Summary
Kranialfönster har blivit en allmänt implementerad kirurgisk teknik för att möjliggöra intravital avbildning i transgena möss. Detta protokoll beskriver användningen av en kirurgisk robot som utför halvautomatisk benborrning av kranialfönster och kan bidra till att minska variationen mellan kirurger och delvis mildra termiska skador på blod-hjärnbarriären.
Abstract
Kranial fönsterkirurgi möjliggör avbildning av hjärnvävnad hos levande möss med användning av multifoton eller andra intravitala avbildningstekniker. Men när man utför någon kraniotomi för hand finns det ofta termisk skada på hjärnvävnaden, vilket i sig är variabel kirurgi till kirurgi och kan vara beroende av individuell kirurgteknik. Implementering av en kirurgisk robot kan standardisera kirurgi och leda till en minskning av termiska skador i samband med kirurgi. I denna studie testades tre metoder för robotborrning för att utvärdera termiska skador: horisontell, punkt för punkt och pulsad punkt för punkt. Horisontell borrning använder ett schema för kontinuerlig borrning, medan punkt för punkt borrar flera hål som omfattar kranialfönstret. Pulsad punkt för punkt lägger till ett "2 s på, 2 s av" borrschema för att möjliggöra kylning mellan borrningen. Fluorescerande avbildning av Evans Blue (EB) färgämne injicerat intravenöst mäter skador på hjärnvävnad, medan ett termoelement placerat under borrplatsen mäter termisk skada. Termoelementresultaten indikerar en signifikant minskning av temperaturförändringen i den pulsade punkt-för-punkt-gruppen (6,90 °C ± 1,35 °C) jämfört med den horisontella (16,66 °C ± 2,08 °C) och punkt-för-punkt (18,69 °C ± 1,75 °C). På samma sätt visade den pulsade punkt-för-punkt-gruppen också signifikant mindre EB-närvaro efter kranialfönsterborrning jämfört med den horisontella metoden, vilket indikerar mindre skador på blodkärlen i hjärnan. Således verkar en pulsad punkt-för-punkt-borrmetod vara det optimala schemat för att minska termiska skador. En robotborr är ett användbart verktyg för att minimera träning, variation och minska termiska skador. Med den ökande användningen av multifotonavbildning över forskningslaboratorier är det viktigt att förbättra resultatens noggrannhet och reproducerbarhet. Metoderna som behandlas här kommer att hjälpa till att informera andra om hur man bättre kan använda dessa kirurgiska robotar för att ytterligare främja fältet.
Introduction
Kranialfönster har blivit allestädes närvarande inom neurovetenskap, neuralteknik och biologi för att möjliggöra direkt visualisering och avbildning av cortex hos levande djur 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftfulla kombinationen av transgena möss och multifotonavbildning har gett extremt värdefulla insikter i kretsaktivitet och andra biologiska insikter i in vivo-hjärnan 12,13,14,15,16,17,18. Miniatyrmikroskop monterade på skallen har ytterligare utökat dessa möjligheter för att möjliggöra inspelningar i vakna, fritt rörliga djur19. Processen att skapa ett kranialfönster kräver kraftborrning för att tunna eller helt ta bort kranialbenet för att producera tillräckligt stora kraniotomier för att säkra en transparent glasbit över cortex20. Polydimetylsiloxan (PDMS) och andra polymerer har också testats som kranialfönstermaterial 9,21. I slutändan är det ideala kranialfönstret ett som inte förändrar eller stör normal endogen aktivitet under. Det är emellertid allmänt accepterat att kranial fönsterborrning förvärrar underliggande vävnad, vilket leder till skador på hjärnan, störningar i miljön och påverkar hjärnhinnorna till den grad att multifotonbilddjupet22 tillsluts. Den resulterande neuroinflammationen har ett brett spektrum av effekter som sträcker sig från permeabilitet av blod-hjärnbarriären (BBB), till aktivering och rekrytering av gliaceller runt implantatstället23. Därför är det avgörande att karakterisera säkrare och mer reproducerbara metoder för borrning av kranialfönster för att uppnå konsekvent bildkvalitet och minska störfaktorer.
Medan försiktighet vidtas för att minimera trauma mot den underliggande vävnaden, har borrningen av benet potential att orsaka både termiska och mekaniska störningar i hjärnan24,25. Mekaniskt trauma från oavsiktlig borrpenetration i dura kan ytterligare inducera varierande grader av kortikal skada24. I en studie av Shoffstall et al.25 resulterade värmen från benborrning i en ökad BBB-permeabilitet, vilket indikeras av närvaron av Evans Blue (EB) färgämne i hjärnparenkymet25. EB-färgämne, injicerat intravenöst, binder till cirkulerande albumin i blodomloppet och passerar därför normalt inte en hälsosam BBB i märkbara koncentrationer. Som ett resultat används EB-färgämne vanligtvis som en känslig markör för BBB-permeabilitet26,27. Medan deras studie inte direkt mätte effekten av BBB-permeabiliteten på efterföljande biologiska följder som studerades, har tidigare studier korrelerat BBB-permeabilitet till ett ökat neuroinflammatoriskt svar på kroniskt implanterade mikroelektroder och förändringar i motorisk funktion28.
Beroende på studiens mål kan storleken på termisk och mekanisk skada bidra till en källa till experimentellt fel, vilket negativt påverkar studiens rigor och reproducerbarhet. Det finns dussintals citerade metoder för att producera kranialfönster, var och en med olika borrutrustning, hastigheter, tekniker och användare 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterade att den observerade variationen i uppvärmningsresultaten tillskrevs variabilitet i borrens applicerade kraft, matningshastighet och appliceringsvinkel, bland andra aspekter som inte kan kontrolleras vid borrning för hand 25. Det finns en tro på att automatiserade borrsystem och annan stereotaxisk utrustning kan förbättra reproducerbarheten och resultatkonsistensen, men publicerade metodstudier har inte noggrant utvärderat temperatur eller BBB-permeabilitet som ett av resultaten. Därför finns det ett behov av mer reproducerbara och konsekvent tillämpade metoder för att producera kranialfönster, liksom metoder som tillämpas noggrant för att bedöma effekterna av kranial fönsterborrning på underliggande nervvävnad.
