Summary
颅窗已成为一种普遍实施的手术技术，允许在转基因小鼠中进行活体成像。该协议描述了手术机器人的使用，该机器人对颅窗进行半自动骨钻孔，可以帮助减少外科医生之间的变异性并部分减轻热血脑屏障损伤。
Abstract
颅窗手术允许使用多光子或其他活体成像技术对活小鼠的脑组织进行成像。然而，当用手进行任何开颅手术时，脑组织通常会受到热损伤，这本质上是手术与手术之间的变化，并且可能取决于个体外科医生的技术。实施手术机器人可以使手术标准化，并减少与手术相关的热损伤。在这项研究中，测试了三种机器人钻孔方法来评估热损伤：水平、逐点和脉冲逐点。水平钻孔使用连续钻孔原理图，而逐点钻孔围绕颅窗的几个孔。脉冲逐点增加了“2 s 开，2 s 关”钻孔方案，以允许在钻孔之间冷却。静脉注射的埃文斯蓝（EB）染料的荧光成像测量脑组织的损伤，而放置在钻孔部位下方的热电偶测量热损伤。热电偶结果表明，与水平（16.66 °C ± 2.08 °C）和逐点（18.69 °C ± 1.75 °C）组相比，脉冲逐点（6.90 °C ± 1.35 °C）组的温度变化显着降低。同样，与水平方法相比，脉冲逐点组在颅窗钻孔后也显示出显着减少的EB存在，表明对大脑血管的损害较小。因此，脉冲逐点钻孔方法似乎是减少热损伤的最佳方案。机器人钻头是一种有用的工具，可帮助最大程度地减少训练、可变性并减少热损伤。随着多光子成像在研究实验室中的使用越来越多，提高结果的严谨性和可重复性非常重要。这里讨论的方法将有助于告知其他人如何更好地使用这些手术机器人来进一步推进该领域。
Introduction
颅窗已在整个神经科学、神经工程和生物学领域得到普遍应用，以便对活体动物的皮层进行直接可视化和成像1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11.转基因小鼠和多光子成像的强大结合为体内大脑中的电路活动和其他生物学见解提供了极其有价值的见解12，13，14，15，16，17，18。安装在头骨上的微型显微镜进一步扩展了这些功能，使清醒的，自由移动的动物能够进行记录19。创建颅窗的过程需要电钻以薄或完全去除颅骨以产生足够大的颅骨切开术，以将一块透明玻璃固定在皮层20上。聚二甲基硅氧烷（PDMS）和其他聚合物也已作为颅窗材料9，21进行了测试。最终，理想的颅窗是不改变或干扰下方正常内源性活动的颅窗。然而，人们普遍认为，颅窗钻孔会加重下层组织，导致大脑损伤、环境破坏，并影响脑膜直至阻塞多光子成像深度22。由此产生的神经炎症具有广泛的影响，从血脑屏障（BBB）的通透性到植入部位周围神经胶质细胞的激活和募集23。因此，表征更安全、更可重复的颅窗钻孔方法对于一致的成像质量和减少混杂因素至关重要。
虽然注意尽量减少对下层组织的创伤，但钻孔骨骼的行为有可能对大脑造成热和机械扰动24，25。意外钻头插入硬脑膜造成的机械创伤可能进一步诱发不同程度的皮质损伤24。在Shoffstall等人25的一项研究中，骨钻孔产生的热量导致BBB渗透性增加，如脑实质25中存在埃文斯蓝（EB）染料所示。静脉注射的EB染料与血液中循环的白蛋白结合，因此通常不会以可观的浓度穿过健康的BBB。因此，EB染料通常用作BBB渗透性26，27的敏感标志物。虽然他们的研究没有直接测量BBB通透性对后续生物后遗症的影响，但先前的研究已将BBB通透性与对长期植入微电极的神经炎症反应增加和运动功能的改变相关联28。
根据研究目标，热损伤和机械损伤的程度可能会导致实验误差，从而对研究的严谨性和可重复性产生负面影响。有几十种引用的制作颅窗的方法，每种方法使用不同的钻孔设备，速度，技术和用户1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11。Shoffstall等人25报告说，观察到的加热结果变化归因于钻头施加的力，进给速率和应用角度的变化，以及手工钻孔时无法控制的其他方面25。人们认为，自动钻井系统和其他立体定位设备可以提高可重复性和结果一致性，但已发表的方法研究并未严格评估温度或BBB渗透性作为结果之一。因此，需要更可重复和一致应用的方法来产生颅窗，以及严格应用的方法来评估颅窗钻孔对下层神经组织的影响。
