Summary
Kranievinduer er blevet en allestedsnærværende implementeret kirurgisk teknik for at muliggøre intravital billeddannelse hos transgene mus. Denne protokol beskriver brugen af en kirurgisk robot, der udfører halvautomatisk knogleboring af kranievinduer og kan hjælpe med at reducere kirurg-til-kirurg-variabilitet og delvist afbøde termisk blod-hjerne-barriereskade.
Abstract
Kranial vindueskirurgi giver mulighed for billeddannelse af hjernevæv i levende mus ved brug af multifoton eller andre intravitale billeddannelsesteknikker. Men når man udfører kraniotomi i hånden, er der ofte termisk skade på hjernevæv, som i sagens natur er variabel kirurgi til kirurgi og kan være afhængig af individuel kirurgteknik. Implementering af en kirurgisk robot kan standardisere kirurgi og føre til et fald i termisk skade forbundet med kirurgi. I denne undersøgelse blev tre metoder til robotboring testet for at evaluere termisk skade: vandret, punkt for punkt og pulserende punkt for punkt. Vandret boring bruger et kontinuerligt boreskema, mens punkt-for-punkt borer flere huller, der omfatter kranievinduet. Pulserende punkt-for-punkt tilføjer et "2 s on, 2 s off" boreskema for at muliggøre afkøling mellem boringen. Fluorescerende billeddannelse af Evans Blue (EB) farvestof injiceret intravenøst måler skade på hjernevæv, mens et termoelement placeret under borestedet måler termisk skade. Termoelementresultater indikerer et signifikant fald i temperaturændringen i de pulserende punkt-for-punkt (6,90 °C ± 1,35 °C) grupper sammenlignet med de vandrette (16,66 °C ± 2,08 °C) og punkt-for-punkt (18,69 °C ± 1,75 °C) grupper. På samme måde viste den pulserende punkt-for-punkt-gruppe også signifikant mindre EB-tilstedeværelse efter kranial vinduesboring sammenlignet med den vandrette metode, hvilket indikerer mindre skade på blodkar i hjernen. Således synes en pulserende punkt-for-punkt boremetode at være den optimale ordning til reduktion af termisk skade. En robotboremaskine er et nyttigt værktøj til at minimere træning, variabilitet og reducere termiske skader. Med den voksende brug af multifotonbilleddannelse på tværs af forskningslaboratorier er det vigtigt at forbedre resultaternes stringens og reproducerbarhed. De metoder, der behandles her, vil hjælpe med at informere andre om, hvordan man bedre kan bruge disse kirurgiske robotter til yderligere at fremme feltet.
Introduction
Kranievinduer er blevet allestedsnærværende brugt inden for neurovidenskab, neural teknik og biologi for at muliggøre direkte visualisering og billeddannelse af cortex hos levende dyr 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftfulde kombination af transgene mus og multifotonbilleddannelse har givet ekstremt værdifuld indsigt i kredsløbsaktivitet og anden biologisk indsigt i in vivo-hjernen 12,13,14,15,16,17,18. Miniaturemikroskoper monteret på kraniet har yderligere udvidet disse muligheder for at muliggøre optagelser i vågne, frit bevægelige dyr19. Processen med at skabe et kranievindue kræver powerboring for at tynde eller helt fjerne kraniebenet for at producere store nok kraniotomier til at sikre et gennemsigtigt stykke glas over cortex20. Polydimethylsiloxan (PDMS) og andre polymerer er også blevet testet som kranievinduesmaterialer 9,21. I sidste ende er det ideelle kranievindue et, der ikke ændrer eller forstyrrer normal endogen aktivitet nedenunder. Det er imidlertid almindeligt accepteret, at kranial vinduesboring forværrer underliggende væv, hvilket fører til skade på hjernen, forstyrrelse af miljøet og påvirker meninges til det punkt, hvor multifotonbilleddannelse falder22. Den resulterende neuroinflammation har en bred vifte af virkninger, der spænder fra permeabilitet af blod-hjerne-barrieren (BBB) til aktivering og rekruttering af gliaceller omkring implantatstedet23. Derfor er karakterisering af sikrere og mere reproducerbare kranievinduesboremetoder afgørende for ensartet billedkvalitet og reduktion af forstyrrende faktorer.
Mens man sørger for at minimere traumer i det underliggende væv, har handlingen med at bore knoglen potentialet til at forårsage både termiske og mekaniske forstyrrelser i hjernen24,25. Mekanisk traume fra utilsigtet borindtrængning i dura kan yderligere fremkalde varierende grader af kortikal skade24. I en undersøgelse af Shoffstall et al.25 resulterede varmen fra knogleboring i en øget BBB-permeabilitet, som indikeret af tilstedeværelsen af Evans Blue (EB) farvestof i hjernens parenchyma25. EB-farvestof, injiceret intravenøst, binder sig til cirkulerende albumin i blodbanen og krydser derfor normalt ikke en sund BBB i mærkbare koncentrationer. Som et resultat anvendes EB-farvestof almindeligvis som en følsom markør for BBB-permeabilitet26,27. Mens deres undersøgelse ikke direkte målte virkningen af BBB-permeabiliteten på efterfølgende biologiske følgevirkninger, der blev undersøgt, har tidligere undersøgelser korreleret BBB-permeabilitet med et øget neuroinflammatorisk respons på kronisk implanterede mikroelektroder og ændringer i motorisk funktion28.
Afhængigt af undersøgelsens mål kan størrelsen af termisk og mekanisk skade bidrage til en kilde til eksperimentel fejl, hvilket negativt påvirker undersøgelsens strenghed og reproducerbarhed. Der er snesevis af citerede metoder til fremstilling af kranievinduer, hver ved hjælp af forskellige boreudstyr, hastigheder, teknikker og brugere 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterede, at den observerede variation i opvarmningsresultaterne blev tilskrevet variabilitet i borets påførte kraft, tilførselshastighed og anvendelsesvinkel, blandt andre aspekter, der ikke kan kontrolleres for ved boring medhånden 25. Der er en tro på, at automatiserede boresystemer og andet stereotaksisk udstyr kan forbedre reproducerbarheden og udfaldskonsistensen, men offentliggjorte metodestudier har ikke nøje evalueret temperatur eller BBB-permeabilitet som et af resultaterne. Derfor er der behov for mere reproducerbare og konsekvent anvendte metoder til fremstilling af kranievinduer samt metoder, der anvendes strengt til at vurdere virkningen af kranievinduesboring på underliggende neuralt væv.
