Summary
Kraniyal pencereler, transgenik farelerde intravital görüntülemeye izin vermek için her yerde uygulanan bir cerrahi teknik haline gelmiştir. Bu protokol, kafatası pencerelerinin yarı otomatik kemik delmesini gerçekleştiren ve cerrahtan cerraha değişkenliği azaltmaya ve termal kan-beyin bariyeri hasarını kısmen azaltmaya yardımcı olabilecek cerrahi bir robotun kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
Kraniyal pencere cerrahisi, multifoton veya diğer intravital görüntüleme teknikleri kullanılarak canlı farelerde beyin dokusunun görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, elle herhangi bir kraniyotomi yapılırken, genellikle beyin dokusunda termal hasar vardır, bu da doğal olarak ameliyattan ameliyata değişkendir ve bireysel cerrah tekniğine bağlı olabilir. Cerrahi bir robotun uygulanması, ameliyatı standartlaştırabilir ve ameliyatla ilişkili termal hasarda bir azalmaya yol açabilir. Bu çalışmada, termal hasarı değerlendirmek için üç robotik sondaj yöntemi test edilmiştir: yatay, noktadan noktaya ve darbeli noktadan noktaya. Yatay delme, sürekli bir delme şeması kullanırken, noktadan noktaya kafatası penceresini çevreleyen birkaç delik açar. Darbeli noktadan noktaya, sondaj arasında soğutmaya izin vermek için "2 s açık, 2 s kapalı" bir sondaj şeması ekler. İntravenöz olarak enjekte edilen Evans Blue (EB) boyasının floresan görüntülemesi, beyin dokusuna verilen hasarı ölçerken, sondaj sahasının altına yerleştirilen bir termokupl termal hasarı ölçer. Termokupl sonuçları, yatay (16.66 °C ±± 2.08 °C) ve noktadan noktaya (18.69 °C ± 1.75 °C) gruplara kıyasla darbeli noktadan noktaya (6.90 °C 1.35 °C) grupta sıcaklık değişiminde önemli bir düşüş olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, darbeli noktadan noktaya grup, yatay yönteme kıyasla kranial pencere delme işleminden sonra önemli ölçüde daha az EB varlığı gösterdi ve bu da beyindeki kan damarlarına daha az zarar verdiğini gösterdi. Bu nedenle, darbeli bir noktadan noktaya delme yöntemi, termal hasarı azaltmak için en uygun şema gibi görünmektedir. Robotik matkap, eğitimi, değişkenliği en aza indirmeye ve termal hasarı azaltmaya yardımcı olan kullanışlı bir araçtır. Araştırma laboratuvarlarında çoklu foton görüntülemenin kullanımının artmasıyla, sonuçların titizliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak önemlidir. Burada ele alınan yöntemler, alanı daha da ilerletmek için bu cerrahi robotların nasıl daha iyi kullanılacağı konusunda başkalarını bilgilendirmeye yardımcı olacaktır.
Introduction
Kraniyal pencereler, canlı hayvanlarda korteksin doğrudan görselleştirilmesine ve görüntülenmesine izin vermek için nörobilim, sinir mühendisliği ve biyoloji alanlarında her yerde kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Transgenik farelerin ve çoklu foton görüntülemenin güçlü kombinasyonu, in vivo beyindeki devre aktivitesi ve diğer biyolojik içgörüler hakkında son derece değerli bilgiler sağlamıştır 12,13,14,15,16,17,18. Kafatasına monte edilen minyatür mikroskoplar, uyanık, serbestçe hareket eden hayvanlarda kayıt yapılmasını sağlamak için bu yetenekleri daha da genişletmiştir19. Bir kranial pencere oluşturma işlemi, korteks20 üzerinde şeffaf bir cam parçasını sabitlemek için yeterince büyük kraniyotomiler üretmek için kranial kemiği inceltmek veya tamamen çıkarmak için güç delme gerektirir. Polidimetilsiloksan (PDMS) ve diğer polimerler de kraniyal pencere malzemeleri olarak test edilmiştir 9,21. Sonuçta, ideal kraniyal pencere, altındaki normal endojen aktiviteyi değiştirmeyen veya müdahale etmeyen penceredir. Bununla birlikte, kraniyal pencere sondajının altta yatan dokuyu ağırlaştırdığı, beyne zarar verdiği, çevrenin bozulmasına ve meninksleri çoklu foton görüntüleme derinliğini tıkadığı noktaya kadar etkilediği yaygın olarak kabul edilmektedir22. Ortaya çıkan nöroinflamasyon, kan-beyin bariyerinin (BBB) geçirgenliğinden, implant bölgesi etrafındaki glial hücrelerin aktivasyonuna ve işe alınmasına kadar geniş bir etki yelpazesine sahiptir23. Bu nedenle, daha güvenli ve daha tekrarlanabilir kraniyal pencere delme yöntemlerinin karakterize edilmesi, tutarlı görüntüleme kalitesi ve kafa karıştırıcı faktörlerin azaltılması için çok önemlidir.
Altta yatan dokuya travmayı en aza indirmek için özen gösterilirken, kemiği delme eylemi beyinde hem termal hem de mekanik bozulmalara neden olma potansiyeline sahiptir24,25. Dura içine kazara matkap penetrasyonundan kaynaklanan mekanik travma, değişen derecelerde kortikal yaralanmaya neden olabilir24. Shoffstall ve ark.25 tarafından yapılan bir çalışmada, kemik delme işleminden kaynaklanan ısı, beyin parankiminde Evans Blue (EB) boyasının varlığıyla belirtildiği gibi, BBB geçirgenliğinin artmasına neden olmuştur 25. İntravenöz olarak enjekte edilen EB boyası, kan dolaşımındaki dolaşımdaki albümine bağlanır ve bu nedenle normalde sağlıklı bir BBB'yi kayda değer konsantrasyonlarda geçmez. Sonuç olarak, EB boyası yaygın olarak BBB geçirgenliği26,27'nin hassas bir belirteci olarak kullanılır. Çalışmaları, BBB geçirgenliğinin incelenen sonraki biyolojik sekeller üzerindeki etkisini doğrudan ölçmemiş olsa da, önceki çalışmalar BBB geçirgenliğini, kronik olarak implante edilmiş mikroelektrotlara ve motor fonksiyondaki değişikliklere karşı artmış nöroinflamatuar yanıt ile ilişkilendirmiştir28.
Çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, termal ve mekanik hasarın büyüklüğü, çalışmanın titizliğini ve tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyen bir deneysel hata kaynağına katkıda bulunabilir. Her biri farklı sondaj ekipmanları, hızları, tekniklerive kullanıcıları 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 kullanan kranial pencereler üretmek için düzinelerce atıf yapılan yöntem vardır. Shoffstall ve ark.25, ısıtma sonuçlarında gözlemlenen varyasyonun, matkabın uygulanan kuvveti, ilerleme hızı ve uygulama açısındaki değişkenliğe ve elle delme sırasında kontrol edilemeyen diğer hususlara atfedildiğini bildirmiştir 25. Otomatik sondaj sistemlerinin ve diğer stereotaksik ekipmanların tekrarlanabilirliği ve sonuç tutarlılığını artırabileceğine dair bir inanç vardır, ancak yayınlanmış yöntem çalışmaları, sonuçlardan biri olarak sıcaklığı veya BBB geçirgenliğini titizlikle değerlendirmemiştir. Bu nedenle, kraniyal pencereleri üretmek için daha tekrarlanabilir ve tutarlı bir şekilde uygulanan yöntemlerin yanı sıra, kraniyal pencere sondajının altta yatan sinir dokusu üzerindeki etkisini değerlendirmek için titizlikle uygulanan yöntemlere ihtiyaç vardır.