Fokus för denna studie är att bestämma och utveckla konsekventa och säkra borrmetoder för kranialfönster. Storleken på kraniotomin för kranialfönsterinstallation är betydligt större än vanliga kraniotomier för hjärnimplanterade mikroelektroder. Sådana kraniotomier kan inte kompletteras med ett enda borrhål vid användning av standardutrustning, vilket introducerar mer interkirurgisk teknikvariation när den utförs för hand20. Kirurgiska borrrobotar har introducerats på fältet, men har inte antagits allmänt 1,6,29. Automatisering av borrning ger kontroll över variabler som bidrar till observerad variation från försök till försök, vilket tyder på att användning av utrustningen kan minska inter- och intrakirurgeffekter. Detta är av särskilt intresse med tanke på den extra svårigheten med den större kraniotomi som behövs för kranialfönsterplacering. Även om man kan anta att det finns tydliga fördelar med styrningen som tillhandahålls genom att automatisera borrningen, har det gjorts lite bedömning av implementeringen av denna utrustning. Även om synliga lesioner inte har observerats5, är det högre känslighetstestet med EB önskvärt.
Här mäts BBB-permeabiliteten med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kirurgisk borrrobot med motsvarande programvara, som möjliggör programmering av stereotaktiska koordinater, kraniotomiplanering/kartläggning och ett urval av borrstilar ("punkt-för-punkt" vs "horisontell"), med hänvisning till borrkronans dirigerade väg. Ursprungligen borras åtta "frö" -punkter (figur 1A), som beskriver kranialfönstret. Härifrån skärs utrymmet mellan fröna ut med antingen "punkt-för-punkt" eller "horisontell" borrmetod. "Punkt-för-punkt" utför vertikala pilothålskärningar (liknar en CNC-borrpress), medan "horisontell" utför horisontella snitt längs kranialfönstrets omkrets som skisserar hålet (liknar en CNC-router). Resultatet för båda metoderna är en bit skalle som kan tas bort för att avslöja kranialfönstret. För att isolera skador från borrning avlägsnas inte kranialfönstret fysiskt för att undvika ytterligare skador. En kombination av EB-färgämne i kombination med fluorescerande avbildning används för att mäta BBB-permeabilitet efter att ha utfört kraniotomier hos möss, och ett infogat termoelement används för att direkt mäta temperaturen på hjärnytan under borrning (figur 1B, C). Tidigare observationer indikerade att pulsad borrning på/av med 2 s intervall var tillräckligt för att minska borruppvärmningen25, och ingår därför i den experimentella metoden för den kirurgiska roboten.
Syftet med det presenterade arbetet är att demonstrera metoder för att bedöma termiska skador från kraniotomiborrning. Medan metoderna presenteras i samband med automatiserad borrning kan sådana metoder också tillämpas på manuella borrscheman. Dessa metoder kan användas för att validera användningen av utrustning och/eller borrscheman innan de antas som standardförfarande.
Figur 1: Schematisk experimentell rörledning. Schematisk demonstration av processen djur genomgick för EB-kvantifiering efter kraniell fönsterprocedur. (A) Schematisk inställning av musen med stereotaxisk ram och kirurgisk robotborr. Ett exempel på kranialfönster visas över motorcortex med fröpunkter (grön) och kantpunkter (blå). (B) Perfusionsinställningen inkluderar injektion av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i hela djuret för att avlägsna blod, följt av extraktion av hjärnan. (C) Hjärnan placeras sedan i EB fluorescerande bildsystemkammare för att utföra fluorescerande avbildning på Evans Blue-färgämnet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer och djurvårdsmetoder granskades, godkändes av och utfördes i enlighet med Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Installation av kirurgisk robothårdvara
- Före operationen, följ manualen och guiden för kirurgisk robot (se materialförteckning) för att ställa in hårdvara och programvara. Utför ramkalibrering enligt beskrivningen i handboken. Om borren eller ramen flyttas rekommenderas att borren kalibreras om för att säkerställa noggrannhet.
2. Förberedelse av programvara
- Navigera till operationsprogrammet (se Materialförteckning) och skapa ett nytt projekt genom att välja Starta med ett rent projekt. Ställ in motivet som Mus högst upp för att ange de borrkoordinater som ska användas.
- Välj Starta nytt projekt.
- Härifrån klickar du på Planering i det nedre vänstra hörnet för att navigera till skärmen för planering av borrningskoordinater. Skapa borrschemat för kranialfönstertekniken som ska utföras.
- För att göra detta, klicka var som helst på den stereotaxiska atlasen. Använd Bregma som referens och ange följande koordinater för motorcortex: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Tryck på Enter på tangentbordet för att uppdatera de valda koordinaterna.
OBS: Dorsal-Ventral (DV) koordinaterna anger borrdjupet och behöver därför ingen inmatning här. - Klicka på Store Target för att spara koordinaterna och ange ett lämpligt namn. Härifrån klickar du på knappen Flytta längst ned till vänster för att navigera tillbaka till huvudborrskärmen.
- För att göra detta, klicka var som helst på den stereotaxiska atlasen. Använd Bregma som referens och ange följande koordinater för motorcortex: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Tryck på Enter på tangentbordet för att uppdatera de valda koordinaterna.
- Klicka på Verktyg > projekt > Spara som om du vill återanvända mallprojektet för senare projekt. Detta behåller automatiskt borrkoordinaterna för senare användning.
3. Förberedelse för operation
- Bedöva PrismPlus-möss30,31 (se Materialförteckning) i en isoflurankammare (3,5 % i 1,5 l/minO2). Applicera ögonsmörjmedel för att förhindra uttorkning av ögonen, raka huvudet med klippare och trimma naglarna för att förhindra att mössen skrapar suturer ut.