本研究的重点是确定和开发一致和安全的颅窗钻孔方法。用于颅窗安装的开颅术的尺寸明显大于用于脑植入微电极的标准开颅术。当使用标准设备时，这种开颅手术不能用单个毛刺孔完成，因此在手动进行时引入了更多的外科医生间技术差异20。外科钻孔机器人已引入现场，但尚未得到广泛采用1、6、29。钻井自动化提供了对变量的控制，这些变量有助于观察到试验间的变化，这表明使用该设备可以减少外科医生之间和外科医生内的影响。考虑到颅窗放置所需的较大开颅术的额外难度，这一点特别令人感兴趣。虽然人们可以假设自动化钻井所提供的控制有明显的好处，但对这些设备的实施几乎没有评估。虽然尚未观察到可见病变5，但需要使用EB进行更高的敏感性测试。
在这里，BBB渗透率是使用带有相应软件的市售外科钻孔机器人测量的，该软件允许对立体定位坐标，开颅规划/映射以及选择钻孔类型（“逐点”与“水平”）进行编程，参考钻头的布线路径。最初，钻八个“种子”点（图1A），勾勒出颅窗。从这里开始，使用“逐点”或“水平”钻孔方法切割种子之间的空间。“逐点”执行垂直导向孔切割（类似于CNC钻床），而“水平”沿轮廓孔的颅窗圆周执行水平切割（类似于CNC路由器）。这两种方法的结果都是一块头骨，可以移除以露出颅窗。为了隔离钻孔造成的损坏，不会物理移除颅窗，以避免任何额外的损坏。EB染料与荧光成像相结合的组合用于测量小鼠进行开颅后的BBB渗透性，插入的热电偶用于在钻孔过程中直接测量脑表面的温度（图1B，C）。先前的观察表明，间隔2秒的脉冲钻孔开/关足以减轻钻孔加热25，因此被纳入手术机器人的实验方法。
所介绍的工作的目的是演示评估开颅钻孔热损伤的方法。虽然这些方法是在自动钻井的背景下提出的，但这些方法也可以应用于手动钻井方案。这些方法可用于在采用作为标准程序之前验证设备和/或钻井方案的使用。
图 1：实验管道原理图。示意图显示了动物在颅窗手术后接受EB定量的过程。（A）带有立体定位框架和手术机器人钻头的鼠标的示意图设置。一个示例颅窗显示在运动皮层上，带有种子点（绿色）和边缘点（蓝色）。（B）灌注装置包括在整个动物体内注射1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）以去除任何血液，然后提取大脑。（C）然后将大脑放入EB荧光成像系统室，对埃文斯蓝染料进行荧光成像。请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
所有程序和动物护理实践均由路易斯斯托克斯克利夫兰退伍军人事务部医疗中心机构动物护理和使用委员会审查、批准和执行。
1. 手术机器人硬件设置
- 手术前，请按照手术机器人（见 材料表）手册和指南设置硬件和软件。按照手册中的详细说明执行帧校准。如果钻头或框架移动，建议重新校准钻头以确保精度。
2. 软件准备
- 导航到手术软件（请参阅 材料表）并通过选择从 干净的项目开始创建新项目。将主题设置为顶部的 鼠标 以指定要使用的钻孔坐标。
- 选择“ 启动新项目”。
- 从这里，单击左下角的 “规划” 以导航到钻井坐标规划屏幕。为要执行的颅窗技术创建钻孔方案。
- 为此，请单击立体定位图谱上的任意位置。使用布雷格玛作为参考，并为运动皮层输入以下坐标：AP = 1.50，ML = 1.25，DV = 0.00。按键盘上的 Enter 键以更新所选坐标。
注意：背腹（DV）坐标表示钻孔深度，因此此处不需要输入。 - 单击 存储目标 以保存这些坐标并输入适当的名称。从这里，单击左下角的“ 移动” 按钮导航回主钻孔屏幕。
- 为此，请单击立体定位图谱上的任意位置。使用布雷格玛作为参考，并为运动皮层输入以下坐标：AP = 1.50，ML = 1.25，DV = 0.00。按键盘上的 Enter 键以更新所选坐标。
- 单击“ 项目工具>>另存为 ”以在以后的项目中重用此模板项目。这将自动保留钻孔坐标供以后使用。
3. 手术准备
- 在异氟醚室（1.5L / min O2中为3.5%）麻醉PrismPlus小鼠30，31（参见材料表）。涂抹眼睛润滑剂以防止眼睛干燥，使用剪刀剃光头部，并修剪指甲以防止小鼠刮伤缝合线。
