प्लेसमेंट के लिए आवश्यक बड़े क्रैनियोटॉमी की अतिरिक्त कठिनाई को देखते हुए यह विशेष रुचि का है। जबकि कोई यह मान सकता है कि ड्रिलिंग को स्वचालित करके प्रदान किए गए नियंत्रण के लिए स्पष्ट लाभ हैं, इन उपकरणों के कार्यान्वयन का बहुत कम मूल्यांकन किया गया है। हालांकि दृश्यमान घावों कोनहीं देखा गया है, ईबी का उपयोग करके उच्च संवेदनशीलता परीक्षण वांछित है।

यहां, बीबीबी पारगम्यता को संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सर्जिकल ड्रिलिंग रोबोट का उपयोग करके मापा जाता है, जो स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक, क्रैनियोटॉमी योजना / मानचित्रण और ड्रिलिंग शैलियों ("बिंदु-दर-बिंदु" बनाम "क्षैतिज") के चयन की प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है, जो ड्रिल बिट के रूट पथ का उल्लेख करता है। प्रारंभ में, आठ "बीज" बिंदुओं को ड्रिल किया जाता है (चित्रा 1 ए), कपाल खिड़की को रेखांकित करता है। यहां से, बीजों के बीच की जगह को "बिंदु-दर-बिंदु" या "क्षैतिज" ड्रिल विधि का उपयोग करके काट दिया जाता है। "पॉइंट-बाय-पॉइंट" ऊर्ध्वाधर पायलट छेद कटौती (सीएनसी ड्रिल प्रेस के समान) करता है, जबकि "क्षैतिज" कपाल खिड़की की परिधि के साथ क्षैतिज कटौती करता है जो छेद को रेखांकित करता है (सीएनसी राउटर के समान)। दोनों विधियों के लिए परिणाम खोपड़ी का एक टुकड़ा है जिसे कपाल खिड़की को प्रकट करने के लिए हटाया जा सकता है। ड्रिलिंग से क्षति को अलग करने के लिए, कपाल खिड़की को शारीरिक रूप से हटाया नहीं जाता है, ताकि किसी भी अतिरिक्त क्षति से बचा जा सके। फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ युग्मित ईबी डाई के संयोजन का उपयोग चूहों में क्रैनियोटॉमी करने के बाद बीबीबी पारगम्यता को मापने के लिए किया जाता है, और ड्रिलिंग के दौरान मस्तिष्क की सतह के तापमान को सीधे मापने के लिए एक सम्मिलित थर्मोकपल का उपयोग किया जाता है (चित्रा 1 बी, सी)। पिछले अवलोकनों ने संकेत दिया कि ड्रिल हीटिंग25 को कम करने के लिए 2 सेकंड के अंतराल के साथ स्पंदित ड्रिलिंग पर्याप्त थी, और इसलिए सर्जिकल रोबोट के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में शामिल किया गया है।

प्रस्तुत कार्य का इरादा क्रैनियोटॉमी ड्रिलिंग से थर्मल क्षति का आकलन करने के तरीकों का प्रदर्शन करना है। जबकि विधियों को स्वचालित ड्रिलिंग के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है, ऐसे तरीकों को मैन्युअल ड्रिलिंग योजनाओं पर भी लागू किया जा सकता है। इन विधियों का उपयोग मानक प्रक्रिया के रूप में अपनाने से पहले उपकरण और / या ड्रिलिंग योजनाओं के उपयोग को मान्य करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक पाइपलाइन योजनाबद्ध। ईबी परिमाणीकरण पोस्ट-क्रैनियल विंडो प्रक्रिया के लिए जानवरों की प्रक्रिया का प्रदर्शन करने वाला योजनाबद्ध। (ए) स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम और सर्जिकल रोबोट ड्रिल के साथ माउस का योजनाबद्ध सेटअप। एक उदाहरण कपाल खिड़की को मोटर कॉर्टेक्स पर बीज बिंदुओं (हरे) और किनारे के बिंदुओं (नीले) के साथ दिखाया गया है। (बी) छिड़काव सेटअप में किसी भी रक्त को हटाने के लिए पूरे जानवर में 1 x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) इंजेक्ट करना शामिल है, इसके बाद मस्तिष्क का निष्कर्षण होता है। (सी) मस्तिष्क को इवांस ब्लू डाई पर फ्लोरोसेंट इमेजिंग का संचालन करने के लिए ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम चैंबर में डाल दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

लुई स्टोक्स क्लीवलैंड डिपार्टमेंट ऑफ वेटरन्स अफेयर्स मेडिकल सेंटर इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी के अनुसार सभी प्रक्रियाओं और पशु देखभाल प्रथाओं की समीक्षा, अनुमोदन और प्रदर्शन किया गया।

1. सर्जिकल रोबोट हार्डवेयर सेटअप

  1. सर्जरी से पहले, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर स्थापित करने के लिए सर्जिकल रोबोट ( सामग्री की तालिका देखें) मैनुअल और गाइड का पालन करें। मैनुअल में विस्तृत रूप से फ्रेम अंशांकन निष्पादित करें। यदि ड्रिल या फ्रेम को स्थानांतरित किया जाता है, तो सटीकता सुनिश्चित करने के लिए ड्रिल को फिर से कैलिब्रेट करने की सिफारिश की जाती है।

2. सॉफ्टवेयर तैयारी

  1. सर्जिकल सॉफ़्टवेयर पर नेविगेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक स्वच्छ प्रोजेक्ट के साथ प्रारंभ करें का चयन करके एक नई परियोजना बनाएं। उपयोग किए जाने वाले ड्रिलिंग निर्देशांक को नामित करने के लिए विषय को शीर्ष पर माउस के रूप में सेट करें।
  2. नया प्रोजेक्ट प्रारंभ करें का चयन करें.
  3. यहां से, ड्रिलिंग समन्वय योजना स्क्रीन पर नेविगेट करने के लिए निचले बाएं कोने में योजना पर क्लिक करें। प्रदर्शन की जाने वाली कपाल खिड़की तकनीक के लिए ड्रिलिंग योजना बनाएं।
    1. ऐसा करने के लिए, स्टीरियोटैक्सिक एटलस पर कहीं भी क्लिक करें। संदर्भ के रूप में ब्रेग्मा का उपयोग करें, और मोटर कॉर्टेक्स के लिए निम्नलिखित निर्देशांक इनपुट करें: एपी = 1.50, एमएल = 1.25, डीवी = 0.00। चयनित निर्देशांक अद्यतन करने के लिए कुंजीपटल पर Enter दबाएँ.
      नोट: पृष्ठीय-वेंट्रल (डीवी) निर्देशांक ड्रिलिंग की गहराई को दर्शाते हैं और इसलिए यहां इनपुट की आवश्यकता नहीं है।
    2. इन निर्देशांकों को सहेजने और उपयुक्त नाम इनपुट करने के लिए लक्ष्य संग्रहीत करें क्लिक करें. यहां से, मुख्य ड्रिलिंग स्क्रीन पर वापस नेविगेट करने के लिए नीचे बाईं ओर मूव बटन पर क्लिक करें।
  4. बाद की परियोजनाओं के लिए इस टेम्पलेट प्रोजेक्ट का पुन: उपयोग करने के लिए प्रोजेक्ट > उपकरण > इस रूप में सहेजें क्लिक करें. यह स्वचालित रूप से बाद के उपयोग के लिए ड्रिलिंग निर्देशांक को बनाए रखेगा।

3. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. एक आइसोफ्लुरेन कक्ष में प्रिज्मप्लस चूहों30,31 (सामग्री की तालिका देखें) को एनेस्थेटाइज करें (1.5 एल / मिनट ओ2 में 3.5%)। आंखों के सूखने से बचाने के लिए आंखों के स्नेहक लागू करें, क्लिपर का उपयोग करके सिर को शेव करें, और चूहों को सीवन को खरोंचने से रोकने के लिए नाखूनों को ट्रिम करें।
    नोट: प्रिज्मप्लस चूहे मल्टीफोटॉन इमेजिंग में उपयोग की जाने वाली ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट प्रजातियों का एक प्रकार है। विषम प्रिज्मप्लस चूहों में फ्लोरोसेंट जीन की कमी होती है और इसलिए अन्य चल रहे अध्ययनों से पशु अपशिष्ट को कम करने के लिए यहां उपयोग किया जाता था, और चूंकि इस अध्ययन में कोई मल्टीफोटॉन इमेजिंग नहीं है। जंगली प्रकार के चूहों को समान परिणाम दिखाने की उम्मीद है।
  2. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को एंटीबायोटिक सेफाज़ोलिन (24 मिलीग्राम / किग्रा), एनाल्जेसिक कार्प्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा), और ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05-0.10 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन दें। किसी भी चीरे से पहले, चीरा स्थल के नीचे मार्केन (0.25%, 100 μL) का एक उपचर्म इंजेक्शन (आंखों के पीछे शुरू होने वाली खोपड़ी की मध्य रेखा के साथ 1 इंच) प्रशासित करें।
    नोट: यहां उपयोग की जाने वाली दवाएं पहले से स्थापित आईएसीयूसी प्रोटोकॉल का पालन करती हैं। हालांकि, सर्जरी से पहले मल्टी-मोडल प्रभाव के लिए ईएमएलए क्रीम को एक सामयिक एनेस्थेटिक के रूप में विचार करने की सिफारिश की जाती है और पूंछ की नस इंजेक्शन के साथ-साथ कार्प्रोफेन के बदले मेलॉक्सिकैम एसआर। ईएमएलए और मेलोक्सिकैम एसआर को आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया से पहले प्रदान किया जा सकता है।
  3. आपूर्ति किए गए ईयरबार का उपयोग करके सर्जिकल रोबोट स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर जानवर को माउंट करें, और नाक शंकु के माध्यम से साँस के माध्यम से साँस के माध्यम से 0.5% -2% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  4. सुनिश्चित करें कि एनेस्थेटिक गहराई को एक प्रशिक्षित पशु चिकित्सक तकनीशियन या कर्मचारियों द्वारा बारीकी से निगरानी की जाती है, माउस की प्रतिक्रिया, श्वसन (~ 55-65 सांस / मिनट), हृदय गति (300-450 बीपीएम), और रंग (गुलाबी) के आधार पर। मूंछ और नियमित पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करने के लिए एक उपाय के रूप में भी किया जा सकता है। वाइटल्स के मूल्य संस्थागत आईएसीयूसी नियमों द्वारा निर्धारित किए जाते हैं।
  5. एक परिसंचारी जल पैड पर पशु शरीर के तापमान को बनाए रखें और रक्त-ऑक्सीजन और हृदय गति माप प्रणाली का उपयोग करके महत्वपूर्ण तत्वों की निगरानी करें।
  6. नसबंदी के लिए क्लोरहेक्सिडिन ग्लूकोनेट (सीएचजी) और 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ सर्जिकल क्षेत्र को स्क्रब करें। सर्जरी के दौरान बाँझपन बनाए रखने के लिए, माउस और स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम पर एक बाँझ प्लास्टिक की चादर रखें।
    नोट: जबकि ये प्रोटोकॉल जीवित रहने की सर्जरी के लिए विकसित किए गए थे, प्रस्तुत डेटा गैर-जीवित जानवरों के उपयोग को दर्शाता है, क्योंकि ध्यान उचित ड्रिलिंग प्रोटोकॉल विधियों का परीक्षण और निर्धारण करना था।

4. खोपड़ी की तैयारी

  1. स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके, खोपड़ी की मध्य रेखा पर 1 इंच का चीरा लगाएं, जो आंखों के पीछे से शुरू होता है।
  2. खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को वापस खींचें और (वैकल्पिक रूप से) सर्जिकल विंडो को बनाए रखने के लिए रिट्रैक्टर्स का उपयोग करें। बाँझ कपास-टिंप एप्लीकेटर्स का उपयोग करके किसी भी अवशिष्ट ऊतक और झिल्ली को हटा दें।
  3. कपास-टिंप एप्लिकेटर के साथ 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करके खोपड़ी को सुखाएं और साफ करें।
    नोट: यह खोपड़ी के सीवन को दिखाई देगा। ब्रेग्मा और लैम्ब्डा को आसानी से देखा जाना चाहिए। यदि नहीं, तो अधिक हाइड्रोजन पेरोक्साइड लागू करें या चीरे के आकार को बढ़ाएं।
  4. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, सर्जिकल रोबोट ड्रिलिंग सेटअप से माउस में मगरमच्छ क्लिप केबल संलग्न करके "ऑटो-स्टॉप" कार्यक्षमता की अनुमति दें। "ऑटो-स्टॉप" प्रतिबाधा में बदलाव का पता लगाकर काम करता है, इसलिए एक बार ड्रिल बिट हड्डी के बजाय मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) से संपर्क करता है, तो ड्रिल ड्रिलिंग बंद कर देगा, जिससे मस्तिष्क को नुकसान से बचाया जा सकेगा।

5. इवांस ब्लू टेल नस इंजेक्शन

सावधानी: ईबी एक संभावित कार्सिनोजेन है। संभालते समय दस्ताने का उपयोग करें।

  1. आसान इंजेक्शन के लिए पूंछ तैयार करने के लिए, अल्कोहल वाइप से पोंछ लें। वैकल्पिक रूप से, विंटरग्रीन तेल को नस35 को पतला करने के लिए शीर्ष रूप से लागू किया जा सकता है।
  2. दूसरे हाथ में ईबी युक्त सिरिंज को संभालते समय एक हाथ में पूंछ को पकड़ें। अंगूठे और फोरफिंगर का उपयोग करके, पूंछ के मोड़ के शीर्ष पर पूंछ की नस को उजागर करने के लिए पूंछ को मोड़ें। सिरिंज (1 या 2 एमएल, 30 ग्राम इंसुलिन सिरिंज) को नस के समानांतर डालें और धीरे-धीरे ईबी की मात्रा को इंजेक्ट करें। ईबी (4% डब्ल्यू / वी) को टेल वेन इंजेक्शन के माध्यम से 2 एमएल / किग्रा शरीर के वजन की एकाग्रता पर प्रशासित किया जाता है।
    नोट: यदि सुई सही ढंग से डाली जाती है तो सिरिंज से पूंछ में प्रवाह के लिए न्यूनतम से कोई प्रतिरोध महसूस नहीं किया जा सकता है। यदि पूंछ में प्रतिरोध है या ईबी डाई दिखाई देती है, तो पूंछ पर नीचे जाएं और फिर से प्रयास करें।
  3. एक बार इंजेक्शन लगाने के बाद, ड्रिलिंग शुरू होने से पहले ईबी को पूरे माउस में प्रसारित करने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। सफल इंजेक्शन को तुरंत सत्यापित किया जाता है क्योंकि माउस के छोर और सर्जिकल विंडो नीली हो जाती है।