Fokus for denne undersøgelse er at bestemme og udvikle konsistente og sikre boremetoder til kranievinduer. Størrelsen af kraniotomien til kranial vinduesinstallation er signifikant større end standard kraniotomier til hjerneimplanterede mikroelektroder. Sådanne kraniotomier kan ikke udfyldes med et enkelt burrhul, når der anvendes standardudstyr, hvorved der indføres mere interkirurgisk teknikvariation, når den udføres med hånd20. Kirurgiske borerobotter er blevet introduceret til feltet, men er ikke blevet bredt vedtaget 1,6,29. Automatisering af boring giver kontrol over variabler, der bidrager til observeret variation fra forsøg til forsøg, hvilket tyder på, at brugen af udstyret kan reducere inter- og intrakirurgeffekter. Dette er af særlig interesse i betragtning af den ekstra vanskelighed ved den større kraniotomi, der er nødvendig for kranial vinduesplacering. Mens man kunne antage, at der var klare fordele ved den kontrol, der leveres ved automatisering af boringen, har der været ringe vurdering af implementeringen af dette udstyr. Selvom der ikke er observeret synlige læsioner5, ønskes den højere følsomhedstest med EB.
Her måles BBB-permeabilitet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig kirurgisk borerobot med tilsvarende software, som giver mulighed for programmering af stereotaksiske koordinater, kraniotomiplanlægning/kortlægning og et udvalg af borestilarter ("punkt-for-punkt" vs "vandret"), der henviser til borets rutebane. Indledningsvis bores otte "frø" -punkter (figur 1A), der skitserer kranievinduet. Herfra skæres mellemrummet mellem frøene ud ved hjælp af enten "punkt-for-punkt" eller "vandret" boremetode. "Point-by-point" udfører lodrette pilothulskæringer (svarende til en CNC-borepresse), mens "vandret" udfører vandrette snit langs omkredsen af kranievinduet, der skitserer hullet (svarende til en CNC-router). Resultatet for begge metoder er et stykke kranium, der kan fjernes for at afsløre kranievinduet. For at isolere skader fra boring fjernes kranievinduet ikke fysisk for at undgå yderligere skader. En kombination af EB-farvestof kombineret med fluorescerende billeddannelse bruges til at måle BBB-permeabilitet efter udførelse af kraniotomier hos mus, og et indsat termoelement bruges til direkte at måle temperaturen på hjerneoverfladen under boring (figur 1B, C). Tidligere observationer indikerede, at pulserende boring til/fra med 2 s intervaller var tilstrækkelig til at afbøde boreopvarmning25 og derfor er indarbejdet i den eksperimentelle tilgang til den kirurgiske robot.
Formålet med det præsenterede arbejde er at demonstrere metoder til vurdering af termiske skader fra kraniotomiboring. Mens metoderne præsenteres i forbindelse med automatiseret boring, kan sådanne metoder også anvendes på manuelle boreordninger. Disse metoder kan anvendes til at validere brugen af udstyr og/eller boresystemer, inden de vedtages som standardprocedure.
Figur 1: Skematisk eksperimentel pipeline. Skematisk demonstration af den proces, dyrene gennemgik til EB-kvantificering efter kraniel vinduesprocedure. (A) Skematisk opsætning af musen med stereotaksisk ramme og kirurgisk robotbor. Et eksempel kranievindue er vist over motorcortex med frøpunkter (grøn) og kantpunkter (blå). (B) Perfusionsopsætningen omfatter injektion af 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i hele dyret for at fjerne blod efterfulgt af ekstraktion af hjernen. (C) Hjernen sættes derefter ind i EB-fluorescerende billeddannelsessystemkammer for at udføre fluorescerende billeddannelse på Evans Blue-farvestoffet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og dyreplejepraksis blev gennemgået, godkendt af og udført i overensstemmelse med Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Opsætning af kirurgisk robothardware
- Før operationen skal du følge den kirurgiske robot (se materialetabellen) manual og vejledning for at konfigurere hardware og software. Udfør rammekalibrering som beskrevet i manualen. Hvis boret eller rammen flyttes, anbefales det at kalibrere boret igen for at sikre nøjagtighed.
2. Software forberedelse
- Gå til den kirurgiske software (se Materialetabel), og opret et nyt projekt ved at vælge Start med et rent projekt. Indstil motivet som Mus øverst for at angive de borekoordinater, der skal bruges.
- Vælg Start nyt projekt.
- Herfra skal du klikke på Planlægning i nederste venstre hjørne for at navigere til skærmbilledet til planlægning af borekoordinater. Opret boreskemaet for kranievinduesteknikken, der skal udføres.
- For at gøre dette skal du klikke hvor som helst på det stereotaxiske atlas. Brug Bregma som reference, og indtast følgende koordinater for motorcortex: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Tryk på Enter på tastaturet for at opdatere de valgte koordinater.
BEMÆRK: Dorsal-Ventral (DV) koordinaterne angiver dybden af boringen og behøver derfor ikke input her. - Klik på Store Target for at gemme disse koordinater og indtaste et passende navn. Herfra skal du klikke på knappen Flyt nederst til venstre for at navigere tilbage til hovedboreskærmen.
- For at gøre dette skal du klikke hvor som helst på det stereotaxiske atlas. Brug Bregma som reference, og indtast følgende koordinater for motorcortex: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Tryk på Enter på tastaturet for at opdatere de valgte koordinater.
- Klik på Værktøjer > Project > Gem som for at genbruge dette skabelonprojekt til senere projekter. Dette bevarer automatisk borekoordinaterne til senere brug.
3. Forberedelse til operation
- Bedøv PrismPlus-mus30,31 (se materialetabel) i et isoflurankammer (3,5 % i 1,5 l/minO2). Påfør øjensmøremiddel for at forhindre tørring af øjnene, barber hovedet ved hjælp af klippere og trim neglene for at forhindre musene i at ridse suturer ud.
BEMÆRK: PrismPlus-mus er en type transgene fluorescerende arter, der anvendes til multifotonbilleddannelse. De heterozygote PrismPlus-mus mangler de fluorescerende gener og blev derfor brugt her til at reducere animalsk affald fra andre igangværende undersøgelser, og da der ikke er nogen multifotonbilleddannelse i denne undersøgelse. Vildtypemus forventes at vise lignende resultater. - Administrer subkutane injektioner af antibiotika cefazolin (24 mg / kg), smertestillende carprofen (5 mg / kg) og buprenorphin (0,05-0,10 mg / kg) til de bedøvede mus. Før ethvert snit skal du administrere en enkelt subkutan injektion af marcain (0,25%, 100 μL) under snitstedet (1 tomme langs midterlinjen af kraniet, der starter bag øjnene).