注意：PrismPlus小鼠是一种用于多光子成像的转基因荧光物种。杂合PrismPlus小鼠缺乏荧光基因，因此在这里用于减少其他正在进行的研究中的动物粪便，并且由于本研究中没有多光子成像。预计野生型小鼠将显示出类似的结果。 - 向麻醉小鼠皮下注射抗生素头孢唑啉（24mg / kg），镇痛药卡洛芬（5mg / kg）和丁丙诺啡（0.05-0.10mg / kg）。在任何切口之前，在切口部位下方（从眼睛后面开始沿颅骨中线1英寸）皮下注射单次马卡因（0.25%，100μL）。
注意：此处使用的药物遵循先前建立的IACUC协议。但是，建议考虑将EMLA乳膏作为局部麻醉剂，以便在手术和尾静脉注射以及美洛昔康SR代替卡洛芬之前产生多模式效果。EMLA 和美洛昔康 SR 可在异氟烷麻醉前提供。 - 使用提供的耳杆将动物安装在手术机器人立体定位框架上，并通过鼻锥吸入 0.5 %-2%异氟醚维持麻醉。
- 确保由训练有素的兽医技术人员或工作人员根据鼠标的反应性、呼吸（~55-65 次呼吸/分钟）、心率（300-450 次/分钟）和颜色（粉红色）密切监测麻醉深度。胡须和定期捏脚趾也可以用作确定麻醉深度的措施。生命体征的值由IACUC机构法规确定。
- 在循环水垫上保持动物体温，并使用血氧和心率测量系统监测生命体征。
- 用葡萄糖酸氯己定（CHG）和70%异丙醇擦洗手术区域进行灭菌。为了在手术过程中保持无菌，请在小鼠和立体定位框架上放置无菌保鲜膜。
注意：虽然这些协议是为生存手术开发的，但所提供的数据反映了非生存动物的使用，因为重点是测试和确定适当的钻孔协议方法。
4. 颅骨准备
- 使用手术刀刀片，从眼睛后部开始，在颅骨中线进行 1 英寸的切口。
- 将皮肤向后拉以露出颅骨，并（可选）使用牵开器来维持手术窗口。使用无菌棉头涂抹器去除任何残留的组织和膜。
- 用3%的过氧化氢和棉头涂抹器擦干并清洁头骨。
注意：这将使颅骨的缝合线可见。Bregma和Lambda应该很容易看到。如果没有，请涂抹更多的过氧化氢或增加切口的大小。 - 根据制造商的建议，通过将鳄鱼夹电缆从手术机器人钻孔装置连接到鼠标，允许“自动停止”功能。“自动停止”通过检测阻抗变化来工作，因此一旦钻头接触脑脊液（CSF）而不是骨骼，钻头将停止钻孔，从而防止对大脑造成损害。
5.埃文斯蓝尾静脉注射
注意：EB是一种可能的致癌物质。处理时戴手套。
- 要准备便于注射的尾巴，请用酒精湿巾擦拭。可选地，可以局部应用冬青油来扩张静脉35。
- 一只手抓住尾巴，另一只手处理装有EB的注射器。使用拇指和食指弯曲尾巴，使尾部静脉暴露在尾巴弯曲的顶部。将注射器（1或2mL，30G胰岛素注射器）与静脉平行插入，并缓慢注射EB体积。EB（4% w / v）通过尾静脉注射 以 2mL / kg体重的浓度施用。
注意：如果正确插入针头，可以感觉到从注射器流入尾部的阻力很小甚至没有。如果有阻力或尾巴上出现EB染料，请在尾部向下移动并重试。 - 注射后，等待5分钟，让EB在整个小鼠中循环，然后再开始钻孔。当小鼠的四肢和手术窗口变为蓝色时，立即验证成功的注射。
6. 手术机器人钻孔程序
- 一旦颅骨准备好钻孔，请导航回手术软件。打开步骤 2.4 中定义的模板项目，其中指定了钻孔坐标。
- 按照“新建项目” >>“工具”>“选择模板项目 ”，然后选择在步骤 2（软件准备）中指定的模板项目。
- 选择“相同协议”元素>“规划（目标点）”>“钻探参数”以延续到此新项目。
- 单击 “启动新项目”。
- 接下来，校正钻头和框架，以考虑当前动物的小鼠头骨的倾斜和缩放。单击 “工具 ”，然后选择 “倾斜和缩放...”以 打开校正屏幕。在屏幕顶部，通过单击浅红色的钻头按钮，确保 钻 头处于活动状态（而不是注射器）。
注意：激活后， “钻头 ”按钮将变为深红色/亮红色。注射器按钮可以忽略，因为本协议中未使用该按钮。- 首先，通过设置布雷格玛和 Lambda 在当前动物上的位置来校正比例、俯仰和偏航。利用键盘控件或屏幕上的控件移动钻头。钻头位于布雷格玛上方后，将其降低，直到它刚好接触到头骨，然后单击 设置布雷格玛。对 Lambda 重复此操作。
- 接下来，针对颅骨的特定滚动进行调整。单击转到 中点 按钮，将钻头自动调整到头骨的中心。向 左单击 2 毫米 ，然后慢慢降低钻头，直到接触头骨。单击设置 左点。
- 对大脑右侧重复步骤6.2.2。现在，系统已针对此特定头骨进行了设置。
注意：此处的校正对于确保正确的钻孔坐标和深度至关重要。鼠标需要尽可能靠近直线安装，以尽可能减少校正的需要。如果需要大修正，可能会导致钻孔精度降低。