6. सर्जिकल रोबोट ड्रिलिंग प्रक्रिया

  1. एक बार खोपड़ी ड्रिलिंग के लिए तैयार हो जाने के बाद, सर्जिकल सॉफ्टवेयर पर वापस नेविगेट करें। चरण 2.4 में परिभाषित टेम्पलेट प्रोजेक्ट खोलें जहां ड्रिलिंग के लिए निर्देशांक निर्दिष्ट किए गए थे।
    1. नई > > प्रोजेक्ट > उपकरण का पालन करें टेम्पलेट प्रोजेक्ट का चयन करें और चरण 2 (सॉफ़्टवेयर तैयारी) में निर्दिष्ट टेम्पलेट प्रोजेक्ट चुनें।
    2. इस नई परियोजना को ले जाने के लिए योजना (लक्ष्य बिंदु) > ड्रिल पैरामीटर > समान प्रोटोकॉल तत्वों का चयन करें।
    3. नया प्रोजेक्ट प्रारंभ करें क्लिक करें.
  2. इसके बाद, वर्तमान जानवर के माउस खोपड़ी के झुकाव और स्केलिंग के लिए ड्रिल और फ्रेम को सही करें। सुधार स्क्रीन खोलने के लिए उपकरण क्लिक करें और झुकाव और स्केलिंग के लिए सही चुनें. स्क्रीन के शीर्ष पर, सुनिश्चित करें कि ड्रिल सक्रिय है (सिरिंज नहीं), हल्के-लाल ड्रिल बटन पर क्लिक करके।
    नोट: एक बार सक्रिय होने के बाद, ड्रिल बटन गहरे / चमकदार लाल हो जाएगा। सिरिंज बटन को अनदेखा किया जा सकता है, क्योंकि इस प्रोटोकॉल में इसका उपयोग नहीं किया जाता है।
    1. सबसे पहले, स्केल, पिच और याव को यह स्थापित करके सही करें कि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा वर्तमान जानवर पर कहां स्थित हैं। ड्रिल बिट को स्थानांतरित करने के लिए या तो कीबोर्ड नियंत्रण या ऑन-स्क्रीन नियंत्रण का उपयोग करें। एक बार ड्रिल बिट ब्रेग्मा पर स्थित हो जाने के बाद, इसे तब तक कम करें जब तक कि यह सिर्फ खोपड़ी को छू न रहा हो और ब्रेग्मा सेट करें पर क्लिक करें। लैम्ब्डा के लिए इसे दोहराएं।
    2. इसके बाद, खोपड़ी के विशिष्ट रोल के लिए समायोजित करें। खोपड़ी के केंद्र में ड्रिल बिट को स्वचालित रूप से समायोजित करने के लिए मध्य बिंदु पर जाएं बटन पर क्लिक करें। बाईं ओर 2 मिमी पर क्लिक करें और फिर खोपड़ी को छूने तक ड्रिल को धीरे-धीरे कम करें। बाएँ बिंदु सेट करें क्लिक करें.
    3. मस्तिष्क के दाईं ओर चरण 6.2.2 दोहराएं। अब इस विशिष्ट खोपड़ी के लिए प्रणाली स्थापित की गई है।
      नोट: उचित ड्रिलिंग निर्देशांक और गहराई सुनिश्चित करने के लिए यहां सुधार महत्वपूर्ण है। जितना संभव हो उतना सुधार की आवश्यकता को कम करने के लिए माउस को जितना संभव हो उतना सीधा रखा जाना चाहिए। यदि बड़े सुधार की आवश्यकता होती है, तो इसके परिणामस्वरूप ड्रिलिंग की खराब सटीकता हो सकती है।
  3. सुधार किए जाने के बाद, क्लिक करके सुधार विंडो से बाहर आएं बंद करना स्क्रीन के निचले मध्य में। क्लिक करके ड्रिलिंग स्क्रीन पर नेविगेट करें औजार और फिर चयन करें अभ्यास।।। ड्रिलिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए।
    1. सुनिश्चित करें कि क्रैनियोटॉमी-शेप को स्क्रीन के शीर्ष पर ड्रिल ड्रॉपडाउन से चुना गया है। फिर, ड्रिल केंद्र और आकृति का चयन करें क्लिक करें और चरण 2.3.1 में नामित पूर्वनिर्धारित लक्ष्य चुनें. इस स्क्रीन के तहत, लक्ष्य के लिए आकार के रूप में सर्कल का चयन करें और सर्कल के व्यास 2 के रूप में2.60 मिमी इनपुट करें। दिखाएँ क्लिक करें.
      नोट: कपाल खिड़की का व्यास बीज बिंदुओं के केंद्र के रूप में ड्रिल बिट के केंद्र का उपयोग करके बनाया गया है। एक छोटे ड्रिल बिट (व्यास = 0.6 मिमी या विक्रेता द्वारा प्रदान किए गए अनुशंसित बिट आकार) का उपयोग बड़े ड्रिल बिट का उपयोग करने के परिणामस्वरूप जोड़े गए अतिरिक्त व्यास को कम करने के लिए किया जाता है। विशेष ड्रिल बिट्स का उपयोग विशेष रूप से सर्जिकल रोबोट के लिए किया जाता है। आठ बीज बिंदु और किनारे बिंदु अब खोपड़ी पर क्रमशः हरे और नीले बिंदुओं के रूप में दिखाई देंगे।
    2. मुख्य विंडो पर क्लिक करें और स्क्रीन के दाईं ओर ड्रिल पॉइंट मेनू लाने के लिए कीबोर्ड शॉर्टकट कंट्रोल + शिफ्ट + डी का उपयोग करें। यह विशिष्ट ड्रिल बिंदु गहराई और स्थिति देखने की अनुमति देता है।
    3. ड्रिलिंग शुरू होने से पहले, ऑटो-स्टॉप चेकबॉक्स के बगल में स्थित बटन पर क्लिक करके यदि आवश्यक हो तो ऑटो-स्टॉप सुविधा को अनुकूलित करें। यह बटन मीडियम के लिए डिफ़ॉल्ट है, जो ऑटो-स्टॉप सुविधा के लिए संवेदनशीलता से मेल खाता है।
      नोट: जानवरों के लिए सही संवेदनशीलता खोजने के लिए यह पहले से परीक्षण किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, मस्तिष्क के माध्यम से न्यूनतम ड्रिलिंग सुनिश्चित करने के लिए उच्चतम संवेदनशीलता का उपयोग किया गया था।
    4. एक बार ऑटो-स्टॉप सुविधा सक्षम और अनुकूलित हो जाने के बाद, बीज बिंदु की ड्रिलिंग शुरू करें। ऑटो स्कैन पर क्लिक करें ताकि ड्रिल स्वचालित रूप से बीज 1 पर शुरू हो। एक बार ड्रिल बिट सीएसएफ को छूने के बाद, ऑटो-स्टॉप फीचर प्रतिबाधा में बदलाव का पता लगाएगा, जिससे खोपड़ी से बिट की ड्रिलिंग और वापसी में रुकावट आएगी।
    5. यदि ऑटो-स्टॉप किसी भी बदलाव का पता लगाने में विफल रहता है तो ड्रिलिंग पर कड़ी नजर रखें। ड्रिलिंग को मैन्युअल रूप से रद्द करने के लिए एस्केप कुंजी को दबाया जा सकता है। ड्रिल मेनू के निचले भाग में और प्रतिबाधा मानों के दाईं ओर स्थित गुलाबी सर्कल को ड्रिलिंग शुरू करने या रोकने के लिए भी क्लिक किया जा सकता है।
      नोट: ड्रिल बिट स्वचालित रूप से अनुमानित खोपड़ी मोटाई के बराबर गहराई तक ड्रिल करेगा (या जब तक ऑटो-स्टॉप सुविधा सक्रिय नहीं होती है)।
    6. यदि अनुमानित गहराई तक पहुंचने से पहले ऑटो-स्टॉप सक्रिय नहीं होता है, तो उपयोगकर्ता को प्रेरित करने के लिए एक स्क्रीन पॉप अप होगी: 1) ड्रिलिंग और अवरोही # मिमी आगे जारी रखें, 2) वर्तमान गहराई पर चिह्नित करें और जारी रखें, 3) वर्तमान बिंदु को छोड़ दें और जारी रखें, या 4) प्रक्रिया को रोकें (बाद में जारी रखा जा सकता है)। नीचे वर्णित विकल्पों में से एक चुनें।
      1. ड्रिलिंग जारी रखने और # मिमी आगे बढ़ने के लिए, ड्रिल को आगे बढ़ाने के लिए एक दूरी दर्ज करें। डिफ़ॉल्ट रूप से, 0.1 मिमी का उपयोग किया जाता है। मस्तिष्क के आकस्मिक प्रवेश को रोकने के लिए एक छोटी दूरी का सुझाव दिया जा सकता है।
      2. यदि यह माना जाता है कि इस स्क्रीन पर ड्यूरा तक पहुंच गया है, तो वर्तमान गहराई पर मार्क का चयन करें और सिस्टम के लिए उस गहराई पर ड्यूरा को चिह्नित करने और अगले बीज पर जाने के विकल्प को जारी रखें।
      3. ड्रिल बिट की समस्या निवारण या सफाई करने के लिए वर्तमान बिंदु को छोड़ें और जारी रखें और प्रक्रिया रोकें (बाद में जारी रखा जा सकता है) का उपयोग करें और ऑटो-स्टॉप के फिर से काम करने के बाद वापस आ जाएं।