BEMÆRK: Medicin, der anvendes her, følger tidligere etablerede IACUC-protokoller. Det anbefales dog at overveje EMLA creme som et topisk bedøvelsesmiddel til en multimodal effekt før operation og haleveneinjektion samt Meloxicam SR i stedet for Carprofen. EMLA og Meloxicam SR kan gives før isofluranbedøvelse. - Monter dyret på den kirurgiske robots stereotaksiske ramme ved hjælp af medfølgende ørestænger, og vedligehold anæstesi med 0,5% -2% isofluran via indånding gennem en næsekegle.
- Sørg for, at bedøvelsesdybden overvåges nøje af en uddannet dyrlægetekniker eller personale baseret på musens lydhørhed, åndedræt (~ 55-65 vejrtrækninger / min), puls (300-450 bpm) og farve (pink). Whisker og regelmæssig tåklemme kan også bruges som et mål for at bestemme dybden af anæstesi. Vitalernes værdier bestemmes af institutionelle IACUC-regler.
- Oprethold dyrets kropstemperatur på en cirkulerende vandpude og overvåg vitaliteten ved hjælp af et blod-ilt- og pulsmålingssystem.
- Skrub det kirurgiske område med chlorhexidingluconat (CHG) og 70% isopropanol til sterilisering. For at opretholde sterilitet under operationen skal du placere en steril plastfolie over musen og stereotaksisk ramme.
BEMÆRK: Mens disse protokoller blev udviklet til overlevelsesoperationer, afspejler de præsenterede data brugen af ikke-overlevende dyr, da fokus var at teste og bestemme de passende boreprotokolmetoder.
4. Forberedelse af kraniet
- Brug et skalpelblad til at udføre et 1 tommer snit på kraniets midterlinje, startende bag på øjnene.
- Træk huden tilbage for at udsætte kraniet og (valgfrit) brug retraktorer til at vedligeholde det kirurgiske vindue. Fjern eventuelt resterende væv og membran ved hjælp af sterile applikatorer med bomuldsspids.
- Tør ud og rengør kraniet med 3% hydrogenperoxid med applikatorer med bomuldsspids.
BEMÆRK: Dette vil gøre kraniets suturer synlige. Bregma og Lambda skal let ses. Hvis ikke, skal du anvende mere hydrogenperoxid eller øge snittets størrelse. - Tillad "auto-stop" -funktionalitet ved at fastgøre alligatorklemmekablet fra den kirurgiske robotboreopsætning til musen i henhold til producentens anbefalinger. "Auto-stop" virker ved at detektere en ændring i impedans, så når boret kommer i kontakt med cerebrospinalvæske (CSF) i stedet for knogle, stopper boret boringen og forhindrer derved skader på hjernen.
5. Evans blå halevene injektion
FORSIGTIG: EB er et muligt kræftfremkaldende stof. Brug handsker ved håndtering.
- For at forberede halen til let injektion skal du tørre ned med en alkoholserviet. Eventuelt kan vintergrøn olie påføres topisk for at udvide venen35.
- Tag fat i halen i den ene hånd, mens du håndterer sprøjten med EB i den anden hånd. Brug tommelfingeren og pegefingeren til at bøje halen for at udsætte halevenen oven på halens bøjning. Indsæt sprøjten (1 eller 2 ml 30 G insulinsprøjte) parallelt med venen og injicer langsomt mængden af EB. EB (4% w/v) administreres i en koncentration på 2 ml/kg legemsvægt via haleveneinjektion.
BEMÆRK: Minimal eller ingen modstand mod strømning fra sprøjten ind i halen kan mærkes, hvis nålen er korrekt indsat. Hvis der er modstand eller EB-farvestof vises i halen, skal du bevæge dig ned på halen og prøve igen. - Når den er injiceret, skal du vente i 5 minutter, så EB kan cirkulere gennem musen, før boringen begynder. Vellykket injektion verificeres straks, da musens ekstremiteter og kirurgiske vindue bliver blå.
6. Procedure for kirurgisk robotboring
- Når kraniet er klar til boring, skal du navigere tilbage til den kirurgiske software. Åbn det skabelonprojekt, der er defineret i trin 2.4, hvor koordinaterne for boringen blev udpeget.
- Følg Værktøjer > Project > Ny > Vælg et skabelonprojekt, og vælg det skabelonprojekt, der blev angivet i trin 2 (softwareforberedelse).
- Vælg Samme protokolelementer > Planlægning (målpunkter) > Detaljeparametre , der skal overføres til dette nye projekt.
- Klik på Start nyt projekt.
- Korriger derefter boret og rammen for at tage højde for hældningen og skaleringen af musens kranium af det aktuelle dyr. Klik på Værktøjer , og vælg Ret til hældning og skalering... for at åbne korrektionsskærmen. Sørg for, at boret er aktivt (ikke sprøjten) øverst på skærmen ved at klikke på den lysrøde boreknap .
BEMÆRK: Når den er aktiveret, bliver boreknappen mørk/lys rød. Sprøjteknappen kan ignoreres, da den ikke bruges i denne protokol.- Først skal du rette skalaen, tonehøjden og gabet ved at indstille, hvor Bregma og Lambda er placeret på det aktuelle dyr. Brug enten tastaturknapperne eller knapperne på skærmen til at flytte borekronen. Når boret er placeret over Bregma, sænkes det, indtil det lige rører kraniet, og klik på Indstil Bregma. Gentag dette for Lambda.
- Juster derefter for den specifikke rulle af kraniet. Klik på knappen Gå til midtpunkt for automatisk at justere boret til midten af kraniet. Klik 2 mm til venstre , og sænk derefter langsomt boret, indtil du rører kraniet. Klik på Indstil venstre punkt.
- Gentag trin 6.2.2 for højre side af hjernen. Nu er systemet sat op til dette specifikke kranium.
BEMÆRK: Korrektion her er afgørende for at sikre korrekt boringskoordinater og dybde. Musen skal monteres så tæt på lige som muligt for at reducere behovet for korrektion så meget som muligt. Hvis der er behov for store korrektioner, kan det resultere i dårlig nøjagtighed af boringen.
- Når korrektionen er udført, skal du komme ud af korrektionsvinduet ved at klikke på Lukke nederst midt på skærmen. Naviger til boreskærmen ved at klikke på Værktøjer og derefter vælge Bore... for at starte boreproceduren.