- 执行更正后，通过单击 关闭 在屏幕的底部中间。通过单击 导航到钻孔屏幕 工具 ，然后选择 钻。。。 开始钻孔过程。
- 确保从屏幕顶部的“钻头”下拉列表中选择“开颅形状”。然后，单击“选择钻孔中心和形状”，并选择在步骤 2.3.1 中命名的预定义靶区。在此屏幕下，选择圆形作为目标的形状，并输入 2.60 毫米作为圆的直径2。单击显示。
注意： 颅窗的直径是使用钻头的中心作为种子点的中心创建的。使用小钻头（直径 = 0.6 mm 或供应商提供的推荐钻头尺寸）来最大程度地减少因使用较大钻头而增加的额外直径。专用钻头专门用于手术机器人。八个种子点和边缘点现在将分别在头骨上显示为绿色和蓝色点。 - 单击主窗口并使用键盘快捷键 Control + Shift + D 调出屏幕右侧的 钻孔点 菜单。这允许查看特定的钻点深度和状态。
- 在钻孔开始之前，如果需要，请通过单击“自动停止”复选框旁边的按钮来自定义 自动停止 功能。此按钮默认为 “中”，对应于自动停止功能的灵敏度。
注意：可以事先进行测试，以找到适合动物的灵敏度。在该协议中，使用最高灵敏度来确保通过大脑的最小钻孔。 - 启用并自定义自动停止功能后，开始钻取种子点。单击 “自动扫描 ”，以便从种子 1 自动开始钻探。一旦钻头接触脑脊液，自动停止功能将检测到阻抗的变化，导致钻孔停止并将钻头从颅骨中缩回。
- 密切关注钻孔，以防自动停止无法检测到任何变化。可以按 Esc 键手动取消钻孔。也可以单击位于“钻孔”菜单底部和阻抗值右侧的粉红色圆圈以开始或停止钻孔。
注意： 钻头将自动钻孔到等于估计颅骨厚度的深度（或直到激活自动停止功能）。 - 如果在达到估计深度之前未激活自动停止，将弹出一个屏幕，提示用户：1）继续 钻孔并进一步下降#mm，2） 标记当前深度并继续，3） 跳过当前点并继续，或4） 停止该过程（以后可能会继续）。选择其中一个选项，如下所述。
- 对于 继续钻孔并进一步下降 # mm，输入钻头前进的距离。默认情况下，使用 0.1 毫米。可以建议较小的距离以防止意外穿透大脑。
- 如果认为在此屏幕上已达到硬脑膜，请选择“在当前深度标记并继续”选项，以便系统在该 深度标记 硬脑膜并继续下一个种子。
- 使用 跳过当前点并 继续和停止 该过程（稍后可能会继续） 对钻头进行故障排除或清理钻头，并在自动停止再次运行后返回。
- 钻完所有种子点后，如果使用自动停止功能未完成任何种子点，请使用硬脑膜拾取手动检查孔的深度。这将确保钻孔深度确实穿透了头骨。
- 在开始边点钻孔之前，通过选择“钻孔”菜单上“边切”文本旁边的下拉菜单来确定所需的“ 边切 ”类型。这两个选项是 逐点 和 水平。
- 选择 “逐点 ”以单独钻取每个边缘点，并钻取到由相邻种子点深度确定的深度。如果需要，可以通过下面的 “边缘缩放...” 按钮调整缩放比例，尽管默认值“无缩放”通常就足够了。
- 选择 “水平” 以从边缘点 1 开始钻孔，并使用连续钻孔运动绕钻孔圆的整个圆周。默认情况下，水平切割将以 100 μm 的间隔切割，一直围绕窗口的圆周进行切割，然后再深入 100 μm。如果需要，请在下面的 “切割选项... ”按钮下更改间隔深度和钻孔速度。
- 使用自动剪切偏移（在“边切割”框下方）通过从相邻种子点获取预定偏移来调整自动剪切深度。在该协议中，使用了20μm的自动切割偏移。可以进行进一步的测试以确定每只动物的最佳偏移量。
- 确定边切设置后，通过单击“钻孔”（Drill） 菜单中间的“ 自动切割 ”按钮开始刃点钻孔。对于逐点钻孔，钻完最后一个边缘后，钻孔过程就完成了。对于水平钻孔，继续，直到钻出足够的颅骨以释放颅窗。
注意：虽然在可以释放窗口之前进行钻孔，但此处不会物理释放窗口以防止对下层组织造成任何损坏。隔离仅钻孔造成的损坏以评估不同的钻孔原理图非常重要。- 水平钻孔达到一个种子点的深度后，在“钻取点”菜单中右键单击该种子（或先选择多个点），然后单击“ 锁定深度”。这将允许水平切割继续，而不会对该区域进行更深的切割（从而避免穿透大脑）。
注意：如果种子点的硬脑膜深度不同，这可能会导致水平钻孔过程所需的深度不同。
- 水平钻孔达到一个种子点的深度后，在“钻取点”菜单中右键单击该种子（或先选择多个点），然后单击“ 锁定深度”。这将允许水平切割继续，而不会对该区域进行更深的切割（从而避免穿透大脑）。