PrismPlus-möss är en typ av transgena fluorescerande arter som används vid multifotonavbildning. De heterozygota PrismPlus-mössen saknar fluorescerande gener och användes därför här för att minska animaliskt avfall från andra pågående studier, och eftersom det inte finns någon multifotonavbildning i denna studie. Möss av vildtyp förväntas visa liknande resultat. - Administrera subkutana injektioner av antibiotikum cefazolin (24 mg/kg), smärtstillande karprofen (5 mg/kg) och buprenorfin (0,05-0,10 mg/kg) till de bedövade mössen. Före något snitt, administrera en enda subkutan injektion av marcaine (0,25%, 100 μL) under snittstället (1 tum längs mittlinjen av skallen som börjar bakom ögonen).
OBS: Läkemedel som används här följer tidigare etablerade IACUC-protokoll. Det rekommenderas dock att överväga EMLA-kräm som ett lokalbedövningsmedel för en multimodal effekt före operation och svansveninjektion samt Meloxicam SR i stället för karprofen. EMLA och Meloxicam SR kan ges före isoflurananestesi. - Montera djuret på den kirurgiska robotens stereotaxiska ram, med hjälp av medföljande öronstänger, och behåll anestesi med 0,5% -2% isofluran via inandning genom en noskon.
- Se till att anestesidjupet övervakas noggrant av en utbildad veterinärtekniker eller personal, baserat på musens lyhördhet, andning (~ 55-65 andetag / min), hjärtfrekvens (300-450 slag per minut) och färg (rosa). Whisker och vanlig tåkupa kan också användas som ett mått för att bestämma anestesidjupet. Värdena för vitala bestäms av institutionella IACUC-föreskrifter.
- Håll djurens kroppstemperatur på en cirkulerande vattenkudde och övervaka vitala med hjälp av ett blod-syre- och hjärtfrekvensmätningssystem.
- Skrubba operationsområdet med klorhexidinglukonat (CHG) och 70% isopropanol för sterilisering. För att upprätthålla sterilitet under operationen, placera en steril plastfolie över musen och stereotaxisk ram.
OBS: Även om dessa protokoll utvecklades för överlevnadsoperationer, återspeglar de presenterade data användningen av icke-överlevnadsdjur, eftersom fokus var att testa och bestämma lämpliga borrprotokollmetoder.
4. Förberedelse av skalle
- Använd ett skalpellblad, utför ett 1 tums snitt på mitten av skallen, med början på baksidan av ögonen.
- Dra tillbaka huden för att exponera skallen och (valfritt) använd upprullningsdon för att underhålla det kirurgiska fönstret. Ta bort eventuell kvarvarande vävnad och membran med sterila bomullsapplikatorer.
- Torka ut och rengör skallen med 3% väteperoxid med bomullsspetsade applikatorer.
OBS: Detta kommer att göra skallens suturer synliga. Bregma och Lambda bör lätt ses. Om inte, applicera mer väteperoxid eller öka snittets storlek. - Tillåt "auto-stop" -funktionalitet genom att ansluta alligatorklämkabeln från den kirurgiska robotborrningsinställningen till musen, enligt tillverkarens rekommendationer. "Auto-stop" fungerar genom att detektera en förändring i impedans, så när borrkronan kommer i kontakt med cerebrospinalvätska (CSF) istället för ben, kommer borren att sluta borra, vilket förhindrar skador på hjärnan.
5. Evans blå svansveninjektion
VARNING: EB är ett möjligt cancerframkallande ämne. Använd handskar vid hantering.
- För att förbereda svansen för enkel injektion, torka av med en alkoholtork. Eventuellt kan vintergrön olja appliceras lokalt för att utvidga venen35.
- Ta tag i svansen i ena handen medan du hanterar sprutan som innehåller EB i den andra handen. Använd tummen och pekfingret och böj svansen för att exponera svansvenen ovanpå svansens böjning. För in sprutan (1 eller 2 ml, 30 G insulinspruta) parallellt med venen och injicera långsamt EB-volymen. EB (4% w/v) administreras i en koncentration av 2 ml/kg kroppsvikt via svansveninjektion.
OBS: Minimalt eller inget motstånd mot flöde från sprutan till svansen kan kännas om nålen sätts in korrekt. Om det finns motstånd eller EB-färgämne visas i svansen, flytta sedan ner på svansen och försök igen. - När du har injicerat den, vänta i 5 minuter så att EB kan cirkulera genom musen innan borrningen påbörjas. Framgångsrik injektion verifieras omedelbart när musens extremiteter och kirurgiska fönster blir blå.
6. Kirurgisk robotborrning
- När skallen är förberedd för borrning, navigera tillbaka till den kirurgiska programvaran. Öppna mallprojektet som definierades i steg 2.4 där koordinaterna för borrning angavs.
- Följ Verktyg > Project > nytt > Välj ett mallprojekt och välj det mallprojekt som utsågs i steg 2 (förberedelse av programvara).
- Välj Samma protokollelement > Planering (målpunkter) > Borrparametrar som ska överföras till det nya projektet.
- Klicka på Starta nytt projekt.
- Korrigera sedan borren och ramen för att ta hänsyn till lutningen och skalningen av musskallen hos det aktuella djuret. Klicka på Verktyg och välj Korrigera för lutning och skalning... för att öppna korrigeringsskärmen . Högst upp på skärmen, se till att borren är aktiv (inte sprutan) genom att klicka på den ljusröda borrknappen .
OBS: När den är aktiverad blir borrknappen mörk/ljusröd. Sprutknappen kan ignoreras, eftersom den inte används i detta protokoll.- Korrigera först skalan, tonhöjden och giren genom att ställa in var Bregma och Lambda finns på det aktuella djuret. Använd antingen tangentbordskontrollerna eller kontrollerna på skärmen för att flytta borrkronan. När borrkronan är placerad över Bregma, sänk den tills den bara rör vid skallen och klicka på Ställ in Bregma. Upprepa detta för Lambda.
- Justera sedan för den specifika rullen på skallen. Klicka på knappen Gå till mittpunkt för att justera borrkronan automatiskt till mitten av skallen. Klicka 2 mm åt vänster och sänk sedan långsamt borrkronan tills den vidrör skallen. Klicka på Ange vänsterpunkt.