- Sørg for, at Kraniotomi-form er valgt i rullemenuen Drill øverst på skærmen. Klik derefter på Vælg detaljecenter & form , og vælg det foruddefinerede mål, der blev navngivet i trin 2.3.1. Under denne skærm skal du vælge Cirkel som form for målet og indtaste 2.60 mm som diameteren2 af cirklen. Klik på Vis.
BEMÆRK: Kranievinduets diameter oprettes ved hjælp af midten af boret som centrum af frøpunkterne. Et lille bor (diameter = 0,6 mm eller den anbefalede bitstørrelse leveret af leverandøren) bruges til at minimere den ekstra diameter, der tilføjes som følge af brugen af et større bor. Særlige bor bruges specielt til den kirurgiske robot. De otte frøpunkter og kantpunkter vil nu dukke op på kraniet som henholdsvis grønne og blå prikker. - Klik på hovedvinduet og brug tastaturgenvejen Control + Shift + D til at åbne menuen Drill Points i højre side af skærmen. Dette giver mulighed for at se specifikke dybder og status for borepunkter.
- Før boringen begynder, skal du tilpasse autostopfunktionen, hvis det er nødvendigt, ved at klikke på knappen ved siden af afkrydsningsfeltet Auto-Stop . Denne knap er som standard Medium, hvilket svarer til følsomheden for autostopfunktionen.
BEMÆRK: Dette kan testes på forhånd for at finde den rigtige følsomhed for dyrene. I denne protokol blev den højeste følsomhed brugt til at sikre minimal boring gennem hjernen. - Når auto-stop-funktionen er aktiveret og tilpasset, skal du begynde såningen af frøpunktet. Klik på Automatisk scanning , så såmaskinen automatisk begynder ved Seed 1. Når boret rører CSF, registrerer auto-stop-funktionen en ændring i impedans, hvilket fører til et stop i boringen og tilbagetrækning af biten fra kraniet.
- Hold godt øje med boringen, hvis autostoppet ikke registrerer ændringer. Der kan trykkes på esc-tasten for manuelt at annullere boringen. Den lyserøde cirkel nederst i menuen Detalje og til højre for impedansværdierne kan også klikkes for enten at starte eller stoppe boringen.
BEMÆRK: Boret borer automatisk til en dybde svarende til den estimerede kranietykkelse (eller indtil autostop-funktionen aktiveres). - Hvis automatisk stop ikke er aktiveret, før den estimerede dybde er nået, vises en skærm, der beder brugeren om at: 1) Fortsæt boring og faldende # mm længere, 2) Marker ved aktuel dybde og fortsæt, 3) Spring det aktuelle punkt over og fortsæt, eller 4) Stop processen (kan fortsættes senere). Vælg en af mulighederne som beskrevet nedenfor.
- For Fortsæt boring og nedad # mm længere skal du indtaste en afstand, hvor boret kan rykke frem. Som standard bruges 0,1 mm. En mindre afstand kan foreslås for at forhindre utilsigtet indtrængning af hjernen.
- Hvis det antages, at dura er nået på denne skærm, skal du vælge Marker i den aktuelle dybde og fortsæt mulighed for systemet at markere dura på den dybde og gå videre til næste frø.
- Brug ikonet Spring det aktuelle punkt over , og fortsæt og Stop processen (kan fortsættes senere) til fejlfinding eller rensning af boret og vend tilbage, når autostoppet fungerer igen.
- Når alle frøpunkterne er blevet sået, hvis nogen ikke var færdige med at bruge auto-stop-funktionen, skal du kontrollere hullets dybde manuelt ved hjælp af et dura-valg. Dette vil sikre, at den borede dybde trængte gennem kraniet.
- Før du begynder at bore kantpunkt, skal du beslutte, hvilken type 'kantskæring' der ønskes, ved at vælge rullemenuen ud for kantsnitteksten i menuen Drill. De to muligheder er punkt for punkt og vandret.
- Vælg punkt for punkt for at så hvert kantpunkt individuelt og til en dybde, der bestemmes af de tilstødende frøpunktdybder. Juster skaleringen, hvis det kræves, via knappen Edge Scaling... nedenfor, selvom standardindstillingen Ingen skalering normalt er tilstrækkelig.
- Vælg vandret for at begynde boringen ved kantpunkt 1, og brug en kontinuerlig borebevægelse til at gå rundt om hele borecirklens omkreds. Som standard skærer det vandrette snit med 100 μm intervaller og går hele vejen rundt om vinduets omkreds, før det går yderligere 100 μm dybere. Hvis det er nødvendigt, kan du ændre intervaldybden og borehastigheden under knappen Klipindstillinger... nedenfor.
- Brug den automatisk skårne forskydning (under feltet Kantskæring ) til at justere for den automatiske skæredybde ved at tage en forudbestemt forskydning fra de tilstødende frøpunkter. I denne protokol blev der anvendt en automatisk skåret forskydning på 20 μm. Yderligere test kan udføres for at bestemme en optimal forskydning pr. Dyr.
- Når indstillingerne for kantskæring er fastlagt, skal du starte kantpunktsboringen ved at klikke på knappen Automatisk klipning midt i menuen Drill. Ved punkt-for-punkt-boring er boreproceduren afsluttet, når den sidste kant er boret. Ved vandret boring fortsættes, indtil der er boret nok kranium til at frigøre kranievinduet.
BEMÆRK: Selvom boringen udføres, indtil vinduet kan frigøres, frigøres vinduet ikke fysisk her for at forhindre skade på underliggende væv. Det er vigtigt at isolere skaden som følge af bare boring for at evaluere forskellige boreskemaer.- Når den vandrette såning har nået dybden af et frøpunkt, skal du højreklikke på det frø (eller vælge flere punkter først) i menuen Borepunkter og klikke på Lås dybde. Dette vil gøre det muligt for vandret skæring at fortsætte uden at skære dybere for dette område (og dermed undgå at trænge ind i hjernen).
BEMÆRK: Hvis der er såpunkter med forskellige duradybder, kan dette medføre forskelle i den dybde, der er nødvendig for den vandrette boreprocedure.
- Når den vandrette såning har nået dybden af et frøpunkt, skal du højreklikke på det frø (eller vælge flere punkter først) i menuen Borepunkter og klikke på Lås dybde. Dette vil gøre det muligt for vandret skæring at fortsætte uden at skære dybere for dette område (og dermed undgå at trænge ind i hjernen).
- Hvis autostop-funktionen ikke fungerer korrekt, skal du sørge for, at boret er helt rent for snavs eller potentielt blod, saltvand osv., Da disse kan påvirke bitens basisimpedans. Derudover skal du vælge mellem en af de mange manuelle boremuligheder, der er beskrevet nedenfor, hvis autostoppet ikke fungerer konsekvent.