- 如果自动停止功能无法正常工作，请确保钻头完全清除任何碎屑或潜在的血液、盐水等，因为这些可能会影响钻头的基极阻抗。此外，从下面描述的几个手动钻孔选项中选择一种，以防自动停止无法始终如一地工作。
- 在“钻孔”菜单中，通过右键单击种子或边并选择“ 转到进入”，手动导航到每个种子。还有清除标记的深度、重置孔和其他可以帮助钻孔过程的选项。
- 通过从“钻取”菜单顶部附近的 “高级：”文本旁边的下拉列表中选择一个深度，手动控制钻取深度前进。单击正下方的 “前进” 按钮，将钻孔推进到设定的距离。
注意： 此功能可与“前进”按钮下方的“设置硬脑膜”和“设置表面”按钮结合使用，以手动告知系统颅骨表面和硬脑膜的位置。尽可能使用自动停止功能，但如果需要，这些手动选项也足够了。 - 如果手动钻孔，请在每个钻孔深度间隔之间更加小心，以确保钻头不超过硬膜。在深度间隔之间使用硬脑膜镐检查钻孔，以确认是否达到了硬脑膜。完成所有手动种子钻孔后，按上述正常方式继续切边程序。
- 脉冲法
- 要执行手动脉冲钻孔，请通过取消选中钻孔菜单中自动停止选项旁边的复选框来关闭自动 停止 功能。这必须关闭，以便控制钻头何时关闭脉冲。
注意：脉冲钻孔遵循 2 秒钻孔的模式，然后 2 秒不钻孔，以使头骨冷却。 - 在“钻头”菜单中，选择 100 μm 作为钻孔深度推进，这相当于向下钻孔的 ~2 秒。
- 准备就绪后，单击 “前进 ”开始钻取。
注意：一旦钻头前进 100 μm，请准备好快速停止钻头，因为钻头继续在深度旋转，直到 按下逃生 物（产生不必要的热量）。 - 钻头前进 100 μm 后，按 Esc 两次以停止钻头。2秒后，对头骨的深度重复这个循环。
注意：由于软件和机械限制，只能使用脉冲方法执行逐点方法。连续水平钻孔不能以这种方式进行。 - 使用上面详述的此方法钻取所有种子和边缘点。确保在达到硬脑膜后使用“钻”菜单中的按钮设置 杜拉 。
- 要执行手动脉冲钻孔，请通过取消选中钻孔菜单中自动停止选项旁边的复选框来关闭自动 停止 功能。这必须关闭，以便控制钻头何时关闭脉冲。
- 确保从屏幕顶部的“钻头”下拉列表中选择“开颅形状”。然后，单击“选择钻孔中心和形状”，并选择在步骤 2.3.1 中命名的预定义靶区。在此屏幕下，选择圆形作为目标的形状，并输入 2.60 毫米作为圆的直径2。单击显示。
7. 灌注和脑提取
- 种子和边缘点的钻孔完成后，将动物置于异氟醚麻醉下再放置1小时，以使EB染料通过受损的BBB循环和外渗。进行心脏灌注以从血管中取出任何血液或液体，然后取出大脑进行成像和分析，如下所述。
- 在颅窗创建后的1小时EB循环期后，腹膜内注射氯胺酮（160mg / kg）和甲苯噻嗪（20mg / kg）的混合物。一旦无反应，进行心脏灌注。
- 用剪刀切开小鼠的腹部，通过垂直切过肋骨和水平穿过横膈膜来露出心脏。缩回肋骨以清晰地观察心脏。将蝶针插入心脏的左心室，并开始在全身输注 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。剪断心脏右心房的一小部分以释放压力积聚。
- 在 25 mL 的 1x PBS 灌注全身后，停止灌注并将小鼠斩首作为安乐死的次要手段。
注意：一定要对动物执行机构批准的安乐死和/或终点灌注方法以分离大脑。 - 从这里开始，通过用 rongeurs 去除骨骼和组织来从头骨中提取大脑。
- 用荧光成像系统对提取的大脑进行成像，以观察位于钻井地点周围大脑中的EB量。
注意：EB与循环白蛋白结合。如果大脑发生血管损伤，EB会泄漏出来并与脑组织结合，从而产生清晰的损伤视觉指标。
8. 埃文斯蓝成像和分析
- 硬件初始化
- 打开连接到EB荧光成像系统的计算机，并在准备其他项目时启动成像软件（参见 材料表）。按此顺序打开光源、平台和相机。
- 导航到成像软件，然后单击采集控制面板下的初始化。初始化完成后，系统和腔室将立即发出从红色到绿色的信号。
注意：在任何成像前30分钟初始化EB荧光成像系统，以使光源的温度达到最佳水平。
- 大脑成像
- 将植入的大脑放在舞台中央的透明盘中进行成像。