    7. एक बार सभी बीज बिंदुओं को ड्रिल करने के बाद, यदि कोई ऑटो-स्टॉप सुविधा का उपयोग करके समाप्त नहीं हुआ था, तो ड्यूरा पिक का उपयोग करके मैन्युअल रूप से छेद की गहराई की जांच करें। यह सुनिश्चित करेगा कि ड्रिल की गई गहराई खोपड़ी के माध्यम से प्रवेश करती है।
    8. एज पॉइंट ड्रिलिंग शुरू करने से पहले, ड्रिल मेनू पर एज-कट टेक्स्ट के बगल में ड्रॉप डाउन का चयन करके तय करें कि किस प्रकार का ' एज-कट ' वांछित है। दो विकल्प पॉइंट-बाय-पॉइंट और हॉरिजॉन्टली हैं।
      1. प्रत्येक किनारे बिंदु को व्यक्तिगत रूप से और आसन्न बीज बिंदु गहराई द्वारा निर्धारित गहराई तक ड्रिल करने के लिए बिंदु-दर-बिंदु का चयन करें। नीचे दिए गए एज स्केलिंग ... बटन के माध्यम से यदि आवश्यक हो तो स्केलिंग को समायोजित करें, हालांकि नो स्केलिंग का डिफ़ॉल्ट आमतौर पर पर्याप्त है।
      2. एज पॉइंट 1 पर ड्रिलिंग शुरू करने के लिए क्षैतिज रूप से चुनें और ड्रिलिंग सर्कल की पूरी परिधि के चारों ओर जाने के लिए निरंतर ड्रिलिंग गति का उपयोग करें। डिफ़ॉल्ट रूप से, क्षैतिज कट 100 μm अंतराल पर कट जाएगा, एक और 100 μm गहराई से आगे बढ़ने से पहले खिड़की की परिधि के चारों ओर जाएगा। यदि आवश्यक हो, तो कट विकल्प के तहत अंतराल गहराई और ड्रिल गति बदलें ... नीचे बटन।
      3. आसन्न बीज बिंदुओं से पूर्व निर्धारित ऑफसेट लेकर ऑटो-कट गहराई के लिए समायोजित करने के लिए ऑटो-कट ऑफसेट ( एज-कट बॉक्स के नीचे) का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल में, 20 μm के ऑटो-कट ऑफसेट का उपयोग किया गया था। प्रति-पशु आधार पर एक इष्टतम ऑफसेट निर्धारित करने के लिए आगे का परीक्षण किया जा सकता है।
    9. एक बार एज कट सेटिंग्स निर्धारित हो जाने के बाद, ड्रिल मेनू के बीच में ऑटो कट बटन पर क्लिक करके एज पॉइंट ड्रिलिंग शुरू करें। बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग के लिए, एक बार अंतिम किनारे को ड्रिल करने के बाद, ड्रिलिंग प्रक्रिया समाप्त हो जाती है। क्षैतिज ड्रिलिंग के लिए, तब तक जारी रखें जब तक कि कपाल खिड़की को छोड़ने के लिए पर्याप्त खोपड़ी ड्रिल न की गई हो।
      नोट: हालांकि ड्रिलिंग तब तक की जाती है जब तक कि खिड़की जारी नहीं की जा सकती है, अंतर्निहित ऊतक को किसी भी नुकसान को रोकने के लिए खिड़की को शारीरिक रूप से यहां जारी नहीं किया जाता है। विभिन्न ड्रिलिंग योजनाबद्धताओं का मूल्यांकन करने के लिए सिर्फ ड्रिलिंग के परिणामस्वरूप क्षति को अलग करना महत्वपूर्ण है।
      1. एक बार क्षैतिज ड्रिलिंग एक बीज बिंदु की गहराई तक पहुंच जाने के बाद, ड्रिल पॉइंट मेनू में उस बीज पर राइट-क्लिक करें (या पहले कई बिंदुओं का चयन करें) और लॉक डेप्थ पर क्लिक करें। यह उस क्षेत्र के लिए गहराई से काटने के बिना क्षैतिज काटने को जारी रखने की अनुमति देगा (इस प्रकार मस्तिष्क को भेदने से बचें)।
        नोट: यदि अलग-अलग ड्यूरा गहराई वाले बीज बिंदु हैं, तो यह क्षैतिज ड्रिलिंग प्रक्रिया के लिए आवश्यक गहराई में अंतर पैदा कर सकता है।
    10. यदि ऑटो-स्टॉप सुविधा सही ढंग से काम नहीं कर रही है, तो सुनिश्चित करें कि ड्रिल बिट किसी भी मलबे या संभावित रक्त, खारा आदि से पूरी तरह से साफ है, क्योंकि वे बिट के आधार प्रतिबाधा को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, नीचे वर्णित कई मैनुअल ड्रिलिंग विकल्पों में से एक चुनें यदि ऑटो-स्टॉप लगातार काम करने में विफल रहता है।
      1. ड्रिल मेनू में, बीज या किनारे पर राइट-क्लिक करके और प्रविष्टि पर जाएं चुनकर प्रत्येक बीज पर मैन्युअल रूप से नेविगेट करें। चिह्नित गहराई को साफ करने, छेद को रीसेट करने और अन्य विकल्प भी हैं जो ड्रिलिंग प्रक्रिया में सहायता कर सकते हैं।
      2. एडवांस के बगल में स्थित ड्रॉप डाउन से गहराई का चयन करके ड्रिल गहराई प्रगति को मैन्युअल रूप से नियंत्रित करें: ड्रिल मेनू के शीर्ष के पास पाठ। ड्रिल को निर्धारित दूरी से आगे बढ़ाने के लिए सीधे नीचे अग्रिम बटन पर क्लिक करें।
        नोट: इस सुविधा का उपयोग एडवांस बटन के नीचे सेट ड्यूरा और सेट सर्फेस बटन के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है ताकि सिस्टम को मैन्युअल रूप से बताया जा सके कि खोपड़ी और ड्यूरा की सतह दोनों कहां स्थित हैं। जहां संभव हो ऑटो-स्टॉप फ़ंक्शन का उपयोग करें, लेकिन यदि आवश्यक हो तो ये मैनुअल विकल्प भी पर्याप्त हैं।
      3. यदि मैन्युअल रूप से ड्रिलिंग की जाती है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक ड्रिलिंग गहराई अंतराल के बीच अधिक सावधानी बरतें कि ड्रिल ड्यूरा से अधिक नहीं है। गहराई अंतराल के बीच एक ड्यूरा पिक का उपयोग करके ड्रिल किए गए छेद की जांच करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि ड्यूरा पहुंच गया था या नहीं। एक बार जब सभी मैनुअल बीज ड्रिलिंग समाप्त हो जाती है, तो ऊपर उल्लिखित एज कट प्रक्रिया को सामान्य रूप से जारी रखें।
    11. पल्स विधि
      1. मैन्युअल पल्स ड्रिलिंग करने के लिए, ड्रिल मेनू में ऑटो-स्टॉप विकल्प के बगल में चेकबॉक्स को अनचेक करके ऑटो-स्टॉप सुविधा को बंद करें। यह बंद होना चाहिए ताकि स्पंदन के लिए ड्रिल बंद होने पर नियंत्रण की अनुमति मिल सके।
        नोट: पल्स ड्रिलिंग 2 एस ड्रिलिंग के पैटर्न का पालन करती है, जिसके बाद खोपड़ी को ठंडा करने की अनुमति देने के लिए 2 एस की ड्रिलिंग होती है।
      2. ड्रिल मेनू में, ड्रिल गहराई प्रगति के रूप में 100 μm का चयन करें, यह नीचे की ओर ड्रिलिंग के ~ 2 s के बराबर होगा।
      3. एक बार तैयार होने के बाद, ड्रिलिंग शुरू करने के लिए अग्रिम पर क्लिक करें।
        नोट: ड्रिल को 100 μm से आगे बढ़ने के बाद जल्दी से रोकने के लिए तैयार रहें, क्योंकि ड्रिल गहराई पर घूमना जारी रखता है जब तक कि पलायन दबाया नहीं जाता है (अनावश्यक गर्मी पैदा करना)।
      4. एक बार जब ड्रिल 100 μm उन्नत हो जाती है, तो ड्रिल को रोकने के लिए दो बार एस्केप दबाएं। 2 सेकंड के बाद, खोपड़ी की गहराई के लिए इस चक्र को दोहराएं।
        नोट: सॉफ्टवेयर और यांत्रिक बाधाओं के कारण स्पंदित विधि का उपयोग करके केवल बिंदु-दर-बिंदु विधि का प्रदर्शन किया जा सकता है। निरंतर क्षैतिज ड्रिलिंग इस तरह से नहीं की जा सकती है।
      5. ऊपर दी गई इस विधि का उपयोग करके सभी बीज और किनारे बिंदुओं को ड्रिल करें। ड्यूरा तक पहुंचने के बाद ड्रिल मेनू में बटन का उपयोग करके ड्यूरा सेट करना सुनिश्चित करें।