- I menuen Bor skal du navigere manuelt til hvert frø ved at højreklikke på frøet eller kanten og vælge Gå til post. Der er også muligheder for at rydde de markerede dybder, nulstille hullet og andre muligheder, der kan hjælpe med boreproceduren.
- Kontroller manuelt udviklingen af boredybden ved at vælge en dybde på rullelisten ved siden af teksten Advance: nær toppen af menuen Drill. Klik på knappen Advance direkte nedenfor for at gå videre med øvelsen af den indstillede afstand.
BEMÆRK: Denne funktion kan bruges sammen med knapperne Indstil Dura og Indstil overflade under knappen Advance til manuelt at fortælle systemet, hvor både overfladen af kraniet og dura er placeret. Brug autostopfunktionen, hvor det er muligt, men hvis det er nødvendigt, er disse manuelle indstillinger også tilstrækkelige. - Hvis du borer manuelt, skal du være mere forsigtig mellem hvert boredybdeinterval for at sikre, at boret ikke overstiger duraen. Kontroller det borede hul ved hjælp af en dura pick mellem dybdeintervaller for at bekræfte, om dura blev nået. Når al manuel såmaskine er færdig, skal du fortsætte kantskæringsproceduren normalt som beskrevet ovenfor.
- Puls metode
- For at udføre manuel pulsboring skal du deaktivere auto-stop-funktionen ved at fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet ud for indstillingen Auto-Stop i menuen Drill. Dette skal være slukket for at gøre det muligt at kontrollere, hvornår boret er slukket for pulseringen.
BEMÆRK: Pulsboring følger et mønster på 2 s boring efterfulgt af 2 s uden boring for at give kraniet mulighed for at køle ned. - I menuen Bor skal du vælge 100 μm som fremskridt med boredybden, dette svarer til ~ 2 s nedadgående boring.
- Når du er klar, skal du klikke på Advance for at starte boringen.
BEMÆRK: Vær klar til hurtigt at stoppe boret, når det er rykket frem med 100 μm, da boret fortsætter med at rotere i dybden, indtil flugten trykkes ned (genererer unødvendig varme). - Når boret er rykket 100 μm frem, skal du trykke to gange på Escape for at stoppe boret. Efter 2 s gentages denne cyklus for dybden af kraniet.
BEMÆRK: Kun punkt-for-punkt-metoden kan udføres ved hjælp af pulseringsmetoden på grund af software og mekaniske begrænsninger. Kontinuerlig vandret boring kan ikke udføres på denne måde. - Bor alle frø- og kantpunkter ved hjælp af denne metode beskrevet ovenfor. Sørg for at indstille Dura ved hjælp af knappen i øvelsesmenuen, når dura er nået.
- For at udføre manuel pulsboring skal du deaktivere auto-stop-funktionen ved at fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet ud for indstillingen Auto-Stop i menuen Drill. Dette skal være slukket for at gøre det muligt at kontrollere, hvornår boret er slukket for pulseringen.
- Sørg for, at Kraniotomi-form er valgt i rullemenuen Drill øverst på skærmen. Klik derefter på Vælg detaljecenter & form , og vælg det foruddefinerede mål, der blev navngivet i trin 2.3.1. Under denne skærm skal du vælge Cirkel som form for målet og indtaste 2.60 mm som diameteren2 af cirklen. Klik på Vis.
7. Perfusion og hjerneekstraktion
- Når såningen af frø og kantpunkter er afsluttet, holdes dyret under isofluranbedøvelse i yderligere 1 time for at tillade EB-farvestoffet at cirkulere og ekstravasere gennem den beskadigede BBB. Udfør hjerteperfusion for at fjerne blod eller væsker fra karrene, og fjern derefter hjernen til billeddannelse og analyse som beskrevet nedenfor.
- Efter cirkulationsperioden på 1 time efter dannelsen af kranievinduet injiceres en cocktail af ketamin (160 mg/kg) og xylazin (20 mg/kg) intraperitonealt i dyret. Når du ikke reagerer, skal du udføre en hjerteperfusion.
- Skær musens mave op ved hjælp af en saks og udsæt hjertet ved at skære lodret gennem brystkassen og vandret over membranen. Træk brystkassen tilbage for at se hjertet tydeligt. Indsæt en sommerfuglnål i hjertets venstre ventrikel og begynd at infusere 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i hele kroppen. Klip en lille del af hjertets højre atrium for at frigive trykopbygning.
- Når 25 ml 1x PBS er perfuseret i hele kroppen, skal du stoppe perfusionen og halshugge musen som et sekundært middel til eutanasi.
BEMÆRK: Sørg for at udføre den institutionelt godkendte metode til eutanasi og / eller endepunktperfusion for dyret at isolere hjernen. - Herfra ekstraheres hjernen fra kraniet ved at fjerne knoglen og vævet med rongeurs.
- Tag billeder af den ekstraherede hjerne med et fluorescerende billeddannelsessystem for at observere mængden af EB placeret i hjernen omkring borestederne.
BEMÆRK: EB binder sig til cirkulerende albumin. Hvis der opstår vaskulær skade i hjernen, vil EB lække ud og binde sig til hjernevævet, hvilket fører til en klar visuel indikator for skade.
8. Evans Blue billeddannelse og analyse
- Initialisering af hardware
- Tænd computeren, der er tilsluttet EB-fluorescensbilleddannelsessystemet, og start billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen), mens andre elementer forberedes. Tænd lyskilden, platformen og kameraet i den rækkefølge.
- Naviger til billedbehandlingssoftwaren, og klik på Initialiser under kontrolpanelet til anskaffelse. Systemet og kammeret signalerer fra rød til grøn, så snart initialiseringen er fuldført.
BEMÆRK: Initialiser EB-fluorescerende billeddannelsessystem 30 minutter før billeddannelse for at lade lyskildens temperatur nå optimale niveauer.
- Billeddannelse af hjernen
- Placer den udplantede hjerne i en klar skål på midten af scenen til billeddannelse.
- Under kontrolpanelet til anskaffelse skal du justere indstillingerne for billedet. Vælg eksponeringstid: 1 s; Binning: Medium; F/Stop: F1; Excitation: 535 til 675 nm; Emission: Cy 5,5; Lampeniveau: Høj; og FOV: 5 cm. Lad filteret være låst, og overlejringen af fotografering og fluorescens kontrolleres. Disse indstillinger er baseret på tidligere laboratorieerfaring og andre offentliggjorte metoder til billeddannelse EB36.