- 在 采集控制面板下，调整图像的设置。选择曝光时间：1秒;分箱：中等;挡板： F1;激发波长：535 至 675 nm;排放：Cy 5.5;灯电平：高;视场：5厘米。保持滤光片锁定，并检查摄影和荧光的叠加。这些设置基于以前的实验室经验和其他已发布的EB36成像方法。
- 将EB荧光成像系统图像加载到开放访问图像处理软件（参见 材料表）中，并生成三个手绘感兴趣区域（ROI），通过测量背景，整个大脑和颅窗上的平均辐射来找到EB的荧光强度。
- 根据相应的背景ROI规范化颅窗和全脑测量。
- 在不同的激发滤光片（535-675nm）下对每个大脑进行成像，以找到实验组与盐水对照之间信噪比最高的波长（选择605nm）。
- 分离适当波长和平均值下的平均辐射度，以获得整个大脑和颅窗ROI的平均平均辐射度或荧光强度。
- 根据盐水对照，查找并归一化每组颅窗区域的平均平均辐射度。
9. 热电偶评估
- 使用热电偶（见 材料表）结合三种不同的钻孔方案测量颅骨和大脑的温度变化。热电偶连接到数据采集系统（DAQ），该系统允许将测量值读取到MATLAB中。
- 将尸体鼠标安装到立体定位框架和机器人钻头设置上。手动钻一个小孔（与种子点大小相同）~2毫米，距离颅窗将进入颅骨25的一侧。该孔将允许热电偶滑入颅窗钻孔的位置（图2D）。
注意：使用尸体小鼠是因为需要钻开头骨的侧面才能将热电偶滑过颅窗钻孔区域。这只尸体小鼠与以前用于埃文斯蓝分析的动物不同。 - 按照前面（步骤 6）的方式开始三个方案中每个方案的钻取过程。当钻头穿过颅骨时，温度变化会出现峰值，表明大脑附近发生加热。
- 在 MATLAB 中记录并绘制结果以计算最大温差。对于种子钻孔和边缘钻孔，应分别进行此操作，以评估水平钻孔与逐点钻孔以及脉冲手动钻孔方法。
10. 统计
- 使用Kruskal-Wallis秩和检验和Benjamini-Hochberg校正对R中的热电偶和EB荧光成像进行统计分析，然后使用Wilcoxon秩和精确检验25进行成对比较。
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Representative Results
热评估
通过使用水平（图2A）、逐点（图2B）和脉冲逐点（图2C）方法测量钻孔引起的温度与基线的变化来评估热损伤的可能性。图2D显示了获取热数据的实验设置。使用N = 4颅窗的样本量进行热评估。水平和逐点使用相同的种子钻孔示意图，但边缘点的切割方式有所不同。脉冲逐点对种子和边缘钻孔部分均采用脉冲方法。水平钻研的最大温度变化为16.66 °C±2.08 °C，边缘钻孔的最大温度变化为9.08 °C±0.37 °C。 逐点钻研的最大温度变化为18.69 °C±1.75 °C，边缘钻孔的最大温度变化为8.53 °C±0.36 °C。 脉冲逐点法，种子钻孔的最大温度变化为6.90 °C±1.35 °C，而边缘钻孔的最大温度变化为4.10 °C±0.51 °C。 水平钻井方案和逐点钻井方案均显示出热变化的不显着差异。然而，与水平和逐点钻孔相比，改用脉冲逐点方法导致大脑的热量（p < 0.05）显着减少（图2E，F）。还记录了手术的持续时间，因为这可能会影响活体手术的动物生存能力。对于这两种自动化方法，种子钻孔平均需要 360 秒。水平边缘钻孔需要 300 秒，而逐点边缘钻孔需要 200 秒。脉冲法花费的时间最长，种子和边缘钻孔各需要大约500秒。然而，这些差异还不足以保证任何考虑，因为手术通常可以持续2-3小时以上。
图 2：热评估。 根据钻孔方法导致大脑中的最大温度变化评估热损伤的可能性。（A）水平钻孔和（B）逐点钻孔产生的热量相似，而（C）脉冲2秒开，2秒逐点方法显示最小热量。（E）种子钻孔和（F）边缘钻孔导致脉冲逐点钻孔方法的热变化显着减少（p < 0.05，每个条件N = 4）。（D）将热电偶放置在进行钻孔的小鼠尸体的头骨下方。数据通过DAQ采集并输入计算机进行分析。 请点击此处查看此图的大图。
血管损伤