7. छिड़काव और मस्तिष्क निष्कर्षण

  1. एक बार बीज और किनारे के बिंदुओं की ड्रिलिंग समाप्त हो जाने के बाद, जानवर को अतिरिक्त 1 घंटे के लिए आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत रखें ताकि ईबी डाई क्षतिग्रस्त बीबीबी के माध्यम से प्रसारित और अतिरिक्त हो सके। वाहिकाओं से किसी भी रक्त या तरल पदार्थ को हटाने के लिए कार्डियक छिड़काव करें, और फिर नीचे वर्णित इमेजिंग और विश्लेषण के लिए मस्तिष्क को हटा दें।
    1. कपाल खिड़की के निर्माण के बाद 1 घंटे ईबी परिसंचरण अवधि के बाद, केटामाइन (160 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलेज़िन (20 मिलीग्राम / किग्रा) का कॉकटेल इंट्रापरिटोनियल रूप से जानवर में इंजेक्ट करें। एक बार अनुत्तरदायी होने के बाद, कार्डियक छिड़काव करें।
    2. कैंची का उपयोग करके माउस के पेट को काटें और पसली पिंजरे के माध्यम से लंबवत रूप से काटकर और डायाफ्राम के पार क्षैतिज रूप से काटकर दिल को उजागर करें। दिल को स्पष्ट रूप से देखने के लिए पसली के पिंजरे को पीछे हटा दें। दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक तितली सुई डालें और पूरे शरीर में 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) डालना शुरू करें। दबाव निर्माण को छोड़ने के लिए दिल के दाहिने आलिंद के एक छोटे से हिस्से को स्निप करें।
    3. 1x PBS के 25 मिलीलीटर के बाद पूरे शरीर में फैल गया है, छिड़काव बंद करें और इच्छामृत्यु के द्वितीयक साधन के रूप में माउस को हटा दें।
      नोट: मस्तिष्क को अलग करने के लिए पशु के लिए इच्छामृत्यु और / या समापन बिंदु छिड़काव की संस्थागत रूप से अनुमोदित विधि का प्रदर्शन करना सुनिश्चित करें।
    4. यहां से, रोंगेर्स के साथ हड्डी और ऊतक को हटाकर खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें।
    5. ड्रिलिंग साइटों के आसपास मस्तिष्क में स्थित ईबी की मात्रा का निरीक्षण करने के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम के साथ निकाले गए मस्तिष्क की छवि बनाएं।
      नोट: ईबी एल्ब्यूमिन को प्रसारित करने के लिए बांधता है। यदि मस्तिष्क में संवहनी क्षति होती है, तो ईबी बाहर निकल जाएगा और मस्तिष्क के ऊतकों से जुड़ जाएगा, जिससे क्षति का एक स्पष्ट दृश्य संकेतक होगा।

8. इवांस ब्लू इमेजिंग और विश्लेषण

  1. हार्डवेयर प्रारंभ
    1. ईबी फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम से जुड़े कंप्यूटर को चालू करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें ( सामग्री की तालिका देखें) क्योंकि अन्य आइटम तैयार किए जा रहे हैं। उस क्रम में प्रकाश स्रोत, प्लेटफ़ॉर्म और कैमरा चालू करें।
    2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर पर नेविगेट करें और अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष के अंतर्गत प्रारंभ करें क्लिक करें. जैसे ही प्रारंभिक करण पूरा हो जाता है, सिस्टम और कक्ष लाल से हरे रंग में संकेत देगा।
      नोट: प्रकाश स्रोत के तापमान को इष्टतम स्तर तक पहुंचने की अनुमति देने के लिए किसी भी इमेजिंग से 30 मिनट पहले ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम शुरू करें।
  2. मस्तिष्क की इमेजिंग
    1. इमेजिंग के लिए मंच के केंद्र में एक स्पष्ट डिश में खोजे गए मस्तिष्क को रखें।
    2. अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष के अंतर्गत, छवि के लिए सेटिंग्स समायोजित करें। एक्सपोज़र समय का चयन करें: 1 सेकंड; बिनिंग: मध्यम; एफ / स्टॉप: एफ 1; उत्तेजना: 535 से 675 एनएम; उत्सर्जन: Cy 5.5; लैंप स्तर: उच्च; और एफओवी: 5 सेमी। फिल्टर को लॉक छोड़ दें और फोटोग्राफी और फ्लोरेसेंस के ओवरले की जांच करें। ये सेटिंग्स पिछले प्रयोगशाला अनुभव और इमेजिंग ईबी36 के अन्य प्रकाशित तरीकों पर आधारित हैं।
  3. ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम छवियों को ओपन एक्सेस इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में लोड करें और पृष्ठभूमि, पूरे मस्तिष्क और कपाल खिड़की पर औसत चमक को मापकर ईबी की फ्लोरोसेंट तीव्रता का पता लगाने के लिए रुचि के तीन फ्रीहैंड क्षेत्र (आरओआई) उत्पन्न करें।
    1. संबंधित पृष्ठभूमि आरओआई के खिलाफ कपाल खिड़की और पूरे मस्तिष्क माप को सामान्य करें।
    2. प्रयोगात्मक समूहों से खारा नियंत्रण के बीच उच्चतम सिग्नल टू शोर अनुपात (605 एनएम चुना गया था) के साथ तरंग दैर्ध्य का पता लगाने के लिए प्रत्येक मस्तिष्क को विभिन्न उत्तेजना फिल्टर (535-675 एनएम) के तहत चित्रित करें।
      1. पूरे मस्तिष्क और कपाल खिड़की आरओआई के लिए औसत औसत चमक या फ्लोरोसेंट तीव्रता प्राप्त करने के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य और औसत के तहत औसत चमक को अलग करें।
  4. खारा नियंत्रण के खिलाफ प्रत्येक समूह के लिए कपाल खिड़की क्षेत्र पर औसत औसत चमक का पता लगाएं और सामान्य करें।

9. थर्मोकपल मूल्यांकन।

  1. तीन अलग-अलग ड्रिलिंग योजनाओं के संयोजन में थर्मोकपल ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके खोपड़ी और मस्तिष्क के तापमान में परिवर्तन को मापें। थर्मोकपल एक डेटा अधिग्रहण प्रणाली (डीएक्यू) से जुड़ा हुआ है जो माप को MATLAB में पढ़ने की अनुमति देता है।
  2. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम और रोबोटिक ड्रिल सेटअप पर एक कैडेवर माउस माउंट करें। मैन्युअल रूप से एक छोटे छेद (बीज बिंदु के समान आकार) ~ 2 मिमी दूर ड्रिल करें जहां से कपाल खिड़की खोपड़ी25 के किनारे में बनाई जाएगी। यह छेद थर्मोकपल को उस स्थिति में स्लाइड करने की अनुमति देगा जहां कपाल खिड़की की ड्रिलिंग होती है (चित्रा 2 डी)।
    नोट: कैडेवर चूहों का उपयोग किया जाता है क्योंकि कपाल खिड़की ड्रिलिंग क्षेत्र पर थर्मोकपल को स्लाइड करने के लिए खोपड़ी के किनारे ड्रिलिंग की आवश्यकता होती है। यह कैडेवर माउस इवांस ब्लू विश्लेषण के लिए पहले इस्तेमाल किए गए एक से अलग जानवर है।
  3. तीन योजनाओं में से प्रत्येक के लिए ड्रिलिंग प्रक्रिया शुरू करें जैसा कि पहले किया गया था (चरण 6)। जैसे ही ड्रिल खोपड़ी के माध्यम से जाती है, तापमान परिवर्तन में स्पाइक्स होंगे, जो मस्तिष्क के पास होने वाली हीटिंग का संकेत देते हैं।
  4. अधिकतम तापमान अंतर की गणना करने के लिए MATLAB में परिणामों को रिकॉर्ड और प्लॉट करें। स्पंदित मैनुअल ड्रिलिंग विधि के साथ क्षैतिज बनाम बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग का मूल्यांकन करने के लिए बीज ड्रिलिंग और किनारे ड्रिलिंग के लिए यह अलग से किया जाना चाहिए।