Bu çalışmanın odak noktası, kranial pencereler için tutarlı ve güvenli delme yöntemlerini belirlemek ve geliştirmektir. Kraniyal pencere kurulumu için kraniyotominin boyutu, beyin implante mikroelektrotları için standart kraniyotomilerden önemli ölçüde daha büyüktür. Bu tür kraniyotomiler standart ekipman kullanıldığında tek bir çapak deliği ile tamamlanamaz, bu nedenle elle yapıldığında cerrahlar arası teknik değişkenliği daha fazla ortaya çıkar20. Cerrahi delme robotları sahaya tanıtıldı, ancak yaygın olarak benimsenmedi1,6,29. Sondajın otomasyonu, gözlemlenen denemeden denemeye varyasyona katkıda bulunan değişkenler üzerinde kontrol sağlar ve bu da ekipmanın kullanımının cerrahlar arası ve cerrahlar arası etkileri azaltabileceğini düşündürmektedir. Kraniyal pencere yerleşimi için gereken daha büyük kraniyotominin ek zorluğu göz önüne alındığında bu özellikle ilgi çekicidir. Sondajın otomatikleştirilmesinin sağladığı kontrolün net faydaları olduğu varsayılabilirken, bu ekipmanların uygulanmasına ilişkin çok az değerlendirme yapılmıştır. Görünür lezyonlar gözlenmemiş olmasına rağmen5, EB kullanılarak daha yüksek duyarlılık testi istenmektedir.
Burada, BBB geçirgenliği, stereotaksik koordinatların programlanmasına, kraniyotomi planlamasına / haritalamasına ve matkap ucunun yönlendirilmiş yoluna atıfta bulunan bir dizi delme stiline ("noktadan noktaya" ve "yatay") izin veren ilgili yazılıma sahip, ticari olarak temin edilebilen bir cerrahi delme robotu kullanılarak ölçülür. Başlangıçta, kafatası penceresini özetleyen sekiz "tohum" noktası delinir (Şekil 1A). Buradan, tohumlar arasındaki boşluk "noktadan noktaya" veya "yatay" matkap yöntemi kullanılarak kesilir. "Noktadan noktaya" dikey pilot delik kesimleri (CNC matkap presine benzer) gerçekleştirirken, "yatay", deliği özetleyen kafatası penceresinin çevresi boyunca yatay kesimler gerçekleştirir (bir CNC yönlendiriciye benzer). Her iki yöntemin de sonucu, kafatası penceresini ortaya çıkarmak için çıkarılabilen bir kafatası parçasıdır. Delme işleminden kaynaklanan hasarı izole etmek için, herhangi bir ek hasarı önlemek için kafatası penceresi fiziksel olarak çıkarılmaz. Farelerde kraniyotomiler yapıldıktan sonra BBB geçirgenliğini ölçmek için floresan görüntüleme ile birleştirilmiş EB boyasının bir kombinasyonu kullanılır ve sondaj sırasında beyin yüzeyinin sıcaklığını doğrudan ölçmek için yerleştirilmiş bir termokupl kullanılır (Şekil 1B, C). Önceki gözlemler, 2 s aralıklarla darbeli delme açma / kapamanın, matkap ısıtması25'i hafifletmek için yeterli olduğunu ve bu nedenle cerrahi robot için deneysel yaklaşıma dahil edildiğini göstermiştir.
Sunulan çalışmanın amacı, kraniyotomi sondajından kaynaklanan termal hasarı değerlendirme yöntemlerini göstermektir. Yöntemler otomatik delme bağlamında sunulurken, bu tür yöntemler manuel delme şemalarına da uygulanabilir. Bu yöntemler, standart bir prosedür olarak kabul edilmeden önce ekipman ve / veya sondaj planlarının kullanımını doğrulamak için kullanılabilir.
Şekil 1: Deneysel işlem hattı şeması. Hayvanların kraniyal pencere prosedürü sonrası EB ölçümü için maruz kaldıkları süreci gösteren şematik. (A) Stereotaksik çerçeve ve cerrahi robot matkap ile farenin şematik kurulumu. Motor korteks üzerinde tohum noktaları (yeşil) ve kenar noktaları (mavi) ile örnek bir kraniyal pencere gösterilmiştir. (B) Perfüzyon kurulumu, herhangi bir kanı çıkarmak için hayvan boyunca 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) enjekte edilmesini ve ardından beynin ekstraksiyonunu içerir. (C) Beyin daha sonra Evans Blue boyası üzerinde floresan görüntüleme yapmak için EB floresan görüntüleme sistemi odasına yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler ve hayvan bakımı uygulamaları, Louis Stokes Cleveland Gazi İşleri Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne uygun olarak gözden geçirilmiş, onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.
1. Cerrahi robot donanım kurulumu
- Ameliyattan önce, donanım ve yazılımı kurmak için cerrahi robot ( Malzeme Tablosuna bakınız) kılavuzunu ve kılavuzunu izleyin. Çerçeve kalibrasyonunu kılavuzda ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde gerçekleştirin. Matkap veya şasi hareket ettirilirse, doğruluğu sağlamak için matkabın yeniden kalibre edilmesi önerilir.
2. Yazılım hazırlama
- Cerrahi yazılıma gidin (bkz. Malzeme Tablosu) ve Temiz bir projeyle başla'yı seçerek yeni bir proje oluşturun. Kullanılacak sondaj koordinatlarını belirlemek için konuyu en üstte Fare olarak ayarlayın.
- Yeni Proje Başlat'ı seçin.
- Buradan, sondaj koordinatı planlama ekranına gitmek için sol alt köşedeki Planlama'ya tıklayın. Yapılacak kraniyal pencere tekniği için delme şemasını oluşturun.
- Bunu yapmak için, stereotaksik atlasta herhangi bir yere tıklayın. Bregma'yı referans olarak kullanın ve motor korteks için aşağıdaki koordinatları girin: AP = 1.50, ML = 1.25, DV = 0.00. Seçili koordinatları güncellemek için klavyede Enter tuşuna basın.
NOT: Dorsal-Ventral (DV) koordinatları sondaj derinliğini gösterir ve bu nedenle burada bir girdiye ihtiyaç duymaz. - Bu koordinatları kaydetmek ve uygun bir ad girmek için Hedefi Depola'yı tıklatın. Buradan, ana sondaj ekranına geri dönmek için sol alttaki Taşı düğmesine tıklayın.
- Bunu yapmak için, stereotaksik atlasta herhangi bir yere tıklayın. Bregma'yı referans olarak kullanın ve motor korteks için aşağıdaki koordinatları girin: AP = 1.50, ML = 1.25, DV = 0.00. Seçili koordinatları güncellemek için klavyede Enter tuşuna basın.
- Bu şablon projesini sonraki projelerde yeniden kullanmak için Project > Farklı Kaydet'> Araçlar'ı tıklatın. Bu, sondaj koordinatlarını daha sonra kullanmak üzere otomatik olarak koruyacaktır.
3. Ameliyata hazırlık
- PrismPlus fareleri30,31 (bakınız Malzeme Tablosu) bir izofluran odasında (1,5 L/dakO2'de %3,5) anestezi altına alın. Gözlerin kurumasını önlemek için göz kayganlaştırıcısı uygulayın, makas kullanarak kafayı tıraş edin ve farelerin dikişleri çizmesini önlemek için tırnakları kesin.