图3 显示了钻孔方案与血管损伤之间的关系。 表1 显示了每个钻井方案的p值，经过步骤10所示的统计分析。每组N = 4的样本量用于EB染料评估。EB含量较高的存在是BBB损坏的直接指标，其中逐点、水平和脉冲钻孔方法明显大于对照方法（均p = 0.043; 表 1）。与水平钻孔相比，逐点法在EB存在方面没有显示出任何显着差异（p = 0.411）。这两种方案都采用了自动停止功能来防止钻入大脑;但是，这种自动停止功能通常无法防止损坏。共享种子钻孔部分的自动停止失败可能导致未知的过度损坏，使技术之间的区别复杂化。因此，与没有自动停止的脉冲逐点方法进行了成对比较，以评估没有自动停止的其他两种方法。逐点脉冲法与逐点脉冲法相比没有显著差异（p = 0.486），而脉冲逐点法的EB明显少于水平法（p = 0.043）。脉冲逐点方法和逐点方法之间的不显著性可能是由于逐点钻孔的巨大差异（图4）。
图3显示了具有适当自动停止功能的水平（图3C）和逐点（图3D）钻孔的代表性图像。在视觉上，通过EB荧光成像，与对照组相比，通过逐点和水平切割钻孔被认为会损害大脑中的脉管系统（图3A，B）。脉冲逐点法（图3E）在种子点和边缘点的局部损伤较小，但在颅窗内仍有可见的EB存在。
图3：血管损伤。 用于确定颅窗开颅术影响区域的平均辐射度的外植脑 （1） 和相应的 ROI （2） 的 EB 荧光图像。（A）小鼠在没有颅窗手术的情况下注射EB以获得脑脉管系统中存在的基线背景EB。（B）仅向小鼠注射生理盐水并进行颅窗开颅术。这确定了所测量的平均辐射度归因于由于颅窗部位附近的血管渗漏和血管创伤而导致的EB积累。（C）小鼠注射EB，采用自动钻孔的水平方法创建颅窗。（D）小鼠注射EB，通过自动钻孔的逐点方法创建颅窗。（E）在小鼠（n = 2）注射EB后，用逐点脉冲钻孔方法产生的颅窗的两个代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。
目视检查损坏情况
目视检查大脑显示大脑表面的物理损伤（图4）。面板 A-D 演示了水平钻孔的 EB 存在，面板 E-H 是逐点方法，面板 I-L 是脉冲逐点方法。“逐点”执行垂直引导孔切割，而“水平”执行沿轮廓孔的颅窗圆周的水平切割。“脉冲逐点”采用与逐点相同的方法，不使用自动停止功能，并且取决于用户以设定的深度增量停止钻孔。尽管已经找到了一种方法，可以最大限度地减少对大脑的热损伤，但仍然存在钻头造成的机械损伤问题。理想情况下，自动停止功能可以检测脑脊液并在损伤脑组织之前停止钻孔，但似乎不能始终如一地工作。即使在脉冲手动钻孔中非常小心，大脑仍然有视力损伤。这可能是两个因素的结果：1）手工钻孔缺乏控制和感觉，2）小动物（如小鼠）头骨和大脑之间的分离深度。手工钻孔可以提供一种更可控的方法，通过足够的练习和专业知识在不损害大脑的情况下穿过颅骨。然而，与即插即用机器人相比，需要更高的技能和培训，这将允许几个“外科医生”为同一研究做出贡献 - 这不是皮层内微电极领域的常见做法。对于小鼠，大脑和头骨之间的距离非常小，因此即使是最轻微的10μm过度钻孔也会导致大脑的机械损伤。
图 4：目视检查损坏情况。 获取所有大脑的数字图像，用于三种钻探方法中的每一种的视觉检查和表示。（公元至日）水平始终显示颅窗周围的损伤，无论是机械损伤还是热损伤。（E-H）逐点分析的结果差异很大，表明钻探方法不太可靠。（一至一）与其他方法相比，逐点脉冲更一致，并且显示的视觉损伤更少，与EB荧光分析和热电偶结果的差异相匹配。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看此图的大图。
| 水平 | 点 | 脉冲 | 控制 | |
| 水平 | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| 点 | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| 脉冲 | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
表1：EB荧光成像结果的统计分析。 使用Kruskal-Wallis秩和检验和Benjamin-Hochberg校正分析不同钻井技术的EB荧光成像系统的结果，然后使用Wilcoxon秩和精确检验（每组N = 4）进行成对比较。组之间的显著差异用星号 * 表示。
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Discussion