- Upprepa steg 6.2.2 för höger sida av hjärnan. Nu är systemet inställt för denna specifika skalle.
OBS: Korrigering här är avgörande för att säkerställa korrekt borrningskoordinater och djup. Musen måste monteras så nära rak som möjligt för att minska behovet av korrigering så mycket som möjligt. Om stora korrigeringar behövs kan det leda till dålig borrningsnoggrannhet.
- När korrigeringen har utförts kommer du ut ur korrigeringsfönstret genom att klicka på Stänga längst ned i mitten av skärmen. Navigera till borrskärmen genom att klicka på Arbetsredskap och sedan välja Borra... för att påbörja borrningsproceduren.
- Se till att Kraniotomiform har valts i listrutan Borra högst upp på skärmen. Klicka sedan på Välj borrcenter &; form och välj det fördefinierade målet som namngavs i steg 2.3.1. Under den här skärmen väljer du Cirkel som form för målet och matar in 2,60 mm som cirkelns diameter2 . Klicka på Visa.
OBS: Kranialfönstrets diameter skapas med hjälp av borrkronans mitt som centrum för fröpunkterna. En liten borrkrona (diameter = 0,6 mm eller den rekommenderade borrkronestorleken som tillhandahålls av leverantören) används för att minimera den extra diametern som läggs till som ett resultat av att använda en större borrkrona. Speciella borrkronor används specifikt för den kirurgiska roboten. De åtta fröpunkterna och kantpunkterna kommer nu att visas på skallen som gröna respektive blå prickar. - Klicka på huvudfönstret och använd kortkommandot Control + Shift + D för att öppna menyn Drill Points till höger på skärmen. Detta gör det möjligt att visa specifika borrpunktsdjup och statusar.
- Innan borrningen börjar anpassar du funktionen för automatiskt stopp om det behövs genom att klicka på knappen bredvid kryssrutan Autostopp . Den här knappen är som standard Medium, vilket motsvarar känsligheten för autostoppfunktionen.
OBS: Detta kan testas i förväg för att hitta rätt känslighet för djuren. I detta protokoll användes den högsta känsligheten för att säkerställa minimal borrning genom hjärnan. - När autostoppfunktionen är aktiverad och anpassad börjar du borrningen av startpunkten. Klicka på Automatisk sökning så att detaljgranskningen automatiskt börjar vid Startkurs 1. När borrkronan vidrör CSF kommer autostoppfunktionen att upptäcka en förändring i impedansen, vilket leder till ett stopp i borrningen och tillbakadragning av borrkronan från skallen.
- Håll ett vakande öga på borrningen om autostoppet inte upptäcker några ändringar. Escape-tangenten kan tryckas in för att manuellt avbryta borrningen. Den rosa cirkeln längst ner i borrmenyn och till höger om impedansvärdena kan också klickas för att antingen starta eller stoppa borrningen.
OBS: Borrkronan borrar automatiskt till ett djup som är lika med den uppskattade skalltjockleken (eller tills autostoppfunktionen aktiveras). - Om autostopp inte aktiveras innan det uppskattade djupet har uppnåtts kommer en skärm att dyka upp som uppmanar användaren att: 1) Fortsätt borra och sjunka # mm längre, 2) Markera vid aktuellt djup och fortsätta, 3) Hoppa över den aktuella punkten och fortsätta, eller 4) Stoppa processen (kan fortsätta senare). Välj ett av alternativen enligt beskrivningen nedan.
- För Fortsätt borra och sjunka # mm längre anger du ett avstånd för borren att gå framåt. Som standard används 0,1 mm. Ett mindre avstånd kan föreslås för att förhindra oavsiktlig penetration av hjärnan.
- Om man tror att dura har nåtts på den här skärmen, välj alternativet Markera på aktuellt djup och fortsätt för systemet att markera dura på det djupet och gå vidare till nästa frö.
- Använd Hoppa över den aktuella punkten och fortsätt och Stoppa processen (kan fortsätta senare) för att felsöka eller rensa borrkronan och återgå när autostoppet fungerar igen.
- När alla fröpunkter har borrats, om någon inte var klar med autostoppfunktionen, kontrollera hålets djup manuellt med en dura-plockning. Detta kommer att säkerställa att det borrade djupet trängde igenom skallen.
- Innan du påbörjar kantpunktsborrning ska du bestämma vilken typ av "kantskärning" som önskas genom att välja listrutan bredvid texten Kantklipp på menyn Borra. De två alternativen är punkt för punkt och horisontellt.
- Välj Punkt för punkt om du vill borra varje kantpunkt individuellt och till ett djup som bestäms av de intilliggande startpunktsdjupen. Justera skalningen om det behövs via knappen Edge Scaling... nedan, även om standardvärdet Ingen skalning vanligtvis är tillräckligt.
- Välj Horisontellt för att börja borra vid kantpunkt 1 och använd en kontinuerlig borrningsrörelse för att gå runt hela borrcirkelns omkrets. Som standard kommer det horisontella snittet att klippa med 100 μm intervall, gå hela vägen runt fönstrets omkrets innan det går ytterligare 100 μm djupare. Om det behövs ändrar du intervalldjup och borrhastighet under knappen Klippalternativ... nedan.
- Använd den automatiskt skurna förskjutningen (under rutan Kantklipp ) för att justera för det automatiskt klippta djupet genom att ta en förutbestämd förskjutning från de intilliggande startpunkterna. I detta protokoll användes en autoskuren förskjutning på 20 μm. Ytterligare tester kan göras för att bestämma en optimal kompensation per djur.
- När kantskärningsinställningarna har fastställts påbörjar du borrning av kantpunkter genom att klicka på knappen Automatisk skärning i mitten av menyn Borra. För punkt-för-punkt-borrning är borrningsproceduren klar när den sista kanten har borrats. För horisontell borrning, fortsätt tills tillräckligt med skalle har borrats för att frigöra kranialfönstret.