NOT: PrismPlus fareler, çoklu foton görüntülemede kullanılan bir tür transgenik floresan türüdür. Heterozigot PrismPlus fareleri floresan genlerden yoksundur ve bu nedenle devam eden diğer çalışmalardan kaynaklanan hayvan atıklarını azaltmak için burada kullanılmıştır ve bu çalışmada çoklu foton görüntüleme yoktur. Vahşi tip farelerin de benzer sonuçlar göstermesi bekleniyor. - Anestezi uygulanan farelere deri altı antibiyotik sefazolin (24 mg / kg), analjezik karprofen (5 mg / kg) ve buprenorfin (0.05-0.10 mg / kg) enjeksiyonları uygulayın. Herhangi bir insizyondan önce, insizyon bölgesinin altına tek bir deri altı markain enjeksiyonu (% 0.25, 100 μL) uygulayın (gözlerin arkasından başlayarak kafatasının orta çizgisi boyunca 1 inç).
NOT: Burada kullanılan ilaçlar önceden belirlenmiş IACUC protokollerini takip eder. Bununla birlikte, EMLA kreminin ameliyat öncesi multi-modal etki için topikal anestezik olarak ve kuyruk damarı enjeksiyonunun yanı sıra Carprofen yerine Meloxicam SR'nin düşünülmesi önerilir. EMLA ve Meloksikam SR, izofluran anestezisinden önce sağlanabilir. - Hayvanı, birlikte verilen kulak çubuklarını kullanarak cerrahi robot stereotaksik çerçeveye monte edin ve bir burun konisinden soluma yoluyla % 0.5 -% 2 izofluran ile anesteziyi sürdürün.
- Anestezik derinliğin, farenin tepkisine, solunuma (~ 55-65 nefes / dak), kalp atış hızına (300-450 bpm) ve renge (pembe) bağlı olarak eğitimli bir veteriner teknisyeni veya personeli tarafından yakından izlendiğinden emin olun. Bıyık ve normal ayak parmağı sıkışması da anestezinin derinliğini belirlemek için bir önlem olarak kullanılabilir. Yaşamsal değerlerin değerleri kurumsal IACUC düzenlemeleri ile belirlenmektedir.
- Dolaşımdaki bir su yastığında hayvan vücut ısısını koruyun ve bir kan-oksijen ve kalp atış hızı ölçüm sistemi kullanarak hayati değerleri izleyin.
- Sterilizasyon için cerrahi bölgeyi klorheksidin glukonat (CHG) ve% 70 izopropanol ile ovalayın. Ameliyat sırasında steriliteyi korumak için, farenin ve stereotaksik çerçevenin üzerine steril bir plastik sargı yerleştirin.
NOT: Bu protokoller hayatta kalma ameliyatları için geliştirilmiş olsa da, sunulan veriler hayatta kalmayan hayvanların kullanımını yansıtmaktadır, çünkü odak noktası uygun sondaj protokolü yöntemlerini test etmek ve belirlemektir.
4. Kafatası hazırlığı
- Bir neşter bıçağı kullanarak, kafatasının orta hattında, gözlerin arkasından başlayarak 1 inçlik bir kesi yapın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geri çekin ve (isteğe bağlı olarak) cerrahi pencereyi korumak için retraktörler kullanın. Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak artık doku ve zarı çıkarın.
- Kafatasını pamuk uçlu aplikatörlerle% 3 hidrojen peroksit kullanarak kurutun ve temizleyin.
NOT: Bu, kafatasının dikişlerini görünür hale getirecektir. Bregma ve Lambda kolayca görülebilmelidir. Değilse, daha fazla hidrojen peroksit uygulayın veya insizyonun boyutunu artırın. - Timsah klipsi kablosunu cerrahi robot delme kurulumundan fareye bağlayarak üreticinin önerilerine göre "otomatik durdurma" işlevine izin verin. "Otomatik durdurma", empedanstaki bir değişikliği tespit ederek çalışır, bu nedenle matkap ucu kemik yerine beyin omurilik sıvısına (BOS) temas ettiğinde, matkap delmeyi durdurur ve böylece beyne zarar gelmesini önler.
5. Evans Mavi kuyruk damarı enjeksiyonu
DİKKAT: EB olası bir kanserojendir. Kullanım sırasında eldiven kullanın.
- Kuyruğu kolay enjeksiyona hazırlamak için, alkollü bir mendille silin. İsteğe bağlı olarak, kış yeşili yağı damarı genişletmek için topikal olarak uygulanabilir35.
- Bir elinizde EB içeren şırıngayı tutarken diğer elinizde kuyruğu tutun. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak, kuyruk damarını kuyruğun kıvrımının üstüne çıkarmak için kuyruğu bükün. Şırıngayı (1 veya 2 mL, 30 G insülin şırıngası) damara paralel olarak yerleştirin ve EB hacmini yavaşça enjekte edin. EB (% 4 w / v), kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla 2 mL / kg vücut ağırlığı konsantrasyonunda uygulanır.
NOT: İğne doğru şekilde yerleştirilirse, şırıngadan kuyruğa akmaya karşı minimum direnç veya hiç direnç hissedilmez. Direnç varsa veya kuyrukta EB boyası görünüyorsa, kuyrukta aşağı doğru hareket edin ve tekrar deneyin. - Enjekte edildikten sonra, delme başlamadan önce EB'nin fare boyunca dolaşmasına izin vermek için 5 dakika bekleyin. Başarılı enjeksiyon, farenin ekstremiteleri ve cerrahi penceresi maviye döndüğünde hemen doğrulanır.
6. Cerrahi robot delme prosedürü
- Kafatası delme için hazırlandıktan sonra, cerrahi yazılıma geri dönün. Sondaj koordinatlarının belirlendiği adım 2.4'te tanımlanan şablon projesini açın.
- Araçları > Project > New > izleyin Bir Şablon Projesi Seçin ve adım 2'de (yazılım hazırlama) belirtilen şablon projesini seçin.
- Bu yeni projeye taşımak için Planlama (Hedef noktalar) > Detaylandırma Parametreleri > Aynı Protokol öğelerini seçin.
- Yeni proje başlat'ı tıklatın.
- Ardından, mevcut hayvanın fare kafatasının eğimini ve ölçeklenmesini hesaba katmak için matkabı ve çerçeveyi düzeltin. Araçlar'a tıklayın ve düzeltme ekranını açmak için Eğme ve Ölçeklendirme için Düzelt...' i seçin. Ekranın üst kısmında, açık kırmızı Matkap düğmesine tıklayarak matkabın aktif olduğundan (şırınganın değil) emin olun.
NOT: Drill (Matkap ) düğmesi etkinleştirildiğinde koyu/parlak kırmızıya döner. Şırınga düğmesi, bu protokolde kullanılmadığı için göz ardı edilebilir.- İlk olarak, Bregma ve Lambda'nın mevcut hayvanda bulunduğu yeri ayarlayarak Ölçek, Perde ve Yaw'ı düzeltin. Matkap ucunu hareket ettirmek için klavye kontrollerini veya ekran kontrollerini kullanın. Matkap ucu Bregma'nın üzerine yerleştirildikten sonra, kafatasına dokunana kadar indirin ve Bregma'yı Ayarla'ya tıklayın. Bunu Lambda için tekrarlayın.