- Indlæs EB-billeder af fluorescerende billeddannelsessystemer i billedbehandlingssoftware med åben adgang (se materialetabel), og generer tre frihåndsområder af interesse (ROI'er) for at finde den fluorescerende intensitet af EB ved at måle den gennemsnitlige udstråling over baggrunden, hele hjernen og kranievinduet.
- Normaliser kranievinduet og hele hjernens målinger mod den tilsvarende baggrunds-ROI.
- Billede hver hjerne under forskellige excitationsfiltre (535-675 nm) for at finde bølgelængden med det højeste signal / støjforhold (605 nm blev valgt) mellem de eksperimentelle grupper til saltvandskontrollen.
- Isoler den gennemsnitlige udstråling under den passende bølgelængde og gennemsnit for at opnå den gennemsnitlige gennemsnitlige udstråling eller fluorescerende intensitet for hele hjernen og kranievinduets ROI'er.
- Find og normaliser den gennemsnitlige gennemsnitlige udstråling over kranievinduesområdet for hver gruppe mod saltvandskontrollen.
9. Evaluering af termoelement
- Mål temperaturændringerne i kraniet og hjernen ved hjælp af et termoelement (se materialetabel) i kombination med de tre forskellige boreskemaer. Termoelementet er forbundet til et dataindsamlingssystem (DAQ), der gør det muligt at læse målingen ind i MATLAB.
- Monter en kadavermus på stereotaksrammen og robotboreopsætningen. Bor manuelt et lille hul (samme størrelse som frøpunkt) ~ 2 mm væk fra, hvor kranievinduet vil blive lavet i siden af kraniet25. Dette hul gør det muligt at glide termoelementet på plads under hvor boring af kranievinduet sker (figur 2D).
BEMÆRK: Kadavermus bruges, fordi boring åbner siden af kraniet er nødvendig for at glide termoelementet over kranievinduesboreområdet. Denne kadavermus er et andet dyr end det, der tidligere blev brugt til Evans Blue-analyse. - Start boreprocessen for hvert af de tre skemaer som gjort tidligere (trin 6). Når boret går gennem kraniet, vil der være pigge i temperaturændring, hvilket indikerer opvarmning, der forekommer nær hjernen.
- Optag og plot resultaterne i MATLAB for at beregne den maksimale temperaturforskel. Dette skal gøres separat for såmaskinen og kantsåningen for at evaluere vandret vs. punkt-for-punkt-såning sammen med den pulserende manuelle boremetode.
10. Statistik
- Udfør statistisk analyse for termoelement- og EB-fluorescerende billeddannelse i R ved hjælp af en Kruskal-Wallis-rangsumtest med Benjamini-Hochberg-korrektion efterfulgt af parvise sammenligninger ved hjælp af Wilcoxons rangsum nøjagtige test25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termisk evaluering
Potentialet for termisk skade blev evalueret ved at måle temperaturændringen fra baseline som følge af boring ved hjælp af horisontale (figur 2A), punkt-for-punkt (figur 2B) og pulserende punkt-for-punkt (figur 2C) metoder. Figur 2D viser den eksperimentelle opsætning til opnåelse af termiske data. En prøvestørrelse på N = 4 kranievinduer blev anvendt til termisk evaluering. Vandret og punkt-for-punkt bruger det samme såskema, men varierer afhængigt af, hvordan kantpunkterne skæres. Pulserende punkt-for-punkt anvender en pulserende metode til både frø- og kantsåningsdele. For den horisontale metode viste såmaskiner en maksimal temperaturændring på 16,66 °C ± 2,08 °C, mens kantsåning viste 9,08 °C ± 0,37 °C. For punkt-for-punkt-metoden viste såmaskiner en maksimal temperaturændring på 18,69 °C ± 1,75 °C, mens kantsåning viste 8,53 °C ± 0,36 °C. For den pulserende punkt-for-punkt-metode viste såmaskiner en maksimal temperaturændring på 6,90 °C ± 1,35 °C, mens kantsåning viste 4,10 °C ± 0,51 °C. Både de vandrette og punkt-for-punkt boreskemaer viser ikke-signifikante forskelle for termiske ændringer. Skift til en pulserende punkt-for-punkt-metode resulterede imidlertid i signifikant mindre opvarmning (p < 0,05) af hjernen end både vandret og punkt-for-punkt boring (figur 2E, F). Varigheden af operationen blev også registreret, da det kan have indflydelse på dyrs overlevelsesevne for levende operationer. For begge automatiserede metoder tog såmaskinen i gennemsnit 360 s. Vandret kantboring tog 300 s, mens punkt-for-punkt kantboring tog 200 s. Den pulserende metode tog længst tid, hvor så- og kantsåning tog ca. 500 s hver. Ikke desto mindre er disse forskelle ikke store nok til at berettige nogen overvejelse, da operationer normalt kan vare over 2-3 timer.
Figur 2: Termisk evaluering. Potentialet for termiske skader blev evalueret baseret på maksimale temperaturændringer i hjernen som følge af boremetoder. (A) Horisontal boring og (B) punkt-for-punkt boring genererede lignende mængder varme, mens (C) en pulseret 2 s tændt, 2 s off punkt-for-punkt metode viste minimal opvarmning. (E) Såmaskine og (F) kantsåning resulterede i signifikant mindre termisk ændring i den pulserende punkt-for-punkt-såmetode (p < 0,05, N = 4 pr. tilstand). (D) Termoelementet placeres under kraniet på musekadaveret, hvor boringen udføres. Data erhverves gennem en DAQ og føres ind i en computer til analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Vaskulær skade
Figur 3 angiver forholdet mellem boreskema og vaskulær skade. Tabel 1 viser p-værdien for hvert boreskema efter statistisk analyse som angivet i trin 10. En prøvestørrelse på N = 4 pr. Gruppe blev anvendt til EB-farveevaluering. Tilstedeværelsen af en højere mængde EB er en direkte indikator for skade på BBB, hvoraf de punkt-for-punkt, vandrette og pulserende boremetoder er signifikant større end kontrolmetoden (alle med p = 0,043; Tabel 1). Punkt-for-punkt-metoden viser ingen signifikant forskel med hensyn til EB-tilstedeværelse sammenlignet med den vandrette boring (p = 0,411). Begge disse ordninger anvendte auto-stop-funktionen for at forhindre boring i hjernen; Imidlertid undlod denne auto-stop-funktion ofte at forhindre skader. Denne fejl i autostop i den delte sådel kunne have forårsaget ukendt overskydende skade, hvilket komplicerer differentieringen mellem teknikkerne. Derfor blev der udført en parvis sammenligning med en pulserende punkt-for-punkt-metode uden automatisk stop for at evaluere de to andre metoder uden at inkorporere auto-stop. Der var ingen signifikant forskel, når pulserende punkt-for-punkt blev sammenlignet med punkt-for-punkt (p = 0,486), mens den pulserende punkt-for-punkt-metode havde signifikant mindre EB-tilstedeværelse end den vandrette metode (p = 0,043). Den manglende betydning mellem pulserende punkt-for-punkt-metoder og punkt-for-punkt-metoder kan tilskrives den store variation i punkt-for-punkt-boring (figur 4).