OBS: Även om borrning utförs tills fönstret kan släppas, släpps fönstret inte fysiskt här för att förhindra skador på underliggande vävnad. Det är viktigt att isolera skadorna som ett resultat av bara borrning för att utvärdera olika borrscheman.- När den horisontella borrningen har nått djupet på en startpunkt högerklickar du på startpunkten (eller väljer flera punkter först) i menyn Borrpunkter och klickar på Lås djup. Detta gör det möjligt för horisontell skärning att fortsätta utan att skära djupare för det området (vilket undviker att tränga in i hjärnan).
OBS: Om det finns fröpunkter med olika duradjup kan detta orsaka skillnader i djupet som behövs för den horisontella borrningsproceduren.
- När den horisontella borrningen har nått djupet på en startpunkt högerklickar du på startpunkten (eller väljer flera punkter först) i menyn Borrpunkter och klickar på Lås djup. Detta gör det möjligt för horisontell skärning att fortsätta utan att skära djupare för det området (vilket undviker att tränga in i hjärnan).
- Om funktionen för automatiskt stopp inte fungerar korrekt, se till att borrkronan är helt ren från skräp eller potentiellt blod, saltlösning etc., eftersom de kan påverka borrkronans basimpedans. Välj dessutom ett av flera manuella borrningsalternativ som beskrivs nedan om autostoppet inte fungerar konsekvent.
- I menyn Borra navigerar du manuellt till varje startpunkt genom att högerklicka på startvärdet eller kanten och välja Gå till post. Det finns också alternativ för att rensa de markerade djupen, återställa hålet och andra alternativ som kan hjälpa till med borrningsproceduren.
- Kontrollera borrdjupets framsteg manuellt genom att välja ett djup i listrutan bredvid texten Avancera: nära överkanten av menyn Borra. Klicka på knappen Advance direkt nedan för att flytta fram det inställda avståndet.
OBS: Den här funktionen kan användas tillsammans med knapparna Set Dura och Set Surface under Advance-knappen för att manuellt berätta för systemet var både ytan på skallen och dura finns. Använd autostoppfunktionen där det är möjligt, men vid behov räcker även dessa manuella alternativ. - Om du borrar manuellt, var försiktig mellan varje borrdjupsintervall för att säkerställa att borren inte överskrider dura. Kontrollera det borrade hålet med hjälp av en duraplockning mellan djupintervallen för att bekräfta om dura nåddes. När all manuell såddborrning är klar, fortsätt kantskärningsproceduren normalt enligt beskrivningen ovan.
- Puls metod
- För att utföra manuell pulsborrning, stäng av autostoppfunktionen genom att avmarkera kryssrutan bredvid alternativet Autostopp i menyn Borra. Detta måste vara avstängt för att möjliggöra kontroll när borren är avstängd för pulsering.
OBS: Pulsborrning följer ett mönster av 2 s borrning följt av 2 s ingen borrning för att tillåta skallen att svalna. - I menyn Borra väljer du 100 μm som borrdjupets framsteg, detta motsvarar ~2 s nedåtgående borrning.
- När du är klar klickar du på Advance för att påbörja borrningen.
OBS: Var redo att snabbt stoppa borren när den har avancerat med 100 μm, eftersom borren fortsätter att rotera på djupet tills utrymning trycks in (vilket genererar onödig värme). - När borren har avancerat 100 μm trycker du på Escape två gånger för att stoppa borren. Efter 2 s, upprepa denna cykel för djupet av skallen.
OBS: Endast punkt-för-punkt-metoden kan utföras med pulsad metod på grund av programvara och mekaniska begränsningar. Kontinuerlig horisontell borrning kan inte utföras på detta sätt. - Borra alla start- och kantpunkter med den här metoden som beskrivs ovan. Var noga med att ställa in Dura med knappen i menyn Borra när dura har uppnåtts.
- För att utföra manuell pulsborrning, stäng av autostoppfunktionen genom att avmarkera kryssrutan bredvid alternativet Autostopp i menyn Borra. Detta måste vara avstängt för att möjliggöra kontroll när borren är avstängd för pulsering.
- Se till att Kraniotomiform har valts i listrutan Borra högst upp på skärmen. Klicka sedan på Välj borrcenter &; form och välj det fördefinierade målet som namngavs i steg 2.3.1. Under den här skärmen väljer du Cirkel som form för målet och matar in 2,60 mm som cirkelns diameter2 . Klicka på Visa.
7. Perfusion och hjärnutvinning
- När borrningen av frö- och kantpunkterna är klar, håll djuret under isofluranbedövning i ytterligare 1 timme så att EB-färgämnet kan cirkulera och extravasera genom den skadade BBB. Utför hjärtperfusion för att avlägsna blod eller vätskor från kärlen och ta sedan bort hjärnan för avbildning och analys enligt beskrivningen nedan.
- Efter cirkulationsperioden på 1 h EB efter skapandet av kranialfönstret, injicera en cocktail av ketamin (160 mg/kg) och xylazin (20 mg/kg) intraperitonealt i djuret. När du inte svarar, utför en hjärtperfusion.
- Skär upp musens buk med sax och exponera hjärtat genom att skära vertikalt genom bröstkorgen och horisontellt över membranet. Dra tillbaka bröstkorgen för att se hjärtat tydligt. Sätt in en fjärilsnål i hjärtats vänstra kammare och börja infusera 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i hela kroppen. Klipp en liten del av hjärtats högra förmak för att frigöra tryckuppbyggnad.
- Efter 25 ml 1x PBS har perfuserat i hela kroppen, stoppa perfusionen och halshugga musen som ett sekundärt medel för eutanasi.
OBS: Var noga med att utföra den institutionellt godkända metoden för avlivning och / eller slutpunktsperfusion för djuret att isolera hjärnan. - Härifrån extraherar du hjärnan från skallen genom att ta bort benet och vävnaden med rongeurs.
- Avbilda den extraherade hjärnan med ett fluorescerande bildsystem för att observera mängden EB som finns i hjärnan runt borrplatserna.
OBS: EB binder till cirkulerande albumin. Om vaskulär skada uppstår i hjärnan kommer EB att läcka ut och binda till hjärnvävnaden, vilket leder till en tydlig visuell indikator på skada.