10. सांख्यिकी

  1. बेंजामिनी-होचबर्ग सुधार के साथ क्रुस्कल-वालिस रैंक योग परीक्षण का उपयोग करके आर में थर्मोकपल और ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें, इसके बाद विलकॉक्सन रैंक योग सटीक परीक्षण25 का उपयोग करके जोड़ीवार तुलना करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

थर्मल मूल्यांकन।
थर्मल क्षति की क्षमता का मूल्यांकन क्षैतिज (चित्रा 2 ए), बिंदु-दर-बिंदु (चित्रा 2 बी), और स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु (चित्रा 2 सी) विधियों का उपयोग करके ड्रिलिंग के कारण बेसलाइन से तापमान में परिवर्तन को मापकर किया गया था। चित्रा 2 डी थर्मल डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप प्रदर्शित करता है। थर्मल मूल्यांकन के लिए एन = 4 कपाल खिड़कियों का एक नमूना आकार का उपयोग किया गया था। क्षैतिज और बिंदु-दर-बिंदु एक ही बीज ड्रिलिंग योजनाबद्ध का उपयोग करते हैं लेकिन किनारे के बिंदुओं को कैसे काटा जाता है, इस पर भिन्न होता है। स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु बीज और किनारे ड्रिलिंग भागों दोनों के लिए एक स्पंदित विधि का उपयोग करता है। क्षैतिज विधि के लिए, बीज ड्रिलिंग ने 16.66 डिग्री सेल्सियस ± 2.08 डिग्री सेल्सियस का अधिकतम तापमान परिवर्तन दिखाया, जबकि एज ड्रिलिंग ने 9.08 डिग्री सेल्सियस ± 0.37 डिग्री सेल्सियस दिखाया। बिंदु-दर-बिंदु विधि के लिए, बीज ड्रिलिंग ने 18.69 डिग्री सेल्सियस ± 1.75 डिग्री सेल्सियस का अधिकतम तापमान परिवर्तन दिखाया, जबकि एज ड्रिलिंग ने 8.53 डिग्री सेल्सियस ± 0.36 डिग्री सेल्सियस दिखाया। स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि के लिए, बीज ड्रिलिंग ने 6.90 डिग्री सेल्सियस ± 1.35 डिग्री सेल्सियस का अधिकतम तापमान परिवर्तन दिखाया, जबकि एज ड्रिलिंग ने 4.10 डिग्री सेल्सियस ± 0.51 डिग्री सेल्सियस दिखाया। क्षैतिज और बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग योजनाएं दोनों थर्मल परिवर्तनों के लिए गैर-महत्वपूर्ण अंतर दिखाती हैं। हालांकि, स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि में बदलने के परिणामस्वरूप क्षैतिज और बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग (चित्रा 2 ई, एफ) दोनों की तुलना में मस्तिष्क का काफी कम हीटिंग (पी < 0.05) हुआ। सर्जरी की अवधि भी दर्ज की गई थी, क्योंकि इससे लाइव सर्जरी के लिए जानवरों की उत्तरजीविता पर प्रभाव पड़ सकता है। दोनों स्वचालित तरीकों के लिए, बीज ड्रिलिंग में औसतन 360 सेकंड लगे। क्षैतिज किनारे ड्रिलिंग में 300 सेकंड लगे, जबकि पॉइंट-बाय-पॉइंट एज ड्रिलिंग में 200 सेकंड लगे। स्पंदित विधि में सबसे लंबा समय लगा, जिसमें बीज और किनारे ड्रिलिंग में लगभग 500 सेकंड लगे। फिर भी, ये अंतर किसी भी विचार के लिए पर्याप्त नहीं हैं क्योंकि सर्जरी आमतौर पर 2-3 घंटे से अधिक समय तक रह सकती है।

Figure 2
चित्रा 2: थर्मल मूल्यांकन। ड्रिलिंग विधियों के परिणामस्वरूप मस्तिष्क में अधिकतम तापमान परिवर्तन के आधार पर थर्मल क्षति की क्षमता का मूल्यांकन किया गया था। (ए) क्षैतिज ड्रिलिंग और (बी) बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग ने समान मात्रा में गर्मी उत्पन्न की, जबकि (सी) एक स्पंदित 2 एस ऑन, 2 एस ऑफ पॉइंट-बाय-पॉइंट विधि ने न्यूनतम हीटिंग दिखाई। (ई) बीज ड्रिलिंग और (एफ) एज ड्रिलिंग के परिणामस्वरूप ड्रिलिंग की स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि में काफी कम थर्मल परिवर्तन हुआ (पी < 0.05, एन = 4 प्रति स्थिति)। (डी) थर्मोकपल को माउस कैडेवर की खोपड़ी के नीचे रखा जाता है जहां ड्रिलिंग की जाती है। डेटा को डीएक्यू के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और विश्लेषण के लिए कंप्यूटर में खिलाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संवहनी क्षति
चित्रा 3 ड्रिलिंग योजना और संवहनी क्षति के बीच संबंध को इंगित करता है। तालिका 1 चरण 10 में दर्शाए गए सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद प्रत्येक ड्रिलिंग योजना के लिए पी-मान को इंगित करती है। ईबी डाई मूल्यांकन के लिए एन = 4 प्रति समूह का नमूना आकार का उपयोग किया गया था। ईबी की उच्च मात्रा की उपस्थिति बीबीबी को नुकसान का एक प्रत्यक्ष संकेतक है, जिसमें से बिंदु-दर-बिंदु, क्षैतिज और स्पंदित ड्रिलिंग विधियां नियंत्रण की तुलना में काफी बड़ी हैं (सभी पी = 0.043 के साथ; तालिका 1)। क्षैतिज ड्रिलिंग (पी = 0.411) की तुलना में बिंदु-दर-बिंदु विधि ईबी उपस्थिति के संदर्भ में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती है। इन दोनों योजनाओं ने मस्तिष्क में ड्रिलिंग को रोकने के लिए ऑटो-स्टॉप फ़ंक्शन को नियोजित किया; हालांकि, यह ऑटो-स्टॉप फ़ंक्शन अक्सर क्षति को रोकने में विफल रहा। साझा बीज ड्रिलिंग भाग में ऑटो-स्टॉप की यह विफलता अज्ञात अतिरिक्त क्षति का कारण बन सकती है, जिससे तकनीकों के बीच भेदभाव जटिल हो सकता है। इसलिए, ऑटो-स्टॉप को शामिल किए बिना अन्य दो विधियों का मूल्यांकन करने के लिए ऑटो-स्टॉप के बिना स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि की जोड़ीवार तुलना की गई थी। जब स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु की तुलना बिंदु-दर-बिंदु (पी = 0.486) से की गई थी, तो कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जबकि स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि में क्षैतिज विधि (पी = 0.043) की तुलना में काफी कम ईबी उपस्थिति थी। स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु और बिंदु-दर-बिंदु विधियों के बीच गैर-महत्व को बिंदु-दर-बिंदु ड्रिलिंग में बड़ी भिन्नता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है (चित्रा 4)।

चित्रा 3 उचित ऑटो-स्टॉप सुविधाओं के साथ क्षैतिज (चित्रा 3 सी) और बिंदु-दर-बिंदु (चित्रा 3 डी) ड्रिलिंग दोनों की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है। नेत्रहीन, और ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के माध्यम से, बिंदु-दर-बिंदु और क्षैतिज काटने के माध्यम से ड्रिलिंग को नियंत्रण समूहों की तुलना में मस्तिष्क में वाहिका के लिए हानिकारक देखा गया (चित्रा 3 ए, बी)। स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि (चित्रा 3 ई) में बीज और किनारे बिंदु पर कम स्थानीय क्षति थी, लेकिन अभी भी कपाल खिड़की के भीतर ईबी उपस्थिति दिखाई दे रही थी।