Figur 3 viser repræsentative billeder af både vandret (figur 3C) og punkt-for-punkt (figur 3D) boring med korrekte autostopfunktioner. Visuelt og gennem EB-fluorescerende billeddannelse blev boring via punkt-for-punkt og vandret skæring set at være skadelig for vaskulaturen i hjernen sammenlignet med kontrolgrupper (figur 3A, B). Den pulserende punkt-for-punkt-metode (figur 3E) havde mindre lokaliseret skade ved frø- og kantpunktet, men havde stadig synlig EB-tilstedeværelse inden for kranievinduet.
Figur 3: Vaskulær skade. EB-fluorescensbilleder af udplantede hjerner (1) og tilsvarende ROI'er (2) anvendes til at bestemme den gennemsnitlige udstråling af det område, der er påvirket af kranial vindueskraniotomi. (A) Musen blev injiceret med EB uden kranievindueskirurgi for at opnå baseline baggrunds-EB-tilstedeværelse i hjernens vaskulatur. (B) Musen blev kun injiceret med saltvand, og der blev udført en kranial vindueskraniotomi. Dette fastslog, at den gennemsnitlige udstråling, der blev målt, blev krediteret EB-akkumuleringen på grund af utætte blodkar og vaskulære traumer nær kranievinduets sted. (C) Musen blev injiceret med EB, og kranievinduet blev skabt ved den vandrette metode til automatisk boring. (D) Musen blev injiceret med EB, og kranievinduet blev skabt ved punkt-for-punkt-metoden med automatisk boring. (E) To repræsentative billeder af kranievinduet produceret med den punkt-for-punkt pulserende metode til boring efter musene (n = 2) blev injiceret med EB. Klik her for at se en større version af denne figur.
Besigtigelse af skader
Visuel inspektion af hjernen viser fysisk skade på hjernens overflade (figur 4). Panelerne A-D demonstrerer EB-tilstedeværelsen af den vandrette boring, panelerne E-H er punkt-for-punkt-metoden, og panelerne I-L er den pulserende punkt-for-punkt-metode. "Point-by-point" udfører lodrette pilothulskæringer, mens "vandret" udfører vandrette snit langs omkredsen af kranievinduet, der skitserer hullet. Det "pulserende punkt-for-punkt" anvender de samme metoder som punkt-for-punkt uden brug af auto-stop-funktionen og afhænger af, at brugeren stopper boringen ved bestemte dybdetrin. Selvom der er fundet en metode, der minimerer mængden af termisk skade på hjernen, er der stadig spørgsmålet om mekanisk skade fra boret. Ideelt set ville en auto-stop-funktion, der registrerer CSF og stopper boringen, før den beskadiger hjernevæv, fungere her, men syntes ikke at fungere konsekvent. Selv med ekstrem forsigtighed i pulserende manuel boring var der stadig visuel skade på hjernen. Dette kan være resultatet af to faktorer: 1) manglen på kontrol og følelse, der følger med håndboring og 2) adskillelsesdybden mellem kraniet og hjernen for et lille dyr som en mus. Håndboring kan tilbyde en mere kontrolleret metode til at komme gennem kraniet uden at skade hjernen med tilstrækkelig øvelse og ekspertise. Der er dog meget højere færdigheder og træning, der er nødvendige sammenlignet med en plug-and-play-robot, hvilket ville give mulighed for flere "kirurger" at bidrage til den samme undersøgelse - ikke en almindelig praksis inden for det intrakortikale mikroelektrodefelt. Hos mus er afstanden mellem hjernen og kraniet ekstremt tynd, så selv den mindste overboring på 10 μm kan føre til mekanisk skade på hjernen.
Figur 4: Besigtigelse af skader. Digitale billeder af alle hjerner erhvervet til visuel inspektion og repræsentation for hver af de tre boremetoder. (A-D) Vandret viste konsekvent skader omkring kranievinduet, hvad enten det var fra mekanisk eller termisk skade. (E-H) Punkt for punkt viste betydelig varians i resultaterne, hvilket indikerer en mindre pålidelig metode til boring. (I-L) Pulserende punkt for punkt var mere konsistent og viste mindre visuel skade end de andre metoder, hvilket matchede forskellene i EB-fluorescerende analyse og termoelementresultater. Vægtstang = 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Horisontal | Punkt | Pulserende | Kontrol | |
| Horisontal | - | 0.411 | 0.043* | 0.043* |
| Punkt | 0.411 | - | 0.486 | 0.043* |
| Pulserende | 0.043* | 0.486 | - | 0.043* |
Tabel 1: Statistisk analyse af EB-fluorescerende billeddannelsesresultater. Resultater fra EB-fluorescerende billeddannelsessystem til forskellige boreteknikker blev analyseret ved hjælp af en Kruskal-Wallis rangsumstest med Benjamin-Hochberg-korrektion efterfulgt af parvise sammenligninger ved hjælp af Wilcoxon rangsum nøjagtig test (N = 4 pr. Gruppe). Væsentlige forskelle mellem grupper er angivet med en stjerne *.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af EB-farvestof og billeddannelse er ligetil, hurtig og nyttig til evaluering af vaskulær skade i hjernen til nye metoder og teknikker. Uanset om du bruger en kirurgisk robot eller bekræfter metoder, der i øjeblikket udføres i laboratoriet, er det vigtigt at validere kirurgiske metoder for at isolere virkningerne af eksperimentelle behandlinger vs. kirurgisk indvirkning og forbedre dyrevelfærden. En termoelementopsætning er også nyttig til evaluering af boremetoder for at sikre, at der ikke sker opvarmning. Temperaturstigninger på grund af knogleboring har været kendt for at forårsage vævsskade, og selv en stigning på 5 °C er nok til at forårsage store vaskulære skader i hjernen 32,33,34,35,36. Det anbefales at bruge de metoder, der er beskrevet her, til at forbedre laboratorie- og kirurgiske teknikker.