8. Evans Blue bildbehandling och analys
- Initiering av maskinvara
- Slå på datorn som är ansluten till EB-systemet för fluorescensavbildning och starta bildåtergivningsprogrammet (se Materialförteckning) medan andra objekt förbereds. Slå på ljuskällan, plattformen och kameran i den ordningen.
- Navigera till bildhanteringsprogrammet och klicka på Initiera under kontrollpanelen för förvärv. Systemet och kammaren signalerar från rött till grönt så snart initieringen är klar.
OBS: Initiera EB-systemet för fluorescerande avbildning 30 minuter före varje avbildning så att ljuskällans temperatur når optimala nivåer.
- Avbildning av hjärnan
- Placera den explanterade hjärnan i en klar skål i mitten av scenen för avbildning.
- Under kontrollpanelen för förvärv justerar du inställningarna för bilden. Välj exponeringstid: 1 s; Binning: Medium; F / stopp: F1; Excitation: 535 till 675 nm; Utsläpp: Cy 5,5; Lampnivå: Hög; och FOV: 5 cm. Låt filtret vara låst och överlagringen av fotografering och fluorescens kontrollerad. Dessa inställningar är baserade på tidigare laboratorieerfarenhet och andra publicerade metoder för avbildning av EB36.
- Ladda EB-fluorescerande bildsystembilder i bildbehandlingsprogram med öppen åtkomst (se materialförteckning) och generera tre frihandsregioner av intresse (ROI) för att hitta EB: s fluorescerande intensitet genom att mäta den genomsnittliga strålningen över bakgrunden, hela hjärnan och kranialfönstret.
- Normalisera kranialfönstret och hela hjärnans mätningar mot motsvarande bakgrunds-ROI.
- Avbilda varje hjärna under olika excitationsfilter (535-675 nm) för att hitta våglängden med det högsta signal-brusförhållandet (605 nm valdes) mellan experimentgrupperna till saltlösningskontrollen.
- Isolera medelstrålningen under lämplig våglängd och medelvärde för att erhålla den genomsnittliga genomsnittliga strålningen eller fluorescerande intensiteten för hela hjärnan och kranialfönstrets ROI.
- Hitta och normalisera den genomsnittliga genomsnittliga strålningen över kranialfönsterområdet för varje grupp mot saltlösningskontrollen.
9. Utvärdering av termoelement
- Mät temperaturförändringarna i skallen och hjärnan med hjälp av ett termoelement (se materialförteckning) i kombination med de tre olika borrscheman. Termoelementet är anslutet till ett datainsamlingssystem (DAQ) som gör att mätningen kan läsas in i MATLAB.
- Montera en kadavermus på den stereotaxiska ramen och robotborren. Borra manuellt ett litet hål (samma storlek som fröpunkten) ~ 2 mm bort från där kranialfönstret kommer att göras i sidan av skallen25. Detta hål gör det möjligt att skjuta termoelementet på plats under där borrning av kranialfönstret sker (figur 2D).
OBS: Kadavermöss används eftersom borrning av öppen sida av skallen krävs för att skjuta termoelementet över kranialfönstrets borrområde. Denna kadavermus är ett annat djur än det som tidigare använts för Evans Blue-analys. - Börja borrningsprocessen för vart och ett av de tre scheman som tidigare (steg 6). När borren går genom skallen kommer det att finnas spikar i temperaturförändring, vilket indikerar uppvärmning som sker nära hjärnan.
- Registrera och plotta resultaten i MATLAB för att beräkna den maximala temperaturskillnaden. Detta bör göras separat för såddborrning och kantborrning för att utvärdera horisontell borrning kontra punkt-för-punkt-borrning tillsammans med den pulsade manuella borrmetoden.
10. Statistik
- Utföra statistisk analys för termoelement och EB-fluorescerande avbildning i R med hjälp av ett Kruskal-Wallis rangsummatest med Benjamini-Hochberg-korrigering följt av parvisa jämförelser med Wilcoxons rangsummatest25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termisk utvärdering
Potentialen för termiska skador utvärderades genom att mäta temperaturförändringen från baslinjen på grund av borrning med horisontella (figur 2A), punkt-för-punkt (figur 2B) och pulsade punkt-för-punkt (figur 2C). Figur 2D visar experimentuppställningen för att erhålla termiska data. En provstorlek på N = 4 kranialfönster användes för termisk utvärdering. Horisontellt och punkt för punkt använder samma såborrningsschema men varierar beroende på hur kantpunkterna skärs. Pulsad punkt för punkt använder en pulsad metod för både så- och kantborrningsdelar. För den horisontella metoden visade såborrning en maximal temperaturförändring på 16,66 °C ± 2,08 °C, medan kantborrning visade 9,08 °C ± 0,37 °C. För punkt-för-punkt-metoden visade såborrning en maximal temperaturförändring på 18,69 °C ± 1,75 °C, medan kantborrning visade 8,53 °C ± 0,36 °C. För den pulsade punkt-för-punkt-metoden visade såborrning en maximal temperaturförändring på 6,90 °C ± 1,35 °C, medan kantborrning visade 4,10 °C ± 0,51 °C. Både de horisontella och punkt-för-punkt-borrningsscheman visar icke-signifikanta skillnader för termiska förändringar. Byte till en pulsad punkt-för-punkt-metod resulterade dock i betydligt mindre uppvärmning (p < 0,05) av hjärnan än både horisontell och punkt-för-punkt-borrning (figur 2E, F). Varaktigheten av operationen registrerades också, eftersom det kan påverka djurens överlevnadsförmåga för levande operationer. För båda automatiserade metoderna tog såborrningen i genomsnitt 360 s. Horisontell kantborrning tog 300 sekunder, medan punkt-för-punkt-kantborrning tog 200 sekunder. Den pulsade metoden tog längst tid, med frö- och kantborrning som tog cirka 500 s vardera. Ändå är dessa skillnader inte tillräckligt stora för att motivera någon övervägande eftersom operationer vanligtvis kan pågå över 2-3 timmar.