- Ardından, kafatasının belirli Rulosu için ayarlayın. Matkap ucunu kafatasının merkezine otomatik olarak ayarlamak için Orta Noktaya Git düğmesine tıklayın. Sola doğru 2 mm'ye tıklayın ve kafatasına dokunana kadar matkap ucunu yavaşça indirin. Sol Noktayı Ayarla'yı tıklayın.
- Beynin sağ tarafı için adım 6.2.2'yi tekrarlayın. Şimdi sistem bu özel kafatası için kuruldu.
NOT: Uygun sondaj koordinatlarını ve derinliğini sağlamak için buradaki düzeltme çok önemlidir. Düzeltme ihtiyacını mümkün olduğunca azaltmak için farenin mümkün olduğunca düze yakın monte edilmesi gerekir. Büyük düzeltmelere ihtiyaç duyulursa, delme işleminin doğruluğunun düşük olmasına neden olabilir.
- Düzeltme yapıldıktan sonra, düzeltme penceresinden Kapatmak ekranın orta alt kısmında. Sondaj ekranına tıklayarak gidin Araçları ve ardından Alıştırma... delme prosedürüne başlamak için.
- Kraniotomi-Şekli'nin ekranın üst kısmındaki Detaya Git açılır menüsünden seçildiğinden emin olun. Ardından, Matkap merkezi ve şekli seç'e tıklayın ve adım 2.3.1'de adlandırılan önceden tanımlanmış hedefi seçin. Bu ekranın altında, hedefin şekli olarak Daire'yi seçin ve dairenin çapı 2 olarak 2,60 mm girin. Göster'i tıklayın.
NOT: Kraniyal pencerenin çapı, matkap ucunun merkezi tohum noktalarının merkezi olarak kullanılarak oluşturulur. Daha büyük bir matkap ucu kullanılarak eklenen ekstra çapı en aza indirmek için küçük bir matkap ucu (çap = 0,6 mm veya satıcı tarafından sağlanan önerilen uç boyutu) kullanılır. Cerrahi robot için özel matkap uçları özel olarak kullanılır. Sekiz tohum noktası ve kenar noktası şimdi kafatasında sırasıyla yeşil ve mavi noktalar olarak görünecek. - Ana pencereye tıklayın ve ekranın sağ tarafındaki Matkap Noktaları menüsünü açmak için Control + Shift + D klavye kısayolunu kullanın. Bu, belirli sondaj noktası derinliklerini ve durumlarını görüntülemeye olanak tanır.
- Detaylandırma başlamadan önce, gerekirse Otomatik Durdur onay kutusunun yanındaki düğmeyi tıklatarak otomatik durdurma özelliğini özelleştirin. Bu düğme varsayılan olarak Otomatik durdurma özelliğinin hassasiyetine karşılık gelen Orta olarak ayarlanır.
NOT: Bu, hayvanlar için doğru hassasiyeti bulmak için önceden test edilebilir. Bu protokolde, beyinde minimum delme sağlamak için en yüksek hassasiyet kullanıldı. - Otomatik durdurma özelliği etkinleştirildikten ve özelleştirildikten sonra, tohum noktasının delinmesine başlayın. Tatbikatın otomatik olarak Tohum 1'de başlaması için Otomatik Tarama'yı tıklatın. Matkap ucu CSF'ye dokunduğunda, otomatik durdurma özelliği empedanstaki bir değişikliği algılar ve ucun kafatasından delinmesinde ve geri çekilmesinde bir durmaya neden olur.
- Otomatik durdurmanın herhangi bir değişikliği algılayamaması ihtimaline karşı sondajı yakından takip edin. Sondaj işlemini manuel olarak iptal etmek için Escape tuşuna basılabilir. Matkap menüsünün altında ve empedans değerlerinin sağında bulunan pembe daire, delme işlemini başlatmak veya durdurmak için de tıklanabilir.
NOT: Matkap ucu, tahmini kafatası kalınlığına eşit bir derinliğe (veya otomatik durdurma özelliği etkinleştirilene kadar) otomatik olarak delinir. - Tahmini derinliğe ulaşılmadan önce otomatik durdurma etkinleştirilmezse, kullanıcıdan şunları isteyen bir ekran açılır: 1) Delmeye ve # mm daha aşağıya inmeye devam edin, 2) Mevcut derinlikte işaretleyin ve devam edin, 3) Mevcut noktayı atlayın ve devam edin veya 4) İşlemi durdurun (daha sonra devam edebilir). Aşağıda açıklanan seçeneklerden birini belirleyin.
- Delmeye devam et ve # mm daha alçaltma için, matkabın ilerlemesi için bir mesafe girin. Varsayılan olarak, 0,1 mm kullanılır. Beynin kazara nüfuz etmesini önlemek için daha küçük bir mesafe önerilebilir.
- Bu ekranda duraya ulaşıldığına inanılıyorsa, sistemin durayı bu derinlikte işaretlemesi ve bir sonraki tohuma geçmesi için Mevcut derinlikte işaretle ve devam et seçeneğini seçin.
- Sondaj ucunda sorun gidermek veya sondaj ucunu temizlemek ve otomatik durdurma yeniden çalışmaya başladığında geri dönmek için Geçerli noktayı atla ve devam et ve İşlemi durdur (daha sonra devam edilebilir) seçeneklerini kullanın.
- Tüm tohum noktaları delindikten sonra, otomatik durdurma özelliği kullanılarak herhangi biri tamamlanmadıysa, bir dura toplama kullanarak deliğin derinliğini manuel olarak kontrol edin. Bu, delinmiş derinliğin kafatasına nüfuz etmesini sağlayacaktır.
- Kenar noktası delmeye başlamadan önce, Matkap menüsündeki Kenar Kesimi metninin yanındaki açılır menüyü seçerek ne tür bir "kenar kesme" isteneceğine karar verin. İki seçenek Noktadan Noktaya ve Yatay'dır.
- Her kenar noktasını ayrı ayrı ve bitişik tohum noktası derinlikleri tarafından belirlenen bir derinliğe kadar delmek için Noktadan Noktaya seçeneğini belirleyin. Gerekirse aşağıdaki Edge Scaling... düğmesini kullanarak ölçeklendirmeyi ayarlayın, ancak varsayılan olarak Ölçeklendirme Yok genellikle yeterlidir.
- Kenar Noktası 1'de delmeye başlamak için Yatay seçeneğini belirleyin ve sondaj çemberinin tüm çevresinde dolaşmak için sürekli bir delme hareketi kullanın. Varsayılan olarak, yatay kesim 100 μm aralıklarla kesilecek ve 100 μm daha derine ilerlemeden önce pencerenin çevresine kadar ilerleyecektir. Gerekirse, aşağıdaki Kesme seçenekleri... düğmesinin altındaki aralık derinliğini ve delme hızını değiştirin.
- Bitişik tohum noktalarından önceden belirlenmiş bir ofset alarak otomatik kesme derinliğini ayarlamak için otomatik kesme ofsetini ( Kenar Kesme kutusunun altında) kullanın. Bu protokolde, 20 μm'lik bir otomatik kesme ofseti kullanıldı. Hayvan bazında optimal bir ofset belirlemek için daha fazla test yapılabilir.
- Kenar kesme ayarları belirlendikten sonra, Matkap menüsünün ortasındaki Otomatik Kesim düğmesini tıklatarak kenar noktası delme işlemini başlatın. Noktadan noktaya delme için, son kenar delindikten sonra delme prosedürü tamamlanır. Yatay delme için, kafatası penceresini serbest bırakmak için yeterli kafatası delinene kadar devam edin.