EB染料和成像的使用简单，快速且可用于评估大脑中的血管损伤，以获取新的方法和技术。无论是使用手术机器人还是确认目前在实验室中完成的方法，验证手术方法以隔离实验性治疗与手术影响的效果并改善动物福利非常重要。热电偶设置在评估钻孔方法以确保不会发生加热时也很有用。已知由于骨钻孔引起的温度升高会导致组织损伤，即使升高5°C也足以导致大脑中的大血管损伤32，33，34，35，36。建议使用此处详述的方法改进实验室和手术技术。
虽然热电偶评估对评估有用，但有一些局限性。热电偶数据是使用尸体小鼠获取的，因为需要在头骨侧面钻一个孔以将热电偶放入大脑中，并可能因此对大脑造成损害。因此，测量的是钻孔过程中的温差，而不是动物的生理温度。此外，分析中可能未包含生理温度调节功能。
协议过程中的几个步骤对于确保正确钻孔至关重要。首先，如果头骨对齐不正确，将导致钻孔精度差以及对大脑的损害（如果自动停止不起作用）。在倾斜校正之前，请确保动物的安装尽可能笔直，以避免此问题。通过缓慢而坚定地遵循倾斜校正过程来校正任何倾斜偏移。在这项研究中的少数情况下，倾斜是关闭的，导致钻孔系统认为它正在钻入头骨，即使钻头甚至没有接触头骨。在很大程度上，这是准确记录头骨厚度的问题，如果足够严重，可能会导致钻孔坐标不准确。此外，自动停止功能不一致，必须谨慎使用。不要仅仅依靠自动停止功能来防止对大脑的损害。始终检查钻孔以确保不会发生过度钻孔。
无论自动停止如何，都可以针对逐点和水平钻孔方法执行一些优化。为了确保不会对大脑造成意外损害，在边缘切割过程中逐点使用钻头偏移，但用户必须通过测试事先预先确定此设置。可以结合线性插值方法，以最浅的种子点为基础，这样在头骨周围较厚的种子处，大脑就不会发生损伤。如果需要，用户始终可以返回颅骨较厚的区域并钻得更深。水平切割步骤对围绕边缘点的每次旋转使用深度切割间隔（默认为 100 μm）。这也可以根据头骨厚度来确定，以避免钻得太深而损害大脑。
转基因小鼠是活体多光子成像的强大实验模型。虽然本研究强调了在转基因小鼠的颅窗中使用手术机器人，但重要的是要注意手术机器人在其他颅骨手术中的使用。控制和标准化钻孔的能力为整个领域的大型动物研究中的颅骨切开术提供了好处。尽管在视觉上观察到了一些机械损伤，但这很可能是由于小鼠大脑和头骨之间的分离极小。较大的动物，如大鼠，具有更多的蛛网膜下腔空间和更厚的硬脑膜，由于机器人钻孔，机械损伤的风险较小25。结合此处使用脉冲方法显示的热损伤减少，手术机器人有可能显着减少在各种动物模型上钻孔造成的损伤。
总体而言，脉冲逐点方法显示出最少的损害，无论是由于对大脑的加热较少还是机械损伤较少。手工钻孔可能提供了一种更可控的方法来避免损坏，但重要的是要强调手术机器人的好处。机器人需要更少的培训，可以帮助减少外科医生之间的可变性，一旦完全优化，就可以在实验室中实现更标准化的程序。此外，手术机器人的学习曲线远低于手工手术。这不仅减少了学习该技术所需的时间，而且还减少了用于训练目的的动物数量。颅窗钻孔的流行率随着通过大脑的多光子成像的创新而增加，如已发表的论文20，37所示。采用热电偶和EB染料成像等表征方法将有助于优化钻孔技术，而机器人的使用将使困难的手术更容易获得和普及。
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Disclosures
作者没有任何利益冲突需要报告。内容不代表美国退伍军人事务部、美国国立卫生研究院或美国政府的观点。
Acknowledgments
这项研究得到了优异评论奖GRANT12418820（Capadona）和GRANTI01RX003420（Shoffstall / Capadona）以及美国退伍军人事务部康复研究与发展服务的研究职业科学家奖#GRANT12635707（Capadona）的部分支持。此外，这项工作还得到了美国国立卫生研究院，国家神经疾病和中风研究所GRANT12635723（Capadona）和国家生物医学成像和生物工程研究所T32EB004314（Capadona/Kirsch）的部分支持。本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金支持的工作，资助号为GRANT12635723。本材料中表达的任何意见、发现、结论或建议均为作者的观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