Selvom det er nyttigt til evaluering, har termoelementevaluering et par begrænsninger. Termoelementdata erhverves ved hjælp af kadavermus på grund af nødvendigheden af at bore et hul i siden af kraniet for at passe termoelementet ind i hjernen og mulig skade på hjernen som følge heraf. Som følge heraf måles temperaturforskellen på tværs af boring i stedet for dyrets fysiologiske temperatur. Derudover kan der være fysiologiske temperaturreguleringsfunktioner, der ikke er inkluderet i analysen.
Flere trin under protokollen er afgørende for at sikre korrekt boring. For det første vil kraniejustering, hvis det gøres forkert, føre til dårlig borenøjagtighed sammen med skade på hjernen (hvis auto-stop ikke virker). Sørg for, at monteringen af dyret er så lige som muligt før vippekorrektion for at undgå dette problem. Ret eventuelle hældningsforskydninger ved at følge hældningskorrektionsprocessen langsomt og sikkert. I nogle få tilfælde under denne undersøgelse var hældningen slukket, hvilket førte til, at boresystemet troede, at det borede ind i kraniet, selvom boret ikke engang havde kontaktet kraniet. I det store og hele er dette et problem for nøjagtig registrering af kranietykkelse, og hvis det er voldsomt nok, kan det forårsage unøjagtighed i borekoordinaterne. Derudover var auto-stop-funktionen inkonsekvent og skal bruges med omhu. Stol ikke udelukkende på auto-stop-funktionen for at forhindre skade på hjernen. Kontroller altid borehullet for at sikre, at der ikke sker overboring.
Uanset automatisk stop er der et par optimeringer, der kan udføres for punkt-for-punkt og vandrette boremetoder. For at sikre, at der ikke sker tilfældig skade på hjernen, bruger punkt-for-punkt en boreforskydning under kantskæring, men brugeren skal forudbestemme denne indstilling på forhånd gennem test. En lineær interpolationsmetode kunne inkorporeres med det laveste frøpunkt som basis, således at der ved tykkere frø omkring kraniet ikke vil forekomme skader i hjernen. Hvis det er nødvendigt, kan brugeren altid vende tilbage til et tykkere område af kraniet og bore dybere. Det vandrette skæretrin bruger et dybdeskæreinterval (standard på 100 μm) for hver rotation omkring kantpunkterne. Dette kan også bestemmes ud fra kranietykkelsen for at undgå at bore for dybt og beskadige hjernen.
Transgene mus er en kraftfuld eksperimentel model til intravital multifotonbilleddannelse. Mens brugen af en kirurgisk robot til kranievinduer i transgene mus fremhæves i denne undersøgelse, er det vigtigt at bemærke brugen af en kirurgisk robot i andre kranieoperationer. Evnen til at kontrollere og standardisere boring giver fordele for kraniotomier i større dyreforsøg på tværs af marken. Selvom nogle mekaniske skader blev observeret visuelt, skyldes dette sandsynligvis den ekstremt lille adskillelse mellem hjernen og kraniet hos mus. Større dyr, såsom rotter, har mere subaraknoid plads og tykkere dura, hvilket giver mindre risiko for mekanisk skade på grund af robotboring25. I kombination med reduktionen i termiske skader, der er vist ved hjælp af pulseringsmetoden her, har den kirurgiske robot potentiale til betydeligt at reducere skader fra boring på tværs af forskellige dyremodeller.
Samlet set viste den pulserende punkt-for-punkt-metode den mindste mængde skade, hvad enten det var som følge af mindre opvarmning eller mindre mekanisk skade på hjernen. Boring i hånden kan tilbyde en mere kontrolleret metode til at undgå skader, men det er vigtigt at fremhæve fordelene ved en kirurgisk robot. En robot har brug for mindre træning, kan hjælpe med at reducere kirurg-til-kirurg-variation, og når den er optimeret fuldt ud, kan den låne til en mere standardiseret procedure på tværs af laboratorier. Derudover er indlæringskurven for en kirurgisk robot meget lavere end for kirurgi i hånden. Dette reducerer ikke kun den tid, der er nødvendig for at lære teknikken, men reducerer også antallet af dyr, der bruges til træningsformål. Forekomsten af kranial vinduesboring er steget med innovationen af multifotonbilleddannelse gennem hjernen, som det ses i offentliggjorte papirer 20,37. Anvendelse af karakteriserende metoder som termoelementer og EB-farvebilleddannelse vil hjælpe med at optimere boreteknikken, mens brugen af robotter vil gøre vanskelige operationer mere tilgængelige og udbredte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere. Indholdet repræsenterer ikke synspunkterne fra US Department of Veterans Affairs, National Institutes of Health eller den amerikanske regering.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) og GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona) og Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) fra USA Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Derudover blev dette arbejde også delvist støttet af National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) og National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship under bevilling nr. GRANT12635723. Enhver mening, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes (e) og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundation's synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent |
VWR | MRGF-6235 | For Evans Blue dilution |
| Aura Software Type: Tool |
Spectral Instruments Imaging | Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems | |
| Buprenorphine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool |
Stoelting | 58640-1 | |
| Carprofen Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Cefazolin Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Evans Blue Dye Type: Reagent |
Millipore Sigma | E2129 | Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline |
| Isoflurane Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| IVIS Lumina II Type: Tool |
Perkin Elmer | CLS136334 | IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market |
| Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool |
Jenco | 765JF | For Thermocouple setup |
| Ketamine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| LivingImage Type: Tool |
Perkin Elmer | Software for IVIS Lumina III | |
| Marcaine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility | ||
| Neurostar Software Type: Tool |
Stoelting | Comes with surgical robot purchase | |
| Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool |
Kent Scientific | PS-03 | Used to monitor vitals |
| PrismPlus mice Type: Animal |
Jackson Labortory | 031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old | Animals used for the study |
| Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool |
Stoelting | 58640 | Main robotic drill with stereotaxic frame |
| Thermocouple Type: Tool |
TC Direct | 206-557 | For Thermocouple setup |
| USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool |
National Instruments | USB-6008 | For Thermocouple setup |
| Xylazine Type: Drug |
Sourced from Animal Facility |
References
- Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779 (2021).
- Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740 (2021).
- Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15 (2021).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194 (2020).
- Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789 (2019).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
- Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
- Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
- Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
- Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
- Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368 (2021).
- Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
- Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588 (2014).
- Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254 (2017).
- Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007 (2021).
- Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
- Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
- Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
- Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
- Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
- McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).