NOT: Pencere serbest bırakılana kadar delme işlemi yapılmasına rağmen, altta yatan dokunun zarar görmesini önlemek için pencere burada fiziksel olarak serbest bırakılmaz. Farklı sondaj şemalarını değerlendirmek için sadece sondaj sonucunda oluşan hasarı izole etmek önemlidir.- Yatay delme bir tohum noktasının derinliğine ulaştığında, Delme Noktaları menüsünde o tohuma sağ tıklayın (veya önce birden fazla nokta seçin) ve Derinliği Kilitle'ye tıklayın. Bu, yatay kesimin o alan için daha derin kesmeden devam etmesini sağlayacaktır (böylece beyne nüfuz etmekten kaçınacaktır).
NOT: Farklı dura derinliklerine sahip tohum noktaları varsa, bu yatay delme prosedürü için gereken derinlikte farklılıklara neden olabilir.
- Yatay delme bir tohum noktasının derinliğine ulaştığında, Delme Noktaları menüsünde o tohuma sağ tıklayın (veya önce birden fazla nokta seçin) ve Derinliği Kilitle'ye tıklayın. Bu, yatay kesimin o alan için daha derin kesmeden devam etmesini sağlayacaktır (böylece beyne nüfuz etmekten kaçınacaktır).
- Otomatik durdurma özelliği düzgün çalışmıyorsa, matkap ucunun herhangi bir döküntüden veya potansiyel kan, tuzlu sudan vb. tamamen temiz olduğundan emin olun, çünkü bunlar ucun taban empedansını etkileyebilir. Ek olarak, otomatik durdurmanın tutarlı bir şekilde çalışmaması durumunda aşağıda açıklanan birkaç manuel delme seçeneğinden birini seçin.
- Drill menüsünde, tohuma veya kenara sağ tıklayıp Girişe Git'i seçerek her bir tohuma manuel olarak gidin. İşaretlenen derinlikleri temizlemek, deliği sıfırlamak ve delme prosedürüne yardımcı olabilecek diğer seçenekler de vardır.
- Detaylandırma menüsünün üst kısmındaki Gelişmiş: metninin yanında bulunan açılır menüden bir derinlik seçerek matkap derinliği ilerlemesini manuel olarak kontrol edin. Tatbikatı ayarlanan mesafeye ilerletmek için doğrudan aşağıdaki İleri düğmesine tıklayın.
NOT: Bu özellik, sisteme hem kafatasının hem de dura'nın yüzeyinin nerede olduğunu manuel olarak söylemek için İleri düğmesinin altındaki Dura Ayarla ve Yüzeyi Ayarla düğmeleriyle birlikte kullanılabilir. Mümkün olduğunca otomatik durdurma fonksiyonunu kullanın, ancak gerekirse bu manuel seçenekler de yeterlidir. - Manuel delme işlemi yapıyorsanız, matkabın durayı aşmadığından emin olmak için her delme derinliği aralığı arasında daha dikkatli olun. Dura'ya ulaşılıp ulaşılmadığını doğrulamak için derinlik aralıkları arasında bir dura çekme kullanarak delinen deliği kontrol edin. Tüm manuel tohum delme işlemi tamamlandıktan sonra, yukarıda belirtildiği gibi kenar kesme prosedürüne normal şekilde devam edin.
- Darbe yöntemi
- Manuel darbeli delme işlemi gerçekleştirmek için, Matkap menüsündeki Otomatik Durdurma seçeneğinin yanındaki onay kutusunun işaretini kaldırarak otomatik durdurma özelliğini kapatın. Matkabın darbe için ne zaman kapalı olduğunu kontrol etmeye izin vermek için bu kapalı olmalıdır.
NOT: Darbeli sondaj, kafatasının soğumasını sağlamak için 2 s sondaj ve ardından 2 s sondaj yapılmadan oluşan bir model izler. - Matkap menüsünde, matkap derinliği ilerlemesi olarak 100 μm'yi seçin, bu ~2 s aşağı doğru delme işlemine eşit olacaktır.
- Hazır olduğunuzda, sondaja başlamak için İlerle'ye tıklayın.
NOT: Matkap 100 μm ilerledikten sonra matkabı hızlı bir şekilde durdurmaya hazır olun, çünkü matkap kaçışa basılana kadar derinlikte dönmeye devam eder (gereksiz ısı üretir). - Matkap 100 μm ilerledikten sonra, matkabı durdurmak için Escape tuşuna iki kez basın. 2 saniye sonra, kafatasının derinliği için bu döngüyü tekrarlayın.
NOT: Yazılım ve mekanik kısıtlamalar nedeniyle darbeli yöntem kullanılarak yalnızca noktadan noktaya yöntem gerçekleştirilebilir. Sürekli yatay delme bu şekilde gerçekleştirilemez. - Yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan bu yöntemi kullanarak tüm tohum ve kenar noktalarını delin. Dura'ya ulaşıldıktan sonra Matkap menüsündeki düğmeyi kullanarak Dura'yı Ayarladığınızdan emin olun.
- Manuel darbeli delme işlemi gerçekleştirmek için, Matkap menüsündeki Otomatik Durdurma seçeneğinin yanındaki onay kutusunun işaretini kaldırarak otomatik durdurma özelliğini kapatın. Matkabın darbe için ne zaman kapalı olduğunu kontrol etmeye izin vermek için bu kapalı olmalıdır.
- Kraniotomi-Şekli'nin ekranın üst kısmındaki Detaya Git açılır menüsünden seçildiğinden emin olun. Ardından, Matkap merkezi ve şekli seç'e tıklayın ve adım 2.3.1'de adlandırılan önceden tanımlanmış hedefi seçin. Bu ekranın altında, hedefin şekli olarak Daire'yi seçin ve dairenin çapı 2 olarak 2,60 mm girin. Göster'i tıklayın.
7. Perfüzyon ve beyin ekstraksiyonu
- Tohumun ve kenar noktalarının delinmesi bittiğinde, EB boyasının hasarlı BBB boyunca dolaşmasına ve ekstravaze olmasına izin vermek için hayvanı 1 saat daha izofluran anestezisi altında tutun. Damarlardan herhangi bir kan veya sıvıyı çıkarmak için kardiyak perfüzyon yapın ve daha sonra aşağıda açıklandığı gibi görüntüleme ve analiz için beyni çıkarın.
- Kraniyal pencerenin oluşturulmasını takip eden 1 saatlik EB dolaşım periyodundan sonra, hayvana intraperitoneal olarak ketamin (160 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) kokteyli enjekte edin. Yanıt vermediğinde, kardiyak perfüzyon uygulayın.
- Makas kullanarak farenin karnını kesin ve göğüs kafesinden dikey olarak ve diyafram boyunca yatay olarak keserek kalbi açığa çıkarın. Kalbi net bir şekilde görmek için göğüs kafesini geri çekin. Kalbin sol ventrikülüne bir kelebek iğnesi yerleştirin ve vücuda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) aşılamaya başlayın. Basınç birikimini serbest bırakmak için kalbin sağ atriyumunun küçük bir bölümünü kesin.
- 25 mL 1x PBS vücuda nüfuz ettikten sonra, perfüzyonu durdurun ve fareyi ikincil bir ötenazi aracı olarak kesin.
NOT: Hayvanın beyni izole etmesi için kurumsal olarak onaylanmış ötenazi ve / veya son nokta perfüzyon yöntemini uyguladığınızdan emin olun. - Buradan, rongeurlarla kemik ve dokuyu çıkararak beyni kafatasından çıkarın.