Figur 2: Termisk utvärdering. Potentialen för termiska skador utvärderades baserat på maximala temperaturförändringar i hjärnan som ett resultat av borrmetoder. (A) horisontell borrning och (B) punkt-för-punkt-borrning genererade liknande mängder värme, medan (C) en pulsad 2 s på, 2 s off punkt-för-punkt-metod visade minimal uppvärmning. (E) Såborrning och (F) kantborrning resulterade i betydligt mindre termisk förändring i den pulsade punkt-för-punkt-metoden för borrning (p < 0,05, N = 4 per tillstånd). (D) Termoelementet placeras under skallen på muskadavern där borrningen görs. Data förvärvas via en DAQ och matas in i en dator för analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vaskulär skada
Figur 3 visar förhållandet mellan borrschema och vaskulär skada. Tabell 1 visar p-värdet för varje borrschema efter statistisk analys enligt steg 10. En provstorlek på N = 4 per grupp användes för EB-färgutvärdering. Närvaron av en högre mängd EB är en direkt indikator på skador på BBB, varav punkt-för-punkt, horisontella och pulserade borrmetoder är betydligt större än kontrollens (alla med p = 0,043; Tabell 1). Punkt-för-punkt-metoden visar ingen signifikant skillnad när det gäller EB-närvaro jämfört med horisontell borrning (p = 0,411). Båda dessa scheman använde auto-stop-funktionen för att förhindra borrning i hjärnan; Denna autostoppfunktion misslyckades dock ofta med att förhindra skador. Detta misslyckande med autostopp i den delade såddborrningsdelen kunde ha orsakat okänd överdriven skada, vilket komplicerade differentieringen mellan teknikerna. Därför utfördes en parvis jämförelse med en pulsad punkt-för-punkt-metod utan autostopp för att utvärdera de andra två metoderna utan att införliva autostopp. Det fanns ingen signifikant skillnad när pulsad punkt för punkt jämfördes med punkt för punkt (p = 0,486), medan den pulsade punkt-för-punkt-metoden hade signifikant mindre EB-närvaro än den horisontella metoden (p = 0,043). Icke-signifikans mellan pulsade punkt-för-punkt- och punkt-för-punkt-metoder kan tillskrivas den stora variationen i punkt-för-punkt-borrning (figur 4).
Figur 3 visar representativa bilder av både horisontell (figur 3C) och punkt-för-punkt (figur 3D) borrning med lämpliga autostoppfunktioner. Visuellt och genom EB-fluorescerande avbildning sågs borrning via punkt-för-punkt och horisontell skärning vara skadlig för vaskulaturen i hjärnan jämfört med kontrollgrupper (figur 3A, B). Den pulsade punkt-för-punkt-metoden (figur 3E) hade mindre lokal skada vid frö- och kantpunkten, men hade fortfarande synlig EB-närvaro i kranialfönstret.
Figur 3: Vaskulär skada. EB-fluorescensbilder av explanterade hjärnor (1) och motsvarande ROI (2) som används för att bestämma den genomsnittliga strålningen av det område som påverkas av kranialfönsterkraniotomi. (A) Musen injicerades med EB utan kranialfönsterkirurgi för att förvärva EB-närvaro i hjärnans vaskulatur vid baslinjen. (B) Musen injicerades endast med saltlösning och en kranial fönsterkraniotomi utfördes. Detta fastställde att den genomsnittliga strålningen som mättes krediterades EB-ackumuleringen på grund av läckande blodkärl och vaskulärt trauma nära platsen för kranialfönstret. (C) Musen injicerades med EB och kranialfönstret skapades med den horisontella metoden för automatisk borrning. (D) Musen injicerades med EB och kranialfönstret skapades med punkt-för-punkt-metoden för automatisk borrning. (E) Två representativa bilder av kranialfönster framställda med punkt-för-punkt-pulsmetoden för borrning efter mössen (n = 2) injicerades med EB. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Okulär besiktning av skador
Visuell inspektion av hjärnan visar fysisk skada på hjärnans yta (figur 4). Panelerna A-D demonstrerar EB-närvaron av den horisontella borrningen, panelerna E-H punkt-för-punkt-metoden och panelerna I-L är pulsade punkt-för-punkt-metoden. "Punkt-för-punkt" utför vertikala pilothålskärningar medan "horisontella" utför horisontella skärningar längs omkretsen av kranialfönstret som skisserar hålet. Den "pulserade punkt för punkt" använder samma metoder som punkt för punkt utan användning av funktionen för automatiskt stopp och beror på att användaren stoppar borrningen i inställda djupsteg. Även om en metod har hittats som minimerar mängden termisk skada på hjärnan, finns det fortfarande frågan om mekanisk skada från borren. Helst skulle en auto-stop-funktion som upptäcker CSF och stoppar borrning innan hjärnvävnad skadas fungera här, men verkade inte fungera konsekvent. Även med extrem försiktighet vid pulsad manuell borrning fanns det fortfarande synskador på hjärnan. Detta kan vara resultatet av två faktorer: 1) bristen på kontroll och känsla som kommer med handborrning och 2) separationsdjupet mellan skallen och hjärnan för ett litet djur som en mus. Handborrning kan erbjuda en mer kontrollerad metod för att komma igenom skallen utan att skada hjärnan med tillräckligt med övning och expertis. Det finns dock mycket högre skicklighet och utbildning som behövs jämfört med en plug-and-play-robot, vilket skulle göra det möjligt för flera "kirurger" att bidra till samma studie - inte en vanlig praxis inom det intrakortikala mikroelektrodfältet. Hos möss är avståndet mellan hjärnan och skallen extremt tunt, så även den minsta överborrningen på 10 μm kan leda till mekanisk skada på hjärnan.
Figur 4: Okulär besiktning av skador. Digitala bilder av alla hjärnor som förvärvats för visuell inspektion och representation för var och en av de tre borrmetoderna. (AD) Horisontell visade konsekvent skador runt kranialfönstret, antingen från mekanisk eller termisk skada. (E-H) Punkt för punkt visade stor variation i resultaten, vilket indikerar en mindre tillförlitlig metod för borrning. (I–L) Pulsad punkt för punkt var mer konsekvent och visade mindre visuell skada än de andra metoderna, vilket matchade skillnaderna i EB-fluorescerande analys och termoelementresultat. Skalstång = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Vågrät | Punkt | Pulserande | Kontroll | |
| Vågrät | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| Punkt | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| Pulserande | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
Tabell 1: Statistisk analys av EB fluorescerande bildresultat. Resultat från EB:s fluorescerande bildsystem för olika borrtekniker analyserades med hjälp av ett Kruskal-Wallis rangsummatest med Benjamin-Hochberg-korrigering följt av parvisa jämförelser med Wilcoxons rangsummatest (N = 4 per grupp). Signifikanta skillnader mellan grupper markeras med en asterisk *.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av EB-färgämne och avbildning är enkel, snabb och användbar för att utvärdera vaskulär skada i hjärnan för nya metoder och tekniker. Oavsett om man använder en kirurgisk robot eller bekräftar metoder som för närvarande görs i labbet är det viktigt att validera kirurgiska metoder för att isolera effekterna av experimentella behandlingar kontra kirurgisk påverkan och förbättra djurskyddet. En termoelementinställning är också användbar vid utvärdering av borrmetoder för att säkerställa att ingen uppvärmning sker. Temperaturökningar på grund av benborrning har varit kända för att orsaka vävnadsskador, och till och med en ökning på 5 ° C är tillräckligt för att orsaka stor vaskulär skada i hjärnan 32,33,34,35,36. Det rekommenderas att använda de metoder som beskrivs här för att förbättra laboratorie- och kirurgiska tekniker.
Även om termoelementutvärdering är användbar för utvärdering har den några begränsningar. Termoelementdata förvärvas med hjälp av kadavermöss på grund av behovet av att borra ett hål i sidan av skallen för att passa termoelementet i hjärnan och eventuella skador på hjärnan som ett resultat. Som ett resultat mäts temperaturskillnaden över borrning istället för djurets fysiologiska temperatur. Dessutom kan det finnas fysiologiska temperaturregleringsfunktioner som inte ingår i analysen.
Flera steg under protokollet är avgörande för att säkerställa korrekt borrning. För det första kommer skalleinriktning, om det görs felaktigt, att leda till dålig borrningsnoggrannhet tillsammans med skador på hjärnan (om autostopp inte fungerar). Se till att monteringen av djuret är så rak som möjligt före lutningskorrigering för att undvika detta problem. Korrigera eventuella lutningsförskjutningar genom att följa lutningskorrigeringsprocessen långsamt och säkert. I några fall under denna studie var lutningen avstängd, vilket ledde till att borrsystemet trodde att det borrade i skallen trots att borrkronan inte ens hade kontaktat skallen. Till stor del är detta ett problem för korrekt registrering av skalltjocklek, och om det är tillräckligt allvarligt kan det orsaka felaktigheter i borrkoordinaterna. Dessutom var autostoppfunktionen inkonsekvent och måste användas med försiktighet. Lita inte enbart på auto-stop-funktionen för att förhindra skador på hjärnan. Kontrollera alltid borrhålet för att säkerställa att överborrning inte sker.
Oavsett autostopp finns det några optimeringar som kan utföras för punkt-för-punkt och horisontella borrningsmetoder. För att säkerställa att hjärnan inte skadas på något sätt använder punkt för punkt en borrförskjutning under kantskärning, men användaren måste förutbestämma denna inställning i förväg genom testning. En linjär interpolationsmetod skulle kunna införlivas med den grundaste fröpunkten som bas, så att vid tjockare frön runt skallen kommer skador inte att uppstå i hjärnan. Om det behövs kan användaren alltid återgå till ett tjockare område av skallen och borra djupare. Det horisontella skärsteget använder ett djupskärningsintervall (standard på 100 μm) för varje rotation runt kantpunkterna. Detta kan också bestämmas baserat på skallens tjocklek för att undvika att borra för djupt och skada hjärnan.
Transgena möss är en kraftfull experimentell modell för intravital multifotonavbildning. Medan användningen av en kirurgisk robot för kranialfönster hos transgena möss framhävs i denna studie är det viktigt att notera användningen av en kirurgisk robot vid andra kranialoperationer. Möjligheten att kontrollera och standardisera borrning ger fördelar för kraniotomier i större djurstudier över hela fältet. Även om vissa mekaniska skador observerades visuellt, beror detta troligen på den extremt lilla separationen mellan hjärnan och skallen hos möss. Större djur, som råttor, har mer subaraknoidalutrymme och tjockare dura, vilket ger mindre risk för mekanisk skada på grund av robotborrning25. I kombination med den minskning av termiska skador som visas med den pulsade metoden här har operationsroboten potential att avsevärt minska skador som uppstår vid borrning i olika djurmodeller.
Sammantaget visade den pulserade punkt-för-punkt-metoden minst skada, oavsett om det var till följd av mindre uppvärmning eller mindre mekanisk skada på hjärnan. Manuell borrning kan erbjuda en mer kontrollerad metod för att undvika skador, men det är viktigt att lyfta fram fördelarna med en kirurgisk robot. En robot behöver mindre utbildning, kan bidra till att minska variationen mellan kirurger och när den har optimerats fullt ut kan den låna ut till en mer standardiserad procedur i laboratorier. Dessutom är inlärningskurvan för en kirurgisk robot mycket lägre än för handkirurgi. Detta minskar inte bara den tid som krävs för att lära sig tekniken, utan minskar också antalet djur som används för träningsändamål. Förekomsten av kranial fönsterborrning har ökat med innovationen av multifotonavbildning genom hjärnan, vilket ses i publicerade artiklar20,37. Att använda karaktäriserande metoder som termoelement och EB-färgavbildning hjälper till att optimera borrtekniken, medan användningen av robotar kommer att göra svåra operationer mer tillgängliga och utbredda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera. Innehållet representerar inte åsikterna från US Department of Veterans Affairs, National Institutes of Health eller USA: s regering.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) och GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona) och Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) från USA (USA) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Dessutom stöddes detta arbete delvis av National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) och National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No. GRANT12635723. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