Figure 3
चित्र 3: संवहनी क्षति। कपाल खिड़की क्रैनियोटॉमी से प्रभावित क्षेत्र की औसत चमक निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मस्तिष्क (1) और संबंधित आरओआई (2) की ईबी प्रतिदीप्ति छवियां। (ए) माउस को मस्तिष्क वाहिका में बेसलाइन पृष्ठभूमि ईबी उपस्थिति प्राप्त करने के लिए बिना किसी कपाल खिड़की सर्जरी के ईबी के साथ ईबी के साथ इंजेक्ट किया गया था। (बी) माउस को केवल खारा के साथ इंजेक्शन दिया गया था और एक कपाल खिड़की क्रैनियोटॉमी किया गया था। इसने स्थापित किया कि मापा जा रहा औसत चमक कपाल खिड़की की साइट के पास लीक रक्त वाहिकाओं और संवहनी आघात के कारण ईबी संचय को श्रेय दिया गया था। (सी) माउस को ईबी के साथ इंजेक्ट किया गया था और कपाल खिड़की स्वचालित ड्रिलिंग की क्षैतिज विधि द्वारा बनाई गई थी। (डी) माउस को ईबी के साथ इंजेक्ट किया गया था और कपाल खिड़की स्वचालित ड्रिलिंग की बिंदु-दर-बिंदु विधि द्वारा बनाई गई थी। (ई) चूहों (एन = 2) को ईबी के साथ इंजेक्ट करने के बाद ड्रिलिंग की बिंदु-दर-बिंदु स्पंदित विधि के साथ निर्मित कपाल खिड़की की दो प्रतिनिधि छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

क्षति का दृश्य निरीक्षण
मस्तिष्क का नेत्रहीन निरीक्षण मस्तिष्क की सतह को शारीरिक क्षति दिखाता है (चित्रा 4)। पैनल ए-डी क्षैतिज ड्रिलिंग की ईबी उपस्थिति को प्रदर्शित करते हैं, पैनल ई-एच बिंदु-दर-बिंदु विधि है, और पैनल आई-एल स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि है। "पॉइंट-बाय-पॉइंट" ऊर्ध्वाधर पायलट छेद कटौती करता है जबकि "क्षैतिज" कपाल खिड़की की परिधि के साथ क्षैतिज कटौती करता है जो छेद को रेखांकित करता है। "स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु" ऑटो-स्टॉप सुविधा के उपयोग के बिना बिंदु-दर-बिंदु के समान तरीकों को नियोजित करता है, और उपयोगकर्ता को गहराई की निर्धारित वृद्धि पर ड्रिलिंग रोकने पर निर्भर करता है। हालांकि एक विधि पाई गई है जो मस्तिष्क को थर्मल क्षति की मात्रा को कम करेगी, फिर भी ड्रिल से यांत्रिक क्षति का मुद्दा है। आदर्श रूप से, एक ऑटो-स्टॉप सुविधा जो सीएसएफ का पता लगाती है और मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से पहले ड्रिलिंग को रोकती है, यहां काम करेगी, लेकिन लगातार काम नहीं करती है। यहां तक कि स्पंदित मैनुअल ड्रिलिंग में अत्यधिक देखभाल के साथ, मस्तिष्क पर अभी भी दृश्य क्षति थी। यह दो कारकों का परिणाम हो सकता है: 1) हाथ ड्रिलिंग के साथ आने वाले नियंत्रण और महसूस की कमी और 2) माउस जैसे छोटे जानवर के लिए खोपड़ी और मस्तिष्क के बीच पृथक्करण गहराई। हाथ ड्रिलिंग पर्याप्त अभ्यास और विशेषज्ञता के साथ मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाए बिना खोपड़ी के माध्यम से प्राप्त करने के लिए एक अधिक नियंत्रित विधि प्रदान कर सकता है। हालांकि, प्लग-एंड-प्ले रोबोट की तुलना में बहुत अधिक कौशल और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, जो कई "सर्जनों" को एक ही अध्ययन में योगदान करने की अनुमति देगा- इंट्राकॉर्टिकल माइक्रोइलेक्ट्रोड क्षेत्र में एक आम अभ्यास नहीं है। चूहों के साथ, मस्तिष्क और खोपड़ी के बीच की दूरी बेहद पतली होती है, इसलिए 10 μm की थोड़ी सी भी ओवर-ड्रिल मस्तिष्क को यांत्रिक क्षति पहुंचा सकती है।

Figure 4
चित्रा 4: क्षति का दृश्य निरीक्षण। तीन ड्रिलिंग विधियों में से प्रत्येक के लिए दृश्य निरीक्षण और प्रतिनिधित्व के लिए अधिग्रहित सभी दिमागों की डिजिटल छवियां। (A-D) क्षैतिज ने लगातार कपाल खिड़की के आसपास क्षति दिखाई, चाहे यांत्रिक या थर्मल क्षति से। (E-H) बिंदु-दर-बिंदु ने परिणामों में काफी भिन्नता दिखाई, जो ड्रिलिंग के लिए कम विश्वसनीय विधि का संकेत देता है। (I-L) स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु अधिक सुसंगत था और ईबी फ्लोरोसेंट विश्लेषण और थर्मोकपल परिणामों में अंतर से मेल खाते हुए अन्य तरीकों की तुलना में कम दृश्य क्षति दिखाई। स्केल बार = 2 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

क्षैतिज बिन्दु स्पंदित नियंत्रण
क्षैतिज - 0.411 0.043* 0.043*
बिन्दु 0.411 - 0.486 0.043*
स्पंदित 0.043* 0.486 - 0.043*

तालिका 1: ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण। विभिन्न ड्रिलिंग तकनीकों के लिए ईबी फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम के परिणामों का विश्लेषण बेंजामिन-होचबर्ग सुधार के साथ क्रुस्कल-वालिस रैंक योग परीक्षण का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद विलकॉक्सन रैंक योग सटीक परीक्षण (एन = 4 प्रति समूह) का उपयोग करके जोड़ीवार तुलना की गई थी। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर को तारांकन * के साथ इंगित किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ईबी डाई और इमेजिंग का उपयोग नए तरीकों और तकनीकों के लिए मस्तिष्क में संवहनी क्षति का मूल्यांकन करने के लिए सीधा, त्वरित और उपयोगी है। चाहे सर्जिकल रोबोट का उपयोग करना हो या वर्तमान में प्रयोगशाला में किए गए तरीकों की पुष्टि करना हो, प्रयोगात्मक उपचार बनाम सर्जिकल प्रभाव के प्रभावों को अलग करने और पशु कल्याण में सुधार करने के लिए सर्जिकल विधियों को मान्य करना महत्वपूर्ण है। एक थर्मोकपल सेटअप ड्रिलिंग विधियों का मूल्यांकन करने में भी उपयोगी है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई हीटिंग नहीं होती है। हड्डी ड्रिलिंग के कारण तापमान में वृद्धि को ऊतक क्षति का कारण माना जाता है, और यहां तक कि 5 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि मस्तिष्क में बड़ी संवहनी क्षति का कारण बनने के लिए पर्याप्त है 32,33,34,35,36। प्रयोगशाला और शल्य चिकित्सा तकनीकों में सुधार के लिए यहां विस्तृत तरीकों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

मूल्यांकन के लिए उपयोगी होने के बावजूद, थर्मोकपल मूल्यांकन की कुछ सीमाएं हैं। थर्मोकपल डेटा को कैडेवर चूहों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है क्योंकि थर्मोकपल को मस्तिष्क में फिट करने के लिए खोपड़ी के किनारे में एक छेद ड्रिल करने की आवश्यकता होती है और परिणामस्वरूप मस्तिष्क को संभावित नुकसान होता है। नतीजतन, जानवर के शारीरिक तापमान के बजाय ड्रिलिंग में तापमान अंतर मापा जाता है। इसके अतिरिक्त, शारीरिक तापमान विनियमन कार्य हो सकते हैं जो विश्लेषण में शामिल नहीं हैं।