- Sondaj bölgelerinin etrafındaki beyinde bulunan EB miktarını gözlemlemek için çıkarılan beyni bir floresan görüntüleme sistemi ile görüntüleyin.
NOT: EB dolaşımdaki albümine bağlanır. Beyinde vasküler hasar meydana gelirse, EB dışarı sızacak ve beyin dokusuna bağlanacak ve hasarın net bir görsel göstergesine yol açacaktır.
8. Evans Blue görüntüleme ve analiz
- Donanım başlatma
- EB floresan görüntüleme sistemine bağlı bilgisayarı açın ve diğer öğeler hazırlanırken görüntüleme yazılımını başlatın (bkz. Işık kaynağını, platformu ve kamerayı bu sırayla açın.
- Görüntüleme yazılımına gidin ve Edinme Denetim Masası'nın altındaki Başlat'ı tıklatın. Sistem ve oda, başlatma tamamlanır tamamlanmaz kırmızıdan yeşile sinyal verecektir.
NOT: Işık kaynağının sıcaklığının optimum seviyelere ulaşmasını sağlamak için EB floresan görüntüleme sistemini herhangi bir görüntülemeden 30 dakika önce başlatın.
- Beynin görüntülenmesi
- Ekilen beyni görüntüleme için sahnenin ortasındaki berrak bir kaba yerleştirin.
- Edinme Denetim Masası'nın altında, görüntünün ayarlarını yapın. Pozlama süresini seçin: 1 sn; Ciltleme: Orta; F/Stop: F1; Uyarma: 535 ila 675 nm; Emisyon: Cy 5.5; Lamba seviyesi: Yüksek; ve FOV: 5 cm. Filtreyi kilitli, fotoğraf ve floresan bindirmesini işaretli bırakın. Bu ayarlar, önceki laboratuvar deneyimlerine ve EB36'yı görüntülemenin diğer yayınlanmış yöntemlerine dayanmaktadır.
- EB floresan görüntüleme sistemi görüntülerini açık erişimli görüntü işleme yazılımına yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve arka plan, tüm beyin ve kraniyal pencere üzerindeki ortalama parlaklığı ölçerek EB'nin floresan yoğunluğunu bulmak için üç serbest ilgi alanı (ROI) oluşturun.
- Kraniyal pencereyi ve tüm beyin ölçümlerini karşılık gelen arka plan yatırım getirisine göre normalleştirin.
- Deney grupları arasında salin kontrolüne en yüksek sinyal-gürültü oranına (605 nm seçildi) sahip dalga boyunu bulmak için her beyni farklı uyarma filtreleri (535-675 nm) altında görüntüleyin.
- Tüm beyin ve kraniyal pencere ROI'leri için ortalama ortalama parlaklık veya floresan yoğunluğunu elde etmek için ortalama parlaklığı uygun dalga boyu ve ortalama altında izole edin.
- Tuzlu su kontrolüne karşı her grup için kraniyal pencere alanı üzerindeki ortalama parlaklığı bulun ve normalleştirin.
9. Termokupl değerlendirmesi
- Kafatası ve beynin sıcaklığındaki değişiklikleri, üç farklı delme şemasıyla birlikte bir termokupl kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) ölçün. Termokupl, ölçümün MATLAB'a okunmasını sağlayan bir veri toplama sistemine (DAQ) bağlanır.
- Stereotaksik çerçeveye ve robotik matkap kurulumuna bir kadavra faresi monte edin. Kafatası penceresinin kafatasının25 tarafına yapılacağı yerden ~ 2 mm uzakta küçük bir delik (tohum noktasıyla aynı boyutta) manuel olarak açın. Bu delik, termokuplın kafatası penceresinin delinmesinin gerçekleştiği yerin altındaki konuma kaydırılmasına izin verecektir (Şekil 2D).
NOT: Kadavra fareleri kullanılır, çünkü termokuplın kafatası penceresi delme bölgesi üzerinde kaydırılması için kafatasının yan tarafını delmek gerekir. Bu kadavra faresi, daha önce Evans Blue analizi için kullanılandan farklı bir hayvandır. - Daha önce yapıldığı gibi üç şemanın her biri için delme işlemine başlayın (adım 6). Matkap kafatasından geçerken, sıcaklık değişiminde ani artışlar olacaktır, bu da beynin yakınında meydana gelen ısınmayı gösterir.
- Maksimum sıcaklık farkını hesaplamak için sonuçları MATLAB'a kaydedin ve çizin. Bu, darbeli manuel delme yöntemiyle birlikte yatay ve noktadan noktaya delmeyi değerlendirmek için tohum delme ve kenar delme için ayrı ayrı yapılmalıdır.
10. İstatistikler
- Benjamini-Hochberg düzeltmesi ile Kruskal-Wallis rütbe toplamı testi kullanarak R'de termokupl ve EB floresan görüntüleme için istatistiksel analiz yapın ve ardından Wilcoxon rütbe toplamı kesin testi25'i kullanarak ikili karşılaştırmalar yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termal değerlendirme
Termal hasar potansiyeli, yatay (Şekil 2A), noktadan noktaya (Şekil 2B) ve darbeli noktadan noktaya (Şekil 2C) yöntemler kullanılarak sondaj nedeniyle taban çizgisinden sıcaklıktaki değişim ölçülerek değerlendirildi. Şekil 2D, termal veri elde etmek için deney düzeneğini görüntüler. Termal değerlendirme için örneklem büyüklüğünde N = 4 kraniyal pencere kullanılmıştır. Yatay ve noktadan noktaya aynı tohum delme şemasını kullanır, ancak kenar noktalarının nasıl kesildiğine göre değişir. Darbeli noktadan noktaya, hem tohum hem de kenar delme kısımları için darbeli bir yöntem kullanır. Yatay yöntem için, tohum delme maksimum sıcaklık değişimi 16.66 ° C ± 2.08 ° C gösterirken, kenar delme 9.08 ° C ± 0.37 ° C gösterdi. Noktadan noktaya yöntem için, tohum sondajı maksimum 18.69 ° C ± 1.75 ° C sıcaklık değişimi gösterirken, kenar delme 8.53 ° C ± 0.36 ° C gösterdi. Darbeli noktadan noktaya yöntemi için, tohum delme maksimum sıcaklık değişimi 6.90 ° C ± 1.35 ° C gösterirken, kenar delme 4.10 ° C ± 0.51 ° C gösterdi. Hem yatay hem de noktadan noktaya sondaj şemaları, termal değişiklikler için önemli olmayan farklılıklar gösterir. Bununla birlikte, darbeli bir noktadan noktaya yönteme geçmek, beynin hem yatay hem de noktadan noktaya sondajdan önemli ölçüde daha az ısınmasına (p < 0.05) neden olmuştur (Şekil 2E, F). Ameliyat süresi de kaydedildi, çünkü bunun canlı ameliyatlar için hayvanların hayatta kalma kabiliyeti üzerinde bir etkisi olabilir. Her iki otomatik yöntem için de tohum delme işlemi ortalama 360 sn sürdü. Yatay kenar delme 300 sn sürerken, noktadan noktaya kenar delme 200 sn sürdü. Darbeli yöntem en uzun sürdü, tohum ve kenar delme her biri yaklaşık 500 s sürdü. Bununla birlikte, bu farklılıklar, ameliyatlar genellikle 2-3 saatten fazla sürebileceğinden, herhangi bir değerlendirmeyi gerektirecek kadar büyük değildir.
Şekil 2: Termal değerlendirme. Termal hasar potansiyeli, sondaj yöntemlerinin bir sonucu olarak beyindeki maksimum sıcaklık değişimlerine dayanarak değerlendirildi. (A) Yatay sondaj ve (B) noktadan noktaya sondaj benzer miktarlarda ısı üretirken, (C) darbeli 2 s açık, 2 s kapalı noktadan noktaya yöntem minimum ısıtma gösterdi. (E) Tohum delme ve (F) kenar delme, darbeli noktadan noktaya delme yönteminde önemli ölçüde daha az termal değişime neden olmuştur (p < 0,05, koşul başına N = 4). (D) Termokupl, delmenin yapıldığı fare kadavrasının kafatasının altına yerleştirilir. Veriler bir DAQ aracılığıyla elde edilir ve analiz için bir bilgisayara beslenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Vasküler hasar
Şekil 3 , sondaj şeması ile vasküler hasar arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Tablo 1 , adım 10'da belirtildiği gibi istatistiksel analizi takiben her sondaj şeması için p değerini göstermektedir. EB boya değerlendirmesi için grup başına N = 4 örneklem büyüklüğü kullanıldı. Daha yüksek miktarda EB'nin varlığı, noktadan noktaya, yatay ve darbeli sondaj yöntemlerinin kontrolünkinden önemli ölçüde daha büyük olduğu BBB'ye verilen hasarın doğrudan bir göstergesidir (hepsi p = 0.043; Tablo 1). Noktadan noktaya yöntemi, yatay sondaja kıyasla EB varlığı açısından anlamlı bir fark göstermemektedir (p = 0.411). Her iki şema da beyne delinmeyi önlemek için otomatik durdurma işlevini kullandı; ancak, bu otomatik durdurma işlevi genellikle hasarı önleyemedi. Paylaşılan tohum delme kısmındaki bu otomatik durdurma başarısızlığı, teknikler arasındaki farklılaşmayı zorlaştıran bilinmeyen aşırı hasara neden olabilirdi. Bu nedenle, diğer iki yöntemi otomatik durdurmayı dahil etmeden değerlendirmek için otomatik durdurma olmadan darbeli bir noktadan noktaya yöntemle ikili bir karşılaştırma yapılmıştır. Noktadan noktaya darbeli yöntem, noktadan noktaya karşılaştırıldığında anlamlı bir fark yoktu (p = 0.486), oysa darbeli noktadan noktaya yöntem, yatay yöntemden anlamlı olarak daha az EB varlığına sahipti (p = 0.043). Darbeli noktadan noktaya ve noktadan noktaya yöntemler arasındaki önemsizlik, noktadan noktaya sondajdaki büyük varyasyona bağlanabilir (Şekil 4).
Şekil 3'te, uygun otomatik durdurma özelliklerine sahip hem yatay (Şekil 3C) hem de noktadan noktaya (Şekil 3D) delmenin temsili görüntüleri gösterilmektedir. Görsel olarak ve EB floresan görüntüleme yoluyla, noktadan noktaya ve yatay kesim yoluyla delmenin, kontrol gruplarına kıyasla beyindeki vaskülatüre zarar verdiği görülmüştür (Şekil 3A, B). Darbeli noktadan noktaya yöntemi (Şekil 3E), tohum ve kenar noktasında daha az lokalize hasara sahipti, ancak yine de kraniyal pencerede görünür EB varlığına sahipti.
Şekil 3: Vasküler hasar. Eksternal pencere kraniyotomisinden etkilenen alanın ortalama parlaklığını belirlemek için eksize beyinlerin (1) ve karşılık gelen ROI'lerin (2) EB floresan görüntüleri kullanılmıştır. (A) Beyin vaskülatüründe temel arka plan EB varlığını elde etmek için fareye kraniyal pencere ameliyatı olmadan EB enjekte edildi. (B) Fareye sadece salin enjekte edildi ve kraniyal pencere kraniyotomisi yapıldı. Bu, ölçülen ortalama ışımanlığın, sızan kan damarları ve kraniyal pencere bölgesine yakın vasküler travma nedeniyle EB birikimine atfedildiğini ortaya koymuştur. (C) Fareye EB enjekte edildi ve kafatası penceresi yatay otomatik delme yöntemiyle oluşturuldu. (D) Fareye EB enjekte edildi ve kafatası penceresi noktadan noktaya otomatik delme yöntemiyle oluşturuldu. (E) Farelere (n = 2) EB enjekte edildikten sonra noktadan noktaya darbeli delme yöntemiyle üretilen kafatası penceresinin iki temsili görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Hasarın görsel olarak incelenmesi
Beyinleri görsel olarak incelemek, beynin yüzeyinde fiziksel hasar olduğunu gösterir (Şekil 4). A-D panelleri yatay delmenin EB varlığını, E-H panelleri noktadan noktaya yöntemi ve I-L panelleri darbeli noktadan noktaya yöntemini gösterir. "Noktadan noktaya" dikey pilot delik kesimleri gerçekleştirirken, "yatay" deliği özetleyen kafatası penceresinin çevresi boyunca yatay kesimler gerçekleştirir. "Darbeli noktadan noktaya", otomatik durdurma özelliğini kullanmadan noktadan noktaya aynı yöntemleri kullanır ve kullanıcının sondajı ayarlanan derinlik artışlarında durdurmasına bağlıdır. Beyindeki termal hasar miktarını en aza indirecek bir yöntem bulunmasına rağmen, matkaptan kaynaklanan mekanik hasar sorunu hala vardır. İdeal olarak, BOS'u algılayan ve beyin dokusuna zarar vermeden önce delmeyi durduran bir otomatik durdurma özelliği burada işe yarayacaktı, ancak tutarlı bir şekilde çalışmıyor gibi görünüyordu. Darbeli manuel delmede aşırı özen gösterilse bile, beyinde hala görsel hasar vardı. Bu, iki faktörün sonucu olabilir: 1) elle delme ile birlikte gelen kontrol ve his eksikliği ve 2) fare gibi küçük bir hayvan için kafatası ile beyin arasındaki ayırma derinliği. El delme, yeterli uygulama ve uzmanlıkla beyne zarar vermeden kafatasından geçmek için daha kontrollü bir yöntem sunabilir. Bununla birlikte, bir tak ve çalıştır robotuna kıyasla çok daha yüksek beceri ve eğitime ihtiyaç vardır, bu da birkaç "cerrahın" aynı çalışmaya katkıda bulunmasına izin verir - intrakortikal mikroelektrot alanında yaygın bir uygulama değildir. Farelerde, beyin ve kafatası arasındaki mesafe son derece incedir, bu nedenle 10 μm'lik en ufak bir aşırı matkap bile beyinde mekanik hasara neden olabilir.
Şekil 4: Hasarın görsel muayenesi. Üç delme yönteminin her biri için görsel inceleme ve temsil için elde edilen tüm beyinlerin dijital görüntüleri. (A-D) Yatay sürekli olarak mekanik veya termal hasardan dolayı kafatası penceresinin etrafında hasar gösterdi. (E-H) Noktadan noktaya, sonuçlarda önemli farklılıklar gösterdi ve bu da sondaj için daha az güvenilir bir yöntem olduğunu gösterdi. (I-L) Darbeli noktadan noktaya daha tutarlıydı ve EB floresan analizi ve termokupl sonuçlarındaki farklılıklarla eşleşen diğer yöntemlerden daha az görsel hasar gösterdi. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Yatay | Nokta | Darbeli | Kontrol | |
| Yatay | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| Nokta | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| Darbeli | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
Tablo 1: EB floresan görüntüleme sonuçlarının istatistiksel analizi. Farklı sondaj teknikleri için EB floresan görüntüleme sisteminden elde edilen sonuçlar, Benjamin-Hochberg düzeltmesi ile Kruskal-Wallis rütbe toplamı testi kullanılarak analiz edildi ve ardından Wilcoxon rütbe toplamı kesin testi (grup başına N = 4) kullanılarak ikili karşılaştırmalar yapıldı. Gruplar arasındaki önemli farklılıklar yıldız işareti * ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EB boya ve görüntüleme kullanımı, yeni yöntemler ve teknikler için beyindeki vasküler hasarı değerlendirmek için basit, hızlı ve yararlıdır. İster cerrahi bir robot kullanın, ister şu anda laboratuvarda yapılan yöntemleri onaylayın, deneysel tedavilerin cerrahi etkiye karşı etkilerini izole etmek ve hayvan refahını iyileştirmek için cerrahi yöntemleri doğrulamak önemlidir. Bir termokupl kurulumu, ısınma oluşmamasını sağlamak için sondaj yöntemlerinin değerlendirilmesinde de yararlıdır. Kemik delme nedeniyle sıcaklıktaki artışların doku hasarına neden olduğu bilinmektedir ve 5 ° C'lik bir artış bile beyinde büyük vasküler hasara neden olmak için yeterlidir 32,33,34,35,36. Laboratuvar ve cerrahi teknikleri geliştirmek için burada detaylandırılan yöntemlerin kullanılması önerilir.
Değerlendirme için yararlı olsa da, termokupl değerlendirmesinin birkaç sınırlaması vardır. Termokupl verileri, termokuplın beyne sığması için kafatasının yan tarafında bir delik açılması gerekliliği ve bunun sonucunda beyinde olası hasarlar nedeniyle kadavra fareleri kullanılarak elde edilir. Sonuç olarak, hayvanın fizyolojik sıcaklığı yerine sondaj boyunca sıcaklık farkı ölçülür. Ek olarak, analize dahil edilmeyen fizyolojik sıcaklık düzenleme fonksiyonları olabilir.
Protokol sırasında birkaç adım, doğru delme işlemini sağlamak için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kafatası hizalaması, yanlış yapılırsa, beyne zarar vermenin yanı sıra zayıf delme doğruluğuna yol açacaktır (otomatik durdurma işe yaramazsa). Bu sorunu önlemek için eğim düzeltmesinden önce hayvanın montajının mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Eğim düzeltme işlemini yavaş ve emin adımlarla izleyerek eğim ofsetlerini düzeltin. Bu çalışma sırasında birkaç vakada eğim kapalıydı ve matkap sisteminin, matkap ucu kafatasına temas etmemiş olmasına rağmen kafatasına deldiğine inanmasına neden oldu. Büyük ölçüde, bu kafatası kalınlığını doğru bir şekilde kaydetmek için bir sorundur ve yeterince korkunç ise, sondaj koordinatlarında yanlışlığa neden olabilir. Ayrıca, otomatik durdurma özelliği tutarsızdı ve dikkatli kullanılmalıdır. Beyne zarar gelmesini önlemek için yalnızca otomatik durdurma özelliğine güvenmeyin. Aşırı delme işleminin gerçekleşmediğinden emin olmak için her zaman delme deliğini kontrol edin.
Otomatik durdurmadan bağımsız olarak, noktadan noktaya ve yatay delme yöntemleri için gerçekleştirilebilecek birkaç optimizasyon vardır. Beyne tesadüfi bir zarar gelmemesini sağlamak için, noktadan noktaya kenar kesme sırasında bir matkap ofseti kullanır, ancak kullanıcının bu ayarı test yoluyla önceden belirlemesi gerekir. Doğrusal bir enterpolasyon yöntemi, temel olarak en sığ tohum noktası ile birleştirilebilir, böylece kafatasının etrafındaki daha kalın tohumlarda beyinde hasar oluşmaz. Gerekirse, kullanıcı her zaman kafatasının daha kalın bir bölgesine geri dönebilir ve daha derine inebilir. Yatay kesme adımı, kenar noktaları etrafındaki her dönüş için bir derinlik kesme aralığı (varsayılan değer 100 μm) kullanır. Bu, çok derin delmeyi ve beyne zarar vermeyi önlemek için kafatası kalınlığına göre de belirlenebilir.
Transgenik fareler, intravital multifoton görüntüleme için güçlü bir deneysel modeldir. Transgenik farelerde kraniyal pencereler için cerrahi robot kullanımı bu çalışmada vurgulanırken, diğer kranial ameliyatlarda cerrahi robot kullanımına dikkat etmek önemlidir. Sondajı kontrol etme ve standartlaştırma yeteneği, sahadaki daha büyük hayvan çalışmalarında kraniyotomilere faydalar sağlar. Bazı mekanik hasarlar görsel olarak gözlemlenmiş olsa da, bu büyük olasılıkla farelerde beyin ve kafatası arasındaki son derece küçük ayrımdan kaynaklanmaktadır. Sıçanlar gibi daha büyük hayvanlar, daha fazla subaraknoid alana ve daha kalın duraya sahiptir, bu da robotik delme nedeniyle daha az mekanik hasar riski sağlar25. Burada darbeli yöntem kullanılarak gösterilen termal hasardaki azalma ile birlikte, cerrahi robot, çeşitli hayvan modellerinde sondajdan kaynaklanan hasarı önemli ölçüde azaltma potansiyeline sahiptir.
Genel olarak, darbeli noktadan noktaya yöntem, daha az ısınma veya beyinde daha az mekanik hasarın bir sonucu olarak en az miktarda hasar gösterdi. Elle delme, hasarı önlemek için daha kontrollü bir yöntem sunabilir, ancak cerrahi bir robotun faydalarını vurgulamak önemlidir. Bir robot daha az eğitime ihtiyaç duyar, cerrahtan cerraha değişkenliği azaltmaya yardımcı olabilir ve tamamen optimize edildikten sonra laboratuvarlarda daha standart bir prosedüre ödünç verebilir. Ek olarak, bir cerrahi robot için öğrenme eğrisi, elle yapılan ameliyattan çok daha düşüktür. Bu sadece tekniği öğrenmek için gereken süreyi azaltmakla kalmaz, aynı zamanda eğitim amaçlı kullanılan hayvan sayısını da azaltır. Kraniyal pencere delme prevalansı, yayınlanmış makalelerde görüldüğü gibi beyinden çoklu foton görüntülemenin yeniliği ile artmıştır20,37. Termokupllar ve EB boya görüntüleme gibi karakterizasyon yöntemlerinin kullanılması, delme tekniğinin optimize edilmesine yardımcı olurken, robotların kullanımı zor ameliyatları daha erişilebilir ve yaygın hale getirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bildirecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur. İçerikler, ABD Gazi İşleri Bakanlığı, Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Amerika Birleşik Devletleri (ABD) Gazi İşleri Bakanlığı Rehabilitasyon Araştırma ve Geliştirme Servisi'nden GRANT12418820 (Capadona) ve GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona) Merit Review Awards # GRANT12635707 (Capadona) tarafından desteklenmiştir. Ek olarak, bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü GRANT12635723 (Capadona) ve Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü, T32EB004314 (Capadona / Kirsch) tarafından da desteklenmiştir. Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından Hibe No. GRANT12635723 kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri, yazar(lar)a aittir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