प्रोटोकॉल के दौरान कई कदम उचित ड्रिलिंग सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, खोपड़ी संरेखण, यदि गलत तरीके से किया जाता है, तो मस्तिष्क को नुकसान के साथ खराब ड्रिलिंग सटीकता होगी (यदि ऑटो-स्टॉप काम नहीं करता है)। सुनिश्चित करें कि इस मुद्दे से बचने के लिए झुकाव सुधार से पहले जानवर का बढ़ना जितना संभव हो उतना सीधा है। झुकाव सुधार प्रक्रिया का धीरे-धीरे और निश्चित रूप से पालन करके किसी भी झुकाव ऑफसेट को सही करें। इस अध्ययन के दौरान कुछ मामलों में झुकाव बंद था, जिससे ड्रिल सिस्टम का मानना था कि यह खोपड़ी में ड्रिलिंग कर रहा था, भले ही ड्रिल बिट ने खोपड़ी से संपर्क भी नहीं किया था। मोटे तौर पर, यह खोपड़ी की मोटाई को सटीक रूप से रिकॉर्ड करने के लिए एक मुद्दा है, और यदि पर्याप्त प्रबल है, तो ड्रिलिंग निर्देशांक में अशुद्धता का कारण बन सकता है। इसके अतिरिक्त, ऑटो-स्टॉप सुविधा असंगत थी और सावधानी के साथ उपयोग की जानी चाहिए। मस्तिष्क को नुकसान को रोकने के लिए पूरी तरह से ऑटो-स्टॉप फीचर पर भरोसा न करें। यह सुनिश्चित करने के लिए हमेशा ड्रिलिंग छेद की जांच करें कि ओवर-ड्रिलिंग न हो।

ऑटो-स्टॉप के बावजूद, कुछ अनुकूलन हैं जो बिंदु-दर-बिंदु और क्षैतिज ड्रिलिंग विधियों के लिए किए जा सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मस्तिष्क को कोई आकस्मिक क्षति न हो, बिंदु-दर-बिंदु एज कटिंग के दौरान एक ड्रिल ऑफसेट का उपयोग करता है, लेकिन उपयोगकर्ता को परीक्षण के माध्यम से पहले से इस सेटिंग को पूर्वनिर्धारित करना होगा। एक रैखिक प्रक्षेप विधि को आधार के रूप में उथले बीज बिंदु के साथ शामिल किया जा सकता है, ताकि खोपड़ी के चारों ओर मोटे बीजों पर, मस्तिष्क में क्षति न हो। यदि आवश्यक हो, तो उपयोगकर्ता हमेशा खोपड़ी के मोटे क्षेत्र में लौट सकता है और गहराई से ड्रिल कर सकता है। क्षैतिज काटने का चरण किनारे के बिंदुओं के चारों ओर प्रत्येक रोटेशन के लिए गहराई-काटने के अंतराल (100 μm का डिफ़ॉल्ट) का उपयोग करता है। यह खोपड़ी की मोटाई के आधार पर भी निर्धारित किया जा सकता है ताकि बहुत गहरी ड्रिलिंग और मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचा जा सके।

ट्रांसजेनिक चूहे इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मॉडल हैं। जबकि ट्रांसजेनिक चूहों में कपाल खिड़कियों के लिए एक सर्जिकल रोबोट का उपयोग इस अध्ययन में उजागर किया गया है, अन्य कपाल सर्जरी में सर्जिकल रोबोट के उपयोग पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। ड्रिलिंग को नियंत्रित और मानकीकृत करने की क्षमता पूरे क्षेत्र में बड़े जानवरों के अध्ययन में क्रैनियोटॉमी को लाभ प्रदान करती है। भले ही कुछ यांत्रिक क्षति को नेत्रहीन रूप से देखा गया था, यह चूहों में मस्तिष्क और खोपड़ी के बीच बेहद छोटे अलगाव के कारण सबसे अधिक संभावना है। चूहों जैसे बड़े जानवरों में अधिक सबरैक्नॉइड स्पेस और मोटा ड्यूरा होता है, जिससे रोबोटिक ड्रिलिंग25 के कारण यांत्रिक क्षति का खतरा कम होता है। यहां स्पंदित विधि का उपयोग करके दिखाए गए थर्मल क्षति में कमी के संयोजन में, सर्जिकल रोबोट में विभिन्न पशु मॉडल में ड्रिलिंग से होने वाले नुकसान को काफी कम करने की क्षमता है।

कुल मिलाकर, स्पंदित बिंदु-दर-बिंदु विधि ने कम से कम क्षति दिखाई, चाहे वह कम हीटिंग या मस्तिष्क को कम यांत्रिक क्षति के परिणामस्वरूप हो। हाथ से ड्रिलिंग क्षति से बचने के लिए एक अधिक नियंत्रित विधि प्रदान कर सकती है, लेकिन सर्जिकल रोबोट के लाभों को उजागर करना महत्वपूर्ण है। एक रोबोट को कम प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, सर्जन-से-सर्जन परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद कर सकता है, और एक बार पूरी तरह से अनुकूलित होने के बाद, प्रयोगशालाओं में अधिक मानकीकृत प्रक्रिया को उधार दे सकता है। इसके अतिरिक्त, एक सर्जिकल रोबोट के लिए सीखने की अवस्था हाथ से सर्जरी की तुलना में बहुत कम है। यह न केवल तकनीक सीखने के लिए आवश्यक समय को कम करता है, बल्कि प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को भी कम करता है। मस्तिष्क के माध्यम से मल्टीफोटॉन इमेजिंग के नवाचार के साथ कपाल खिड़की ड्रिलिंग का प्रसार बढ़ गया है जैसा कि प्रकाशित पत्रों20,37 में देखा गया है। थर्मोकपल और ईबी डाई इमेजिंग जैसे विशिष्ट तरीकों को नियोजित करने से ड्रिलिंग तकनीक को अनुकूलित करने में मदद मिलेगी, जबकि रोबोट का उपयोग कठिन सर्जरी को अधिक सुलभ और व्यापक बना देगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है। सामग्री अमेरिकी वयोवृद्ध मामलों के विभाग, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, या संयुक्त राज्य सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को मेरिट रिव्यू अवार्ड्स ग्रांट 12418820 (कैपाडोना) और ग्रांटी01आरएक्स003420 (शॉफस्टाल / कैपाडोना) और संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएस) डिपार्टमेंट ऑफ वेटरन्स अफेयर्स रिहैबिलिटेशन रिसर्च एंड डेवलपमेंट सर्विस से रिसर्च करियर साइंटिस्ट अवार्ड # ग्रांट 12635707 (कैपाडोना) द्वारा समर्थित किया गया था। इसके अतिरिक्त, इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक ग्रांट 12635723 (कैपाडोना), और नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल इमेजिंग एंड बायोइंजीनियरिंग, टी 32 ईबी004314, (कैपाडोना / किर्श) द्वारा भी समर्थित किया गया था। यह सामग्री अनुदान संख्या 12635723 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित कार्य पर आधारित है। इस सामग्री में व्यक्त कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों (ओं) की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Phosphate Buffered Saline
Type: Reagent		 VWR MRGF-6235 For Evans Blue dilution
Aura Software
Type: Tool		 Spectral Instruments Imaging Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems
Buprenorphine
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill)
Type: Tool		 Stoelting 58640-1
Carprofen
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility
Cefazolin
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility
Evans Blue Dye
Type: Reagent		 Millipore Sigma E2129 Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline
Isoflurane
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility
IVIS Lumina II
Type: Tool		 Perkin Elmer CLS136334 IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market
Jenco Linearizing Thermometer
Type: Tool		 Jenco 765JF For Thermocouple setup
Ketamine
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility
LivingImage
Type: Tool		 Perkin Elmer Software for IVIS Lumina III
Marcaine
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility
Neurostar Software
Type: Tool		 Stoelting Comes with surgical robot purchase
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor
Type: Tool		 Kent Scientific PS-03 Used to monitor vitals
PrismPlus mice
Type: Animal		 Jackson Labortory 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old Animals used for the study
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments
Type: Tool		 Stoelting 58640 Main robotic drill with stereotaxic frame
Thermocouple
Type: Tool		 TC Direct 206-557 For Thermocouple setup
USB-6008 Multifunction I/O DAQ
Type: Tool		 National Instruments USB-6008 For Thermocouple setup
Xylazine
Type: Drug		 Sourced from Animal Facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
  2. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  3. Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
  4. Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
  5. Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
  6. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
  7. Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
  8. Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
  9. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
  10. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
  11. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  12. Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
  13. Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
  14. Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
  15. Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
  16. Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
  17. Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
  18. Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
  19. Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
  20. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  21. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  22. Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
  23. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
  24. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  25. Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
  26. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  27. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
  28. Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
  29. Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
  30. Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
  31. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
  32. Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
  33. Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
  34. Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
  35. Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
  36. McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
  37. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 189
चूहों में क्रैनियल विंडो सर्जरी के लिए रोबोट-ड्रिल किए गए क्रैनियोटॉमी से थर्मल क्षति का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M.,… More

Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice. J. Vis. Exp. (189), e64188, doi:10.3791/64188 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter